Articolo metodologico

Studiare la metilazione dell'arginina proteica: approcci e metodi

DOI:

10.3791/64821

⸱

20 gennaio 2023

1Pharmacology and Toxicology and Structural Genomics Consortium, University of Toronto

In questo articolo

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ARTICOLI DISCUSSI:

Hutchinson, A., Seitova, A. Produzione di proteine PRMT ricombinanti utilizzando il sistema di vettori di espressione del Baculovirus. Giornale degli esperimenti visualizzati. (173), DOI: 10.3791/62510 (2021).

Maniaci, M., Marini, F., Massignani, E., Bonaldi, T. Un approccio proteomico basato sulla spettrometria di massa per l'analisi globale e ad alta confidenza della R-metilazione delle proteine. Giornale degli esperimenti visualizzati. (182), DOI: 10.3791/62409 (2022).

Habisch, H., Zhang, F., Zhou, Q., Madl, T. Esplorazione del metiloma dell'arginina mediante spettroscopia di risonanza magnetica nucleare. Giornale degli esperimenti visualizzati. (178), DOI: 10.3791/63245 (2021).

Szewczyk, M. M., Vu, V., Barsyte-Lovejoy, D. Metodi quantitativi per studiare l'attività della proteina arginina metiltransferasi 1-9 nelle cellule. Giornale degli esperimenti visualizzati. (174), DOI: 10.3791/62418 (2021).

Poulard, C., Jacquemetton, J., Valantin, J., Treilleux, I., Le Romancer, M. Il saggio di legatura di prossimità consente il rilevamento, la localizzazione e la quantificazione della metilazione dell'arginina proteica nei tessuti fissati. Giornale degli esperimenti visualizzati. (185), DOI: 10.3791/64294 (2022).

Editoriale

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La metilazione dell'arginina proteica è una modificazione post-traduzionale coinvolta nella regolazione di un ampio spettro di processi biologici 1,2,3. I nove membri della famiglia delle proteine arginina metiltransferasi (PRMT) possono metilare le arginine in modo monometilico e dimetilmetrico o asimmetrico. La comprensione delle conseguenze funzionali e la catalogazione dei substrati metilati dei PRMT hanno notevolmente migliorato la comprensione degli enzimi PRMT e facilitato il loro legame con la malattia2. Inoltre, lo sviluppo di inibitori potenti e selettivi ha consentito approcci basati sulla biologia chimica per studiare i PRMT e ha accelerato lo sviluppo clinico degli agenti mirati al PRMT3. Con il progredire del campo dei PRMT, i nuovi metodi e le loro applicazioni consentiranno ulteriormente di chiarire la regolazione e la biologia di questi enzimi.

In questa raccolta di metodi, un articolo sulla produzione ricombinante delle proteine PRMT fornisce un resoconto dettagliato di un sistema di espressione basato su baculovirus4. Diversi PRMT possono essere generati utilizzando l'espressione batterica; tuttavia, PRMT dipendenti più grandi o complessi come PRMT7 o PRMT5 richiedono un sistema di espressione delle cellule di insetto. Questo metodo ha già beneficiato di numerosi sforzi in vitro per determinare i substrati dei PRMT.

Lo studio dei substrati PRMT nell'ambiente cellulare richiede approcci di rilevamento sofisticati. Due articoli di questa raccolta presentano metodologie distinte che si basano sull'arricchimento di anticorpi di arginine metilate seguito dalla quantificazione con spettrometria di massa o dalla quantificazione indipendente dagli anticorpi mediante risonanza magnetica nucleare (NMR). Sono stati sviluppati diversi anticorpi che riconoscono stati di metilazione distinti e sono stati utilizzati in studi che identificano i substrati PRMT5. Il metodo della spettrometria di massa consente la valutazione quantitativa della metilazione dell'arginina delle proteine cellulari impiegando la marcatura metabolica, successive sofisticate tecniche di separazione e l'arricchimento basato su anticorpi6. Diversi membri della famiglia PRMT preferiscono le arginine metilanti che si trovano in motivi ripetitivi di RGG che risiedono nelle regioni intrinsecamente disordinate delle proteine7. Il metodo basato sulla spettroscopia NMR consente di determinare lo stato di metilazione e la posizione di tutti i derivati dell'arginina (mono e di, simmetrici e asimmetrici) dove possono essere quantificati in modo affidabile all'interno di campioni biologici complessi8.

