Qui, descriviamo un metodo per la rilevazione in tempo reale della produzione di specie reattive dell'ossigeno apoplastico (ROS) nei tessuti di riso nella risposta immunitaria innescata da pattern molecolari associati ai patogeni. Questo metodo è semplice, standardizzato e genera risultati altamente riproducibili in condizioni controllate.
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Articolo metodologico
Rilevamento in tempo reale della produzione di specie reattive dell'ossigeno nella risposta immunitaria nel riso con un saggio di chemiluminescenza
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le specie reattive dell'ossigeno (ROS) svolgono un ruolo vitale in una varietà di processi biologici, tra cui il rilevamento di stress abiotici e biotici. In caso di infezione da patogeni o di sfida con sostanze chimiche associate ai patogeni (modelli molecolari associati ai patogeni [PAMP]), una serie di risposte immunitarie, tra cui un burst di ROS, vengono rapidamente indotte nelle piante, che è chiamata immunità innescata da PAMP (PTI). Un burst ROS è una risposta PTI caratteristica, che è catalizzata da un gruppo di ossidasi NADPH localizzate nella membrana plasmatica, le proteine della famiglia RBOH. La stragrande maggioranza dei ROS comprende perossido di idrogeno (H 2 O2), che può essere facilmente e costantemente rilevato con un metodo di chemiluminescenza a base di luminol. La chemiluminescenza è una reazione che produce fotoni in cui il luminolo, o il suo derivato (come L-012), subisce una reazione redox con ROS sotto l'azione di un catalizzatore. Questo articolo descrive un metodo di chemiluminescenza ottimizzato basato su L-012 per rilevare la produzione di ROS apoplast in tempo reale dopo l'elicitazione di PAMP nei tessuti di riso. Il metodo è facile, costante, standardizzato e altamente riproducibile in condizioni saldamente controllate.
Introduzione
Le specie reattive dell'ossigeno (ROS) comprendono una serie di derivati dell'ossigeno chimicamente attivi, compresi i radicali anionici superossido (O2-) e i suoi derivati, i radicali idrossilici (OH-), il perossido di idrogeno e i prodotti dell'ossigeno singoletto o delle reazioni di ossido-riduzione, che sono costantemente prodotti in plastidi e cloroplasti, mitocondri, perossisomi e altre sedi subcellulari1 . I ROS svolgono un ruolo importante in molti processi biologici e sono essenziali per tutte le piante 2,3,4. L'ampio spettro delle funzioni dei ROS varia dalla regolazione della crescita e dello sviluppo alla percezione degli stress abiotici e biotici 5,6,7,8.
Nel sistema immunitario delle piante, i recettori localizzati nella membrana plasmatica delle cellule vegetali - i cosiddetti recettori di riconoscimento dei pattern (PRR) - percepiscono i modelli molecolari associati ai patogeni (PAMP) delle sostanze chimiche derivate dai patogeni. Questo riconoscimento innesca una serie di risposte immunitarie veloci, tra cui afflusso di calcio, ROS burst e cascata MAPK; quindi, questo strato di immunità è chiamato immunità innescata da PAMP (PTI). Il burst ROS è una risposta PTI distintiva, la cui determinazione è ampiamente applicata agli studi relativi a PTI 9,10. La produzione di ROS innescata dai PAMP è attribuita alla NADPH ossidasi residente nella membrana plasmatica, o proteine della famiglia dell'omologo dell'esplosione respiratoria ossidasi (RBOH), che trasferiscono elettroni dal NADPH citosolico o NADH all'ossigeno extracellulare per produrre superossido (O 2-) che viene convertito spontaneamente in perossido di idrogeno (H 2 O 2) dalla superossido dismutasi8 . Lo scoppio di ROS innescato da PAMP è abbastanza rapido, appare solo pochi minuti dopo il trattamento PAMP e raggiunge il picco a ~ 10-12 minuti. La stragrande maggioranza delle molecole di ROS comprende perossido di idrogeno (H 2 O2), che può essere facilmente e costantemente rilevato con un saggio di chemiluminescenza.
