Articolo metodologico

Modalità di contatto Microscopia a forza atomica come tecnica rapida per l'osservazione morfologica e l'analisi del danno cellulare batterico

DOI:

10.3791/64823

⸱

30 giugno 2023

 ,  ,  ,  , 
1Centro Universitario de los Lagos, Universidad de Guadalajara, 2Centro Nacional de Recursos Genéticos, Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias

In questo articolo

Sommario

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Qui, presentiamo l'applicazione della microscopia a forza atomica (AFM) come metodo semplice e veloce per la caratterizzazione batterica e analizziamo dettagli come la dimensione e la forma batterica, i biofilm di coltura batterica e l'attività delle nanoparticelle come battericidi.

Abstract

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La microscopia elettronica è uno degli strumenti necessari per caratterizzare le strutture cellulari. Tuttavia, la procedura è complicata e costosa a causa della preparazione del campione per l'osservazione. La microscopia a forza atomica (AFM) è una tecnica di caratterizzazione molto utile grazie alla sua alta risoluzione in tre dimensioni e all'assenza di qualsiasi requisito per il vuoto e la conduttività del campione. AFM può visualizzare un'ampia varietà di campioni con diverse topografie e diversi tipi di materiali.

AFM fornisce informazioni topografiche 3D ad alta risoluzione dal livello di angstrom alla scala dei micron. A differenza della microscopia tradizionale, AFM utilizza una sonda per generare un'immagine della topografia superficiale di un campione. In questo protocollo, l'uso di questo tipo di microscopia è suggerito per la caratterizzazione morfologica e del danno cellulare di batteri fissati su un supporto. Sono stati utilizzati ceppi di Staphylococcus aureus (ATCC 25923), Escherichia coli (ATCC 25922) e Pseudomonas hunanensis (isolati da campioni di bulbo d'aglio). In questo lavoro, le cellule batteriche sono state coltivate in specifici terreni di coltura. Per osservare il danno cellulare, Staphylococcus aureus ed Escherichia coli sono stati incubati con diverse concentrazioni di nanoparticelle (NP).

Una goccia di sospensione batterica è stata fissata su un supporto di vetro e le immagini sono state scattate con AFM a diverse scale. Le immagini ottenute hanno mostrato le caratteristiche morfologiche dei batteri. Inoltre, utilizzando l'AFM, è stato possibile osservare il danno alla struttura cellulare causato dall'effetto delle NP. Sulla base delle immagini ottenute, l'AFM a contatto può essere utilizzato per caratterizzare la morfologia delle cellule batteriche fissate su un supporto. L'AFM è anche uno strumento adatto per lo studio degli effetti delle NP sui batteri. Rispetto alla microscopia elettronica, l'AFM è una tecnica economica e facile da usare.

Introduzione

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Diverse forme batteriche sono state notate per la prima volta da Antony van Leeuwenhoek nel 17 ° secolo1. I batteri sono esistiti in una grande diversità di forme fin dai tempi antichi, che vanno dalle sfere alle cellule ramificate2. La forma cellulare è una condizione fondamentale per i tassonomisti batterici per descrivere e classificare ogni specie batterica, principalmente per la separazione morfologica dei phyla gram-positivi e gram-negativi3. Diversi elementi sono noti per determinare le forme cellulari batteriche, che sono tutti coinvolti nelle coperture cellulari e nel supporto come componenti della parete cellulare e della membrana, nonché nel citoscheletro. In questo modo, gli scienziati stanno ancora chiarendo i meccanismi e i processi chimici, biochimici e fisici implicati nella determinazione delle forme cellulari batteriche, che sono tutti definiti da gruppi di geni che definiscono le forme batteriche 2,4.

Inoltre, gli scienziati hanno dimostrato che la forma dell'asta è probabilmente la forma ancestrale delle cellule batteriche, poiché questa forma cellulare appare ottimale nei parametri significativi delle cellule. Pertanto, cocchi, spirale, vibrione, filamentoso e altre forme sono considerati adattamenti a vari ambienti; Infatti, particolari morfologie si sono evolute indipendentemente più volte, suggerendo che le forme dei batteri potrebbero essere adattamenti a particolari ambienti 3,5. Tuttavia, durante tutto il ciclo di vita delle cellule batteriche, la