Infine, per identificare i residui di arginina metilata in proteine specifiche, due articoli forniscono approcci basati sul western blotting e sul saggio di ligazione di prossimità (PLA). Entrambi questi metodi utilizzano il rilevamento basato sugli anticorpi, ma differiscono nel metodo di rilevamento e nelle informazioni fornite. Il metodo western blot è quantitativo ed è stato prezioso nella caratterizzazione di sonde chimiche9. Il PLA fornisce informazioni sulla posizione spaziale dell'arginina metilata poiché utilizza l'anticorpo della proteina bersaglio e l'anticorpo generico per la mono o di-metil arginina, eludendo così la necessità di generare anticorpi specifici e può essere notevolmente utilizzato su tessuti fissati10.

Insieme, queste diverse metodologie consentiranno una solida scoperta di arginine metilate in vari sistemi cellulari e stati patologici e faranno progredire ulteriormente la conoscenza fondamentale della funzione biologica degli enzimi PRMT.

Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

D.B.L. è supportato dal Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC). Il Consorzio per la Genomica Strutturale è un ente di beneficenza registrato (n. 1097737) che riceve fondi da Bayer AG, Boehringer Ingelheim, Bristol Myers Squibb, Genentech, Genome Canada attraverso l'Ontario Genomics Institute [OGI-196], EU/EFPIA/OICR/McGill/KTH/Diamond Innovative Medicines Initiative 2 Joint Undertaking [EUbOPEN grant 875510], Janssen, Merck KGaA (alias EMD in Canada e negli Stati Uniti), Pfizer e Takeda.

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bedford, M. T., Clarke, S. G. Protein arginine methylation in mammals: who, what, and why. Molecular Cell. 33 (1), 1-13 (2009).
  2. Blanc, R. S., Richard, S. Arginine methylation: The coming of age. Molecular Cell. 65 (1), 8-24 (2017).
  3. Wu, Q., Schapira, M., Arrowsmith, C. H., Barsyte-Lovejoy, D. Protein arginine methylation: from enigmatic functions to therapeutic targeting. Nature Reviews. Drug Discovery. 20 (7), 509-530 (2021).
  4. Hutchinson, A., Seitova, A. Production of recombinant PRMT proteins using the baculovirus expression vector system. Journal of Visualized Experiments. (173), e62510(2021).
  5. Dhar, S., et al. Loss of the major Type I arginine methyltransferase PRMT1 causes substrate scavenging by other PRMTs. Scientific Reports. 3, 1311(2013).
  6. Maniaci, M., Marini, F., Massignani, E., Bonaldi, T. A mass spectrometry-based proteomics approach for global and high-confidence protein R-methylation analysis. Journal of Visualized Experiments. (182), e62409(2022).
  7. Thandapani, P., O'Connor, T. R., Bailey, T. L., Richard, S. Defining the RGG/RG motif. Molecular Cell. 50 (5), 613-623 (2013).
  8. Habisch, H., Zhang, F., Zhou, Q., Madl, T. Exploring the arginine methylome by nuclear magnetic resonance spectroscopy. Journal of Visualized Experiments. (178), e63245(2021).
  9. Szewczyk, M. M., Vu, V., Barsyte-Lovejoy, D. Quantitative methods to study protein arginine methyltransferase 1-9 activity in cells. Journal of Visualized Experiments. (174), e62418(2021).
  10. Poulard, C., Jacquemetton, J., Valantin, J., Treilleux, I., Le Romancer, M. Proximity ligation assay allows the detection, localization, and quantification of protein arginine methylation in fixed tissue. Journal of Visualized Experiments. (185), e64294(2022).

Ristampe e permessi

Richiedi il permesso di riutilizzare il testo o le figure di questo articolo JoVE

Richiedi permesso

Tag

Recombinant PRMT ProteinsBaculovirus Expression VectorMass SpectrometryProteomics ApproachProtein R methylation AnalysisArginine MethylomeNuclear Magnetic Resonance SpectroscopyProtein Arginine Methyltransferase ActivityProximity Ligation AssayProtein DetectionTissue Quantification

Articoli correlati