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Articolo metodologico

Ex Vivo Espansione e manipolazione genetica di cellule staminali ematopoietiche di topo in colture a base di alcol polivinilico

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⸱

DOI:

10.3791/64791

⸱

10 febbraio 2023

 ,  , 
1MRC Weatherall Institute of Molecular Medicine, University of Oxford

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Presentato qui è un protocollo per avviare, mantenere e analizzare colture di cellule staminali ematopoietiche di topo utilizzando l'espansione ex vivo a base di alcol polivinilico, nonché metodi per manipolarle geneticamente mediante trasduzione lentivirale ed elettroporazione.

Abstract

Le cellule staminali ematopoietiche multipotenti (HSC) autorinnovanti sono un tipo di cellula importante grazie alla loro capacità di sostenere l'ematopoiesi per tutta la vita e ricostituire l'intero sistema sanguigno dopo il trapianto. Le HSC sono utilizzate clinicamente nelle terapie di trapianto di cellule staminali, che rappresentano un trattamento curativo per una serie di malattie del sangue. C'è un notevole interesse sia nella comprensione dei meccanismi che regolano l'attività delle HSC e l'emopoiesi, sia nello sviluppo di nuove terapie basate sulle HSC. Tuttavia, la coltura stabile e l'espansione delle HSC ex vivo è stata una barriera importante nello studio di queste cellule staminali in un sistema ex vivo trattabile. Recentemente abbiamo sviluppato un sistema di coltura a base di alcol polivinilico in grado di supportare l'espansione a lungo termine e su larga scala delle HSC di topo trapiantabili e dei metodi per modificarle geneticamente. Questo protocollo descrive i metodi per coltivare e manipolare geneticamente le HSC del topo tramite elettroporazione e trasduzione lentivirale. Questo protocollo dovrebbe essere utile a una vasta gamma di ematologi sperimentali interessati alla biologia delle HSC e all'emopoiesi.

Introduzione

Il sistema ematopoietico supporta una serie di processi essenziali nei mammiferi, dall'apporto di ossigeno alla lotta contro gli agenti patogeni, attraverso tipi specializzati di cellule del sangue e immunitarie. La produzione continua di sangue (emopoiesi) è necessaria per sostenere l'omeostasi del sistema sanguigno, che è sostenuta dalle cellule staminali e progenitrici ematopoietiche (HSPC)1. La cellula ematopoietica più primitiva è la cellula staminale ematopoietica (HSC), che ha capacità uniche di auto-rinnovamento e differenziazione multilineare 2,3. Questa è una popolazione di cellule rare, che si trova principalmente nel midollo osseo adulto4, dove si verificano ad una frequenza di circa una ogni 30.000 cellule. Si ritiene che le HSC supportino l'ematopoiesi per tutta la vita e contribuiscano a ristabilire l'ematopoiesi dopo stress ematologico. Queste capacità consentono inoltre alle HSC di ricostituire stabilmente l'intero sistema ematopoietico dopo il trapianto in un ricevente irradiato5. Questo rappresenta la definizione funzionale di una HSC e costituisce anche la base scientifica per la terapia di trapianto di HSC, un trattamento curativo per una serie di malattie del sangue e immunitarie6. Per questi motivi, le HSC sono un obiettivo importante dell'ematologia sperimentale.