Nella chemiluminescenza, il reagente chemiluminescenza reagisce con l'ossigeno attivo, sotto l'azione di un catalizzatore, per produrre gli intermedi di stato eccitato. Quindi, gli elettroni nel prodotto ritornano allo stato fondamentale attraverso la transizione non radiativa ed emettono fotoni. I reagenti comuni a chemiluminescenza includono luminol e L-012, con luminolo che domina l'applicazione11,12,13. Tuttavia, sempre più ricercatori scelgono L-012 per rilevare la produzione di ROS, poiché L-012 ha un'efficienza di emissione luminosa molto più elevata in condizioni di pH neutro o quasi neutro rispetto al luminolo.
Questo articolo descrive un metodo di chemiluminescenza ottimizzato, basato su L-012, per la rilevazione in tempo reale della produzione di ROS dopo l'elicitazione di PAMP nei dischi e nella guaina dei tessuti di riso (Oryza sativa). Il metodo qui fornito è semplice, stabile e standardizzato ed è altamente adattabile per soddisfare diverse esigenze sperimentali. I dati ottenuti con questo metodo sono altamente riproducibili in condizioni saldamente controllate.
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Protocollo
NOTA: Il protocollo è applicabile a diversi tessuti vegetali. Guaina di riso e dischi di foglie sono stati utilizzati in questo protocollo per il rilevamento ROS dopo l'elicitazione PAMP. Poiché le differenze sorgono principalmente a causa del metodo di campionamento, solo le procedure comuni sono descritte di seguito, con misure specifiche menzionate ove necessario.
1. Coltura vegetale
- Sterilizzare i semi di riso decorticati con etanolo al 70% per 1 minuto, quindi con ipoclorito di sodio al 40% (NaClO) per 1 ora. Quindi, sciacquare i semi 5 volte con acqua sterile per rimuovere il cloro residuo.
- Placcare i semi in modo asettico su 1/2 MS di terreno (2,37 g/L Murashige e Skoog (MS) mezzo, 30 g/L di saccarosio, 2,1 g/L di fitagel, pH 5,7, in autoclave).
- Nel metodo della guaina di riso, placcare direttamente i semi nel recipiente di vetro sterile con mezzo MS.
- Nel metodo del disco fogliare, placcare i semi su piastre MS per 5-7 giorni e trapiantarli nella matrice di crescita o nel terreno (Figura 1A).
- Coltiva le piantine in una stanza di crescita con un fotoperiodo di 12 ore di luce / 12 ore di buio.
2. Preparazione e pretrattamento dei tessuti
- Guaina di riso
- Tagliare la guaina delle piantine di riso di 10 giorni in segmenti di 3 mm con una lama affilata o una lama chirurgica per il pretrattamento 1 giorno prima del test ROS (Figura 1B).
- Collocare cinque segmenti di guaina in un singolo pozzetto di una piastra di microtitolazione a 96 pozzetti contenente 100μL di ddH 2 O per 10-12 ore, al buio a 25 °C, che consente di ridurre la perdita di ioni correlata alle lesioni della ferita e le risposte di difesa (Figura 2).
NOTA: Fare attenzione a mantenere i tagli verticali per garantire una superficie di taglio uniforme esposta alla soluzione di elicitazione è un passo importante per ottenere risultati altamente riproducibili. Spostate delicatamente i segmenti. Non effettuare ulteriori tagli o ferite sui segmenti, che potrebbero essere una fonte di variazione dei dati. In linea di principio, ogni test deve contenere almeno cinque repliche poiché la variazione del valore ROS è grande. Maggiore è il numero di repliche impostate, più affidabili sono i dati.
- Disco foglia
- Tagliare i dischi fogliari (4 mm di diametro) dalle piante di riso di 4-6 settimane usando un punzone bioptico con uno stantuffo. Tagliare sempre i dischi foglia dal terzo centrale della seconda foglia (numerata dall'alto) della fresatrice principale per ridurre la variazione dei dati (Figura 1C).
- Posizionare un disco fogliare in un pozzetto individuale di una piastra di microtitolazione a 96 pozzetti contenente 100μL di ddH 2 O per 10-12 ore per il pretrattamento, che consente di ridurre le risposte legate alle ferite in quanto potrebbero interferire con l'induzione di ROS da parte dei PAMP (Figura 2).
NOTA: azionare delicatamente i dischi fogliari. Non eseguire ulteriori tagli o ferite sui dischi nell'esperimento, che potrebbero causare variazioni dei dati. L'induzione di ROS avviene principalmente dalle cellule del bordo tagliato, poiché le superfici dei tessuti di riso (foglie o guaine), sono ricoperte da strati idrofobici. Solo le celle dei bordi tagliati sono in contatto con la soluzione di elicitazione (fare riferimento alla sezione discussione). - Mantenere tutti i dischi fogliari galleggianti, con la superficie abassiale rivolta verso l'alto, nei pozzetti di una piastra di microtitolazione per il pretrattamento dell'acqua per evitare variazioni associate al lato fogliare.