Nonostante un grande focus di ricerca, è rimasto difficile espandere stabilmente le HSC ex vivo7. Recentemente abbiamo sviluppato il primo sistema di coltura di espansione ex vivo a lungo termine per HSC di topo8. L'approccio può espandere le HSC trapiantabili di 234-899 volte in una coltura di 4 settimane. Rispetto agli approcci alternativi, il principale cambiamento nel protocollo è stata la rimozione dell'albumina sierica e la sua sostituzione con un polimero sintetico. L'alcol polivinilico (PVA) è stato identificato come un polimero ottimale per le colture HSC di topo8, che ora è stato utilizzato anche per la coltura di altri tipi di cellule ematopoietiche9. Tuttavia, è stato recentemente identificato anche un altro polimero chiamato Soluplus (un copolimero di innesto di polivinil-caprolattame-acetato-polietilenglicole), che sembra migliorare l'espansione clonale HSC10. Prima dell'uso dei polimeri, venivano utilizzate albumina sierica sotto forma di siero bovino fetale, frazione di albumina sierica bovina V o albumina sierica ricombinante, ma questi avevano un supporto limitato per l'espansione HSC e supportavano solo colture ex vivo a breve termine (~ 1 settimana)7. Tuttavia, va notato che i protocolli di coltura HSC che mantengono le HSC in uno stato quiescente possono supportare un tempo di coltura ex vivo più lungo11,12.

Rispetto ad altri metodi di coltura, uno dei principali vantaggi delle colture basate su PVA è il numero di cellule che possono essere generate e il periodo di tempo in cui il protocollo può essere utilizzato per tracciare le HSC ex vivo. Questo supera diverse barriere nel campo dell'ematologia sperimentale, come il basso numero di HSC isolabili per topo (solo poche migliaia) e la difficoltà di tracciare le HSC nel tempo in vivo. Tuttavia, è importante ricordare che queste colture stimolano la proliferazione delle HSC, mentre il pool di HSC in vivo è prevalentemente quiescente allo stato stazionario13. Inoltre, sebbene le colture siano selettive per le HSC, ulteriori tipi di cellule si accumulano con le colture nel tempo e le HSC trapiantabili rappresentano solo circa una su 34 cellule dopo 1 mese. Le cellule progenitrici ematopoietiche mieloidi sembrano essere il principale tipo di cellula contaminante in queste colture di HSC8. Tuttavia, possiamo usare queste colture per arricchire per HSC da popolazioni cellulari eterogenee (ad esempio, c-Kit+ midollo osseo HSPCs14). Supporta anche la trasduzione o l'elettroporazione delle HSC per la manipolazione genetica14,15,16. Per aiutare a identificare le HSC dalla popolazione eterogenea di HSPC, CD201 (EPCR) è stato recentemente identificato come un utile marcatore HSC ex vivo 10,17,18, con HSC trapiantabili limitate alla frazione CD201+CD150+c-Kit+Sca1+Lineage-.

Questo protocollo descrive i metodi per avviare, mantenere e valutare colture di espansione HSC di topo basate su PVA, nonché protocolli per la manipolazione genetica all'interno di queste colture utilizzando l'elettroporazione o la trasduzione del vettore lentivirale. Questi metodi dovrebbero essere utili per una serie di ematologi sperimentali.

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Protocollo

Tutte le procedure sugli animali, compreso l'allevamento e l'eutanasia, devono essere eseguite all'interno di linee guida istituzionali e nazionali. Gli esperimenti descritti di seguito sono stati approvati dal Ministero degli Interni del Regno Unito. Vedere la tabella dei materiali per un elenco di tutti i materiali, i reagenti e le apparecchiature utilizzate in questo protocollo.

1. Preparazione delle soluzioni stock

  1. Soluzione stock PVA
    1. Prelevare 50 ml di acqua di qualità per colture tissutali in una piccola bottiglia di vetro (adatta per l'autoclave). Riscaldare l'acqua fino quasi all'ebollizione in un forno a microonde.
    2. Pesare 5 g di polvere di PVA e aggiungere all'acqua.
      NOTA: Si consiglia di sciogliere solo 1-5 g di PVA. Lo scioglimento di quantità maggiori può comportare una ricostituzione incompleta.
    3. Chiudere bene il coperchio e agitare per mescolare. Quindi, allentare il coperchio.
      NOTA: Prestare attenzione quando si riapre, poiché la pressione potrebbe cambiare a causa del cambiamento della temperatura dell'acqua.
    4. Autoclave e lasciare raffreddare. Chiudere bene il coperchio e agitare per mescolare. Preparare aliquote in provette sterili e conservare fino a 3 mesi a 4 °C.
  2. Sciogliere le citochine liofilizzate in terreno F-12 contenente 1 mg/mL di PVA. Ricostituire il fattore delle cellule staminali a 10 μg/mL e la trombopoietina a 100 μg/mL per generare 1:1.000 stock. Preparare aliquote in provette sterili e conservare a lungo termine a -80 °C. In alternativa, conservare le aliquote a 4 °C per un massimo di 1 settimana.
    NOTA: Evitare la ricostituzione di citochine nell'albumina sierica bovina a causa dell'impatto negativo sull'espansione delle HSC del topo.