Figura 1: Le condizioni di crescita e le fasi delle piantine di riso per il campionamento della guaina e parti della guaina di riso e delle foglie di riso utilizzate nel test. (A) Le piantine di riso coltivate su mezzo 1/2 MS in condizioni sterili per 10 giorni possono essere campionate per il test ROS. I semi di riso sterilizzati sono stati coltivati su mezzo 1/2 MS e coltivati in un fotoperiodo di 12 ore di luce / 12 ore di buio in fiala di vetro trasparente, 8,5 cm di diametro e 15 cm di altezza. (B) Schema delle parti di campionamento delle guaine fogliari. Le guaine fogliari sono state tagliate da piantine di riso di 10 giorni. Le posizioni delle guaine fogliari erano sopra le radici e sotto la prima foglia. (C) Schema della posizione di campionamento dei dischi fogliari. I dischi fogliari possono essere tagliati dal terzo medio della seconda foglia (contare dall'alto) del timone principale delle piante di riso sane in qualsiasi fase di crescita. Abbreviazioni: ROS = specie reattive dell'ossigeno; MS = Murashige e Skoog. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Schema della configurazione della piastra per misurare la produzione di ROS con diverse linee di Oryza sativa. Pretrattamento e test dei tessuti di riso utilizzando una piastra a 96 pozzetti. Linea 1, Linea 2 e Linea 3 (fino a otto linee su un piatto) possono essere qualsiasi materiale di interesse, diverse cultivar, mutanti o linee transgeniche. I tessuti sono stati stimolati con soluzioni di elicitazione con PAMP (PAMP, bianco) o senza PAMP (ddH2O, grigio) per misurare la risposta ROS. Va notato che più sono i campioni da testare, più lungo è l'intervallo di tempo tra le letture. Abbreviazioni: ROS = specie reattive dell'ossigeno; PAMP = pattern molecolare associato ai patogeni; ddH2O = acqua bidistillata. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
3. Preparazione della soluzione di elicitazione
- Sciogliere la polvere di L-012 in 20 mM (6,23 mg/ml) di soluzione acquosa con ddH2O per ottenere la soluzione madre. Quindi, diluire la soluzione madre con tampone Tris HCl da 50 mM (pH 7,5) per ottenere la soluzione di lavoro alla concentrazione finale di 500 μM L-012. Conservare la soluzione madre congelata e diluire alla soluzione di lavoro prima dell'uso.
- Preparare la soluzione di elicitazione contenente PAMP, L-012 e perossidasi di rafano (HRP; 10 mg/ml in ddH2O). Per una soluzione di elicitazione da 10 ml, miscelare 9,4 mL di soluzione di Tris HCl (pH 7,5) da 50 mM, 400 μL di soluzione di L-012, 100 μL di HRP e 100 μL di flg22 (PAMP; 10 mM in ddH2O). Per il controllo negativo, aggiungere 100 μL di ddH2O invece di PAMP.
NOTA: Conservare le soluzioni di elicitazione preparate a temperatura ambiente per evitare stress da freddo ai tessuti di riso. Altri PAMP possono anche essere utilizzati per il trattamento come richiesto, come la chitina (20 ng / ml in concentrazione finale). Poiché L-012 è sensibile alla luce, coprire tutti i tubi contenenti la soluzione di L-012 con un foglio di alluminio.
4. Avvio del software e impostazione del protocollo con il lettore di micropiastre di riferimento (vedere Tabella dei materiali)
NOTA: L'impostazione dei parametri del software del lettore di micropiastre richiede del tempo. Si consiglia di preparare la macchina e il protocollo (un clic per procedere) prima di aggiungere la soluzione di elicitazione.
- Avviare il software. Fare clic sul pulsante Esperimenti per creare un nuovo protocollo o utilizzare un protocollo esistente.
- Fare clic su Procedura nel popup per impostare la piastra. Selezionare i pozzetti dalla piastra da monitorare.
- Fare clic su Start Kinetic per impostare il tempo di esecuzione totale e l'intervallo di lettura. Impostare il tempo di esecuzione su 35 minuti o più, a seconda dei requisiti sperimentali. Per ottenere letture il più frequentemente possibile, selezionare Intervallo minimo. Per il tempo di integrazione, scegliere 1 s o più, a seconda dell'intensità del segnale.
NOTA: l'intervallo di lettura dipende dal numero di campioni e dalla durata dell'integrazione del segnale. - Fai clic su Convalida | OK per confermare le impostazioni.
- Fare clic su Rileva la nuova piastra nel pop-up e attendere che il software richieda la finestra di dialogo della piastra di carico. Posizionare la piastra da testare sul supporto.
- Fermati qui per aspettare che venga stabilito il sistema di elicitazione (nella prossima sezione). Non appena il sistema di elicitazione è pronto, clicca su Esegui per avviare la lettura.
5. Stabilire il sistema di elicitazione e misurare la produzione di ROS in tempo reale
- Rimuovere con cautela il ddH2O dai pozzetti contenenti i tessuti pretrattati, evitando danni tissutali o disseccamenti.
- Utilizzare una pipetta multicanale per aggiungere 200 μL della soluzione di elicitazione ai pozzetti contenenti i tessuti.
- Agitare delicatamente per mescolare. Fare clic su Esegui per avviare il rilevamento.
NOTA: Con il trattamento PAMP, i tessuti vegetali rispondono e producono ROS molto rapidamente. Pertanto, si suggerisce di trattare prima il controllo negativo senza PAMP per ridurre il tempo di funzionamento, quando ci sono più trattamenti. Operare il più rapidamente possibile per ridurre il ritardo di elicitazione tra i trattamenti. Più breve è il tempo tra l'aggiunta della soluzione di elicitazione e l'inizio del rilevamento, migliore sarà l'acquisizione di importanti dati sperimentali.
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Risultati
Qui, prendiamo il materiale di riso come esempio per determinare il ROS prodotto con il trattamento flg22. La generazione di ROS dopo l'elicitazione è transitoria. Nel riso, l'aumento della produzione di ROS è stato rilevato per la prima volta in 1-2 minuti, ha raggiunto il picco a 10-12 minuti ed è tornato alla linea di base in ~ 30-35 minuti (Figura 3). Rispetto al test di controllo, in cui il PAMP era assente nella soluzione di elicitazione con conseguente assenza di induzione evidente di...
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Discussione
Lo scopo di questo studio era quello di stabilire un metodo altamente efficiente per quantificare la produzione precoce di ROS in risposta al PAMP nei tessuti di riso. Questo metodo fornisce una procedura standardizzata per la determinazione in tempo reale dei ROS apoplast prodotti da tessuti di riso trattati. Questo metodo è semplice nel funzionamento, a basso costo, chiaro nella composizione e indipendente dai kit commerciali. Utilizzando questo metodo, i ricercatori possono studiare la produzione in tempo reale di ROS...
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni della Shanghai Natural Science Foundation (numero di sovvenzione: 21ZR1429300 / BS1500016), Shanghai Jiao Tong University (programma Agri-X, numero di sovvenzione: AF1500088/002), Shanghai Collaborative Innovation Center of Agri-Seeds (numero di sovvenzione: ZXWH2150201 / 001) a Jiangbo Fan, e dal progetto di collaborazione medico-ingegneristica della Shanghai Jiao Tong Univesity (numero di sovvenzione: 21X010301734) a Can Li.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Piastra per microtitolazione a 96 pozzetti | WHB | WHB-96-01 | |
| Etanolo assoluto | Innochem | A43543 | |
| flg22 | Sangon Biotech | p20973 | PAMP |
| Gen5 | BioTek | software | |
| L-012 | FUJIFILM | 120-04891 | 8-ammino-5-cloro-7-fenil-2,3-diidropirido [3,4-d] piridazina-1,4-dione, CAS #:143556-24-5 |
| Lettore di micropiastre | BioTek | Synergy 2 | |
| MS Medium | Solarbio | M8521 | |
| NaCLO | Aladdin | S101636 | |
| Perossidasi da rafano (HRP) | Sigma | P8375 | |
| Phytagel | Sigma | P8169 | |
| Campionatore | Miltex | 15110-40 | |
| Saccarosio | Sangon Biotech | A502792 | |
| Tris | Sangon Biotech | A610195 |
Riferimenti
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Ristampe e permessi