2. Estrazione del midollo osseo HSC e arricchimento c-Kit+

  1. Sezionare i femori, le tibie, il bacino e la colonna vertebrale da topi C57BL / 6 di 8-12 settimane appena eutanizzati (tramite asfissia CO2 e / o lussazione cervicale) e posizionare le ossa in PBS sul ghiaccio.
    NOTA: Assicurarsi che le superfici e gli strumenti siano sterilizzati con etanolo al 70%.
  2. Pulire le ossa usando salviette delicate prive di lanugine, rimuovendo muscoli e midollo spinale e aggiungere a un mortaio con ~ 3 ml di PBS.
    NOTA: Assicurarsi che il pestello e il mortaio siano sterilizzati con etanolo al 70% e quindi lavati una volta con PBS.
  3. Schiacciare le ossa con il pestello senza macinare per ridurre al minimo le forze di taglio. Rompere i grandi frammenti di midollo osseo rilasciati nel PBS utilizzando un ago da 19 G collegato a una siringa da 5 ml. Trasferire la sospensione cellulare attraverso un filtro da 70 μm in un tubo conico da 50 ml.
  4. Una volta trasferita la sospensione, ripetere con PBS fresco fino a quando le ossa sono sbiancate e non è visibile il midollo. Punta a un volume finale di ~ 30 ml per mouse e ~ 50 ml per due mouse.
  5. Mescolare le cellule del midollo osseo, raccogliere 10 μL di cellule e contare usando la soluzione di Türks ad una diluizione di 1:10-1:20 con un emocitometro.
    NOTA: Si prevede che un topo produca 2-5 × 108 cellule intere del midollo osseo.
  6. Centrifugare a 450 × g per 5 minuti a 4 °C, scartare il surnatante e risospendere il pellet in PBS freddo (350 μL per un topo o 500 μL per due topi).
  7. Aggiungere 0,2 μL di anticorpo anti-c-Kit alloficocianina (APC) per 10 milioni di cellule e incubare per 30 minuti al buio a 4 °C.
  8. Aggiungere 5 ml di PBS freddo alle cellule incubate per lavare via l'anticorpo in eccesso e filtrare attraverso un filtro da 50 μm in un tubo conico fresco da 15 ml.
  9. Lavare il tubo originale con 7 ml di PBS freddo e trasferire attraverso il filtro. Se si verifica l'intasamento del filtro, grattare la superficie del filtro con una punta P1000.
  10. Centrifugare a 450 × g per 5 minuti a 4 °C, eliminare il surnatante e risospendere il pellet in PBS freddo (350 μL per un topo o 500 μL per due topi).
  11. Aggiungere 0,2 μL di microsfere anti-APC per 10 milioni di cellule e incubare per 15 minuti al buio a 4 °C. Aggiungere 12 ml di PBS sterile per lavare via le microsfere in eccesso.
  12. Centrifugare le cellule a 450 × g per 5 minuti a 4 °C e risospendere in 2 ml di PBS freddo. Mentre le celle ruotano in questo passaggio, procedere al passaggio 2.13.
  13. Preparare l'arricchimento della colonna posizionando una colonna di filtrazione magnetica nel magnete di un separatore di colonne magnetiche, con un filtro da 50 μm sulla parte superiore e un tubo conico da 15 ml sotto.
  14. Far passare 3 mL di PBS sterile attraverso il filtro da 50 μm e la colonna di filtrazione. Una volta che il PBS è passato, passare la sospensione cellulare attraverso la colonna, seguita da tre lavaggi di 3 ml di PBS freddo ogni volta. Per ogni lavaggio, attendere che la colonna smetta di gocciolare prima di aggiungere il lavaggio successivo.
  15. Rimuovere la colonna dal magnete e posizionarla sopra un tubo fresco da 15 ml. Aggiungere 5 ml di PBS freddo, montare lo stantuffo della colonna sulla colonna ed eluire le celle spingendo lo stantuffo.
  16. Mescolare le cellule arricchite con c-Kit, raccogliere 10 μL di cellule e contare usando la soluzione di Türks ad una diluizione di 1:2 con un emocitometro. La resa tipica di un topo è di 2-5 × 106 celle c-Kit+ .
    NOTA: A questo punto, le cellule possono essere seminate direttamente in terreni HSC o preparate per la purificazione della selezione cellulare attivata dalla fluorescenza (FACS) HSC.

3. Avvio di colture cellulari con HSPC arricchiti con c-Kit

  1. Preparare il terreno fresco (Tabella 1) per il numero di celle/pozzetti necessari. Seme 0,5-1 milione di cellule per mL per HSPC arricchiti con c-Kit.
  2. Ruotare verso il basso le celle arricchite con c-Kit e risospenderle nel mezzo HSC alla densità cellulare desiderata.
  3. Trasferire le cellule su piastre rivestite di fibronectina o caricate superficialmente negativa, a 200 μL per piastra a 96 pozzetti o 1 ml per piastra a 24 pozzetti.
  4. Collocare le cellule in un incubatore per colture tissutali impostato a 37 °C e al 5% di CO2.

4. Iniziare colture cellulari con HSC purificate FACS

  1. Preparare un volume appropriato della colorazione anticorpale della linea biotinilata: 3 μL di master mix (Tabella 2) per 10 milioni di cellule, diluito 1:100 in PBS.
  2. Ruotare le cellule arricchite con c-Kit e risospendere la colorazione anticorpale di lignaggio per 30 minuti a 4 °C.
  3. Lavare con 10 mL di PBS sterile e centrifugare a 450 × g per 5 minuti a 4 °C.
  4. Preparare un volume appropriato della colorazione anticorpale HSC fresca (Tabella 3): 300 μL per 10 milioni di cellule. Oltre a questa colorazione del campione, preparare campioni di controllo della colorazione appropriati per la compensazione e il gating.
    NOTA: Lavorare in una cappa di coltura tissutale con la luce spenta quando si utilizzano anticorpi coniugati con colorante.
  5. Risospendere le cellule nella colorazione anticorpale HSC e incubare a 4 °C per 90 minuti. Mescolare le celle ogni 20-30 minuti picchiettando per evitare la pellettizzazione cellulare.
  6. Lavare con 10 mL di PBS sterile e centrifugare a 450 × g per 5 minuti a 4 °C.
  7. Aspirare il surnatante, far scorrere il pellet per interrompere e risospendere in PBS sterile con 0,5 μg/mL di ioduro di propidio (PI).
  8. Preparare il terreno fresco (Tabella 1) per il numero di pozzetti necessari e placcare in fibronectina o piastre caricate superficialmente negative (200 μL per piastra a 96 pozzetti o 1 ml per piastra da 24 pozzetti).
  9. Preparare la macchina FACS per lo smistamento e ordinare CD150+CD34-c-Kit+Sca1+Lineage- HSC direttamente in pozzi contenenti supporti (vedere la Figura 1 per la strategia di gating FACS standard utilizzata qui). Ordina fino a 200 celle per pozzetto a 96 pozzetti o fino a 1.000 celle per pozzetto a 24 pozzetti.
    NOTA: le macchine FACS devono essere gestite da uno scienziato qualificato. Si consiglia agli utenti di contattare la struttura FACS locale per discutere di questa strategia di selezione se non hanno esperienza nell'isolamento FACS delle HSC del topo.

5. Esecuzione delle modifiche ai supporti

  1. Per le colture cellulari iniziate da cellule arricchite con c-Kit, iniziare i cambi di terreno dopo 2 giorni. Per le colture cellulari iniziate da HSC isolate da FACS, iniziare i cambiamenti dei terreni dopo 5 giorni.
  2. Preparare un mezzo HSC fresco preriscaldato (~37 °C) sufficiente (Tabella 1) per tutti i pozzetti.
  3. Rimuovere delicatamente la piastra dall'incubatore di coltura tissutale.
    NOTA: Poiché le HSPC su piastre caricate superficialmente negative sono più facilmente disturbate di quelle su fibronectina, è necessario prestare particolare attenzione quando si cambia il mezzo su piastre caricate superficialmente negative per evitare di disturbare le colture cellulari.
  4. Utilizzando una pipetta o una pompa per vuoto, rimuovere lentamente ~ 90% -95% del mezzo dal menisco del pozzo.
    NOTA: Evitare di disegnare il mezzo dalla base del pozzetto, altrimenti molte cellule verranno rimosse.
  5. Aggiungere 200 μL (per piastre da 96 pozzetti; 1 ml per piastre da 24 pozzetti) di terreno fresco nel pozzetto.
  6. Restituire la piastra all'incubatore di coltura tissutale.
  7. Ripetere i passaggi 5.1-5.6 ogni 2-3 giorni fino al punto finale sperimentale.
  8. Per le colture cellulari iniziate con HSPC arricchiti con c-Kit (sezione 3), dividere le colture in un rapporto di 1:2-1:3 dopo ~3 settimane. Per le colture cellulari iniziate con HSC purificate FACS (sezione 4), dividere le colture in un rapporto di 1:2-1:3 dopo ~3 settimane e quando le colture sono >90% confluenti.
    NOTA: La tempistica esatta dipenderà dagli interessi sperimentali. Queste colture sono state caratterizzate per 4-8 settimane8, ma potrebbero essere possibili ulteriori lunghezze di coltura.

6. HSPC in coltura elettroporigante

NOTA: Questo protocollo è per l'elettroporazione della ribonucleoproteina Cas9/sgRNA (RNP), ma potrebbe essere adattato per l'elettroporazione di mRNA o altre proteine ricombinanti. Avviare colture con un numero sufficiente di cellule per eseguire questo nel momento sperimentale desiderato.

  1. Effettuare un cambio di mezzo 1 giorno prima dell'elettroporazione, come descritto nel paragrafo 5.
    NOTA: Si raccomanda almeno una coltura durante la notte prima dell'elettroporazione. Tuttavia, le cellule sono tipicamente coltivate per 1-3 settimane prima della trasduzione.
  2. Il giorno dell'elettroporazione, impostare il nucleofector. Accendere la macchina. Sul touchscreen, selezionare il modulo X e quindi la dimensione della cuvetta utilizzata.
  3. Preparare una soluzione P3 sufficiente (secondo le istruzioni del produttore) per la scala dell'elettroporazione (100 μL per cuvetta o 20 μL per microcuvetta) e lasciare equilibrare a temperatura ambiente.
  4. Preparare un terreno fresco sufficiente (Tabella 1) per il numero di pozzetti placcati e aggiungere 500 μL di terreno per un pozzetto a piastre da 24 pozzetti o 100 μL di terreno in un pozzetto a 96 pozzetti.
  5. Scongelare lo sgRNA (prediluito a 2 μg/ml in acqua priva di RNasi) sul ghiaccio e mescolare 16 μg di sgRNA con 30 μg di enzima Cas9 (a 10 μg/ml) in una provetta PCR sterile. Includere un tubo PCR supplementare contenente solo la proteina Cas9 come controllo. Mescolare facendo scorrere il tubo, quindi ruotare brevemente verso il basso. Incubare a 25 °C per 10 minuti in un termociclatore per complessare l'RNP, quindi mantenere i tubi sul ghiaccio.
    NOTA: Questo può essere ridotto di cinque volte se si esegue l'elettroporazione in microcuvette.
  6. Mescolare e trasferire gli HSPC per l'elettroporazione in un tubo; raccogliere 10 μL di cellule e contare utilizzando la soluzione di Türks ad una diluizione di 1:2 con un emocitometro.
    NOTA: Si raccomanda di elettropolare 1-5 milioni di cellule per cuvetta da 100 μL (ridotta di cinque volte per la microcuvetta).
  7. Centrifugare il numero appropriato di celle in una provetta da 1,5 mL a 450 × g per 5 minuti a 4 °C. Aspirare il più possibile il surnatante e risospendere con 100 μL di tampone di nucleofezione.
  8. Trasferire immediatamente la sospensione cellulare nel tubo PCR contenente l'RNP complessato e la pipetta su e giù lentamente per miscelare delicatamente e trasferire in una cuvetta di elettroporazione da 100 μL. Espellere la miscela nella cuvetta lentamente e con un movimento fluido per evitare la formazione di bolle d'aria nella cuvetta.
  9. Sull'elettroporatore, selezionare la posizione dei pozzetti da elettroporare. Utilizzando il touchscreen, selezionare il tipo di cella programma CD34+, umano, o digitare il codice di impulso EO100. Premere il pulsante OK .
  10. Trasferire le cuvette all'elettroporatore. Premere il pulsante Start sul touchscreen per avviare l'elettroporazione. Subito dopo l'elettroporazione, aggiungere 500 μL del terreno di coltura alla cuvetta (100 μL se si utilizza una microcuvetta).
  11. Trasferire delicatamente le cellule sulla piastra preparata e tornare all'incubatore di coltura tissutale.
  12. Per le procedure che utilizzano un modello di donatore AAV6, aggiungere il vettore immediatamente dopo che le cellule sono state trasferite su una piastra rivestita di fibronectina ad una concentrazione di 5.000 vettori / cellula.
  13. Dopo 6-18 ore, preparare il terreno fresco ed eseguire un cambio di mezzo come descritto nella sezione 5. Per questa modifica del mezzo, rimuovere solo l'80% -90% del supporto.
    NOTA: Evitare di disegnare il mezzo dalla base del pozzo.
  14. Analizzare le cellule mediante citometria a flusso dopo 2 o più giorni (vedere paragrafo 8 per i dettagli).
  15. Continuare a eseguire modifiche medie ogni 2 giorni, come descritto nella sezione 5, fino al raggiungimento del punto finale sperimentale.
    NOTA: I tassi di editing di CRISPR / Cas9 utilizzando questo metodo dipendono fortemente dall'efficienza di targeting dello sgRNA progettato. Tassi di editing fino al 95% sono stati osservati con una guida efficiente15. Le linee guida per la progettazione di sgRNA sono state precedentemente dettagliate altrove19,20.

7. Trasduzione di HSPC in coltura con vettore lentivirale

NOTA: Avviare colture con un numero sufficiente di cellule, per eseguire questa operazione nel punto temporale sperimentale desiderato.

  1. Generare e titolare il vettore lentivirale (a seconda degli obiettivi sperimentali). Vettore lentivirale di scongelamento sul ghiaccio.
  2. Eseguire una modifica media (come nella sezione 5); quindi, mescolare e trasferire gli HSPC per la trasduzione in un tubo. Raccogliere 10 μL delle cellule e contare usando la soluzione di Türks ad una diluizione di 1:2 con un emocitometro.
    NOTA: Le cellule possono essere trasdotte immediatamente dopo la placcatura. Tuttavia, le cellule sono tipicamente coltivate per 1-3 settimane prima della trasduzione.
  3. Riplaccare la dose necessaria di cellule per la trasduzione (tipicamente 100.000 cellule per piastra a 96 pozzetti). Separatamente, piastre celle di controllo negativo non trasdotte.
    NOTA: Se si utilizzano piastre caricate in superficie negativa, trasferire le cellule in piastre rivestite di fibronectina per la trasduzione del vettore lentivirale.
  4. Aggiungi vettore lentivirale a ciascun pozzetto di cellule: aggiungi 20 unità di trasduzione per cellula per ottenere ~ 30% di efficienza di trasduzione. Tuttavia, determinare empiricamente la dose del vettore lentivirale, a seconda dei requisiti sperimentali.
    NOTA: Assicurarsi che il vettore lentivirale sia smaltito secondo le linee guida istituzionali.
  5. Restituire le cellule all'incubatore di coltura tissutale per 6 ore. Successivamente, eseguire una modifica media come descritto nella sezione 5.
    NOTA: il surnatante contiene virus vivi. Smaltire secondo le linee guida istituzionali.
  6. Analizzare le cellule mediante citometria a flusso (ad esempio, per l'espressione di GFP) dopo 2 giorni o più. Vedere la sezione 8 per i dettagli.
  7. Continuare a eseguire modifiche medie ogni 2 giorni, come descritto nella sezione 5, fino al raggiungimento del punto finale sperimentale.

8. Analisi citometrica a flusso di colture HSPC

  1. Preparare una miscela concentrata di anticorpi HSC ex vivo in PBS contenente il 2% di FBS (Tabella 4). Conservare la miscela a 4 °C al buio per un massimo di 1 mese.
    NOTA: Lavorare in una cappa di coltura tissutale con le luci spente quando si utilizzano anticorpi coniugati con colorante.
  2. Aggiungere 2 μL di miscela di anticorpi concentrati a 50 μL di cellule. Incubare per 30 minuti a 4 °C al buio. Oltre a questa colorazione del campione, preparare campioni di controllo della colorazione appropriati per la compensazione e il gating.
  3. Aggiungere 200-1.000 μL di PBS contenente il 2% di FBS e centrifugare a 450 × g per 5 minuti a 4 °C. Rimuovere il più possibile il surnatante e risospendere in 100-500 μL di PBS contenente il 2% di FBS e 0,5 μg/mL di PI.
  4. Impostare il citometro a flusso e registrare almeno 10.000 cellule vive per campione.
    NOTA: I citometri a flusso devono essere utilizzati da uno scienziato qualificato. Gli utenti devono contattare la propria struttura FACS locale per discutere questa analisi se non hanno esperienza nella citometria a flusso.
  5. Esportare i dati in formato FCS e analizzarli utilizzando un apposito software di analisi della citometria a flusso. Vedere la Figura 2 per la strategia di gating standard utilizzata qui.

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Risultati

Per la purificazione FACS delle HSC, ci aspettiamo che all'interno del midollo osseo arricchito con c-Kit, ~ 0,2% delle cellule siano la popolazione CD150 + CD34-c-Kit + Sca1 + Lineage- per topi C57BL / 6 giovani (8-12 settimane) (Figura 1). Tuttavia, è probabile che topi transgenici o topi di età diverse mostrino frequenze HSC diverse. Dopo 4 settimane di coltura, ci aspettiamo che la frazione CD201+CD150+c-Kit+Sca...

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Discussione

Speriamo che questo protocollo fornisca un approccio utile per indagare la biologia delle HSC, l'ematopoiesi e l'ematologia più in generale. Dopo lo sviluppo iniziale del metodo di coltura basato su PVA per le HSC purificate FACS8, il metodo è stato esteso. Ad esempio, il metodo ha dimostrato di funzionare con c-Kit arricchito con midollo osseo e con piastre caricate superficialmente negative14. La sua compatibilità con la trasduzione e l'elettroporazione è stata dimostrata...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno conflitti di interesse.

Ringraziamenti

Ringraziamo il WIMM Flow Cytometry Core per l'accesso alla citometria a flusso e il WIMM Virus Screening Core per la generazione di vettori lentivirali. Questo lavoro è stato finanziato dal Kay Kendall Leukaemia Fund e dal Medical Research Council del Regno Unito.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Equipment
Kit di dissezioneFisher Scientific12764416
EmocitometroAppleton Woods LtdHC002
P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X KitLonza V4XP-3024
Pestello e mortaioForniture di laboratorio scientifico LimitatoX18000
Separatore QuadroMACSMiltenyi Biotec130-090-976
Materiali
5 mL siringaVWR International Ltd720-2519
Ago da 19 GVWR International Ltd613-5394
50 μ filtro cellulare mSysmex04-004-2317
70 μ filtro per cellule MCorning431751
salviette KimtechVWR International Ltd115-2075
LS colonna MACSMiltenyi Biotec130-042-401
Reagents
Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3, 100 μ gIDT 
Fattore di cellule staminali di topo ricombinanti senza animali PeprotechAF-250-03
Trombopoietina di topo ricombinante senza animaliPeprotechAF-315-14
Anti-topo CD117 APC (clone: 2B8)ThermoFisher17-1171-83
Anti-topo CD117 BV421 (clone: 2B8)Biolegend105828
Anti-topo CD127  APC/Cy7 (clone: A7R34)Biolegend135040
Anti-mouse CD127 biotina (clone: A7R34)Biolegend135006
Anti-mouse CD150 PE/Cy7 (clone: TC15-12F12.2)Biolegend115914
Anti-mouse CD201  APC (clone: eBio1560)ThermoFisher17-2012-82
Anti-topo CD34 FITC (clone: RAM34)ThermoFisher11-0341-85
Anti-topo CD4  APC/Cy7 (clone: RM4-5)Biolegend100526
Biotina CD4 anti-topo (clone: RM4-5)Biolegend100508
Anti-mouse CD45R  APC/Cy7 (clone: RA3-6B2)Biolegend103224
Biotina CD45R anti-topo (clone: RA3-6B2)Biolegend103204
Anti-mouse CD48 BV421 (clone: HM48-1)Biolegend103428
Biotina CD8 anti-topo (clone: 53-6.7)Biolegend100704
Anti-mouse CD8a  APC/Cy7 (clone: 53-6.7)Biolegend100714
Anti-topo Ly6G/Ly6C  APC/Cy7 (clone: RB6-8C5)Biolegend108424
Biotina anti-topo Ly6G/Ly6C (clone: RB6-8C5)Biolegend108404
Anti-mouse Sca1 PE (clone: D7)Biolegend108108
Anti-mouse Ter119  APC/Cy7 (clone: TER-119)Biolegend116223
Biotina Ter119 anti-topo (clone: TER-119)Biolegend116204
Piastre CellBIND, piastre CellBIND a 24 pozzettiCorning3337con carica superficiale negativa
96 pozzetti Corning3330
sgRNA sintetico personalizzato con carica superficiale negativaSynthego, Sigma Aldrich, IDTOrdine
Siero fetale bovinoMerck Life Science UK LimitedF7524-50ML
Piastre rivestite di fibronectina, 96 pozzettiBD Biosciences354409
Ham's F-12 Nutrient MixGibco11765054
Insulin-Transferrin-Selenium-X (100x)Gibco51500.056
Soluzione salina tamponata con fosfatoAlfa AesarJ61196.
Alcool polivinilicoSigma AldrichP8136
Ioduro di propidioEnzo Life Sciences (UK) LtdEXB-0018
Streptavidina APC/Cy7Biolegend405208
Tü RKS' soluzioneSigma Aldrich109277
VirkonMettler-Toledo Ltd95015662
1081058, personalizzatoAP

Riferimenti

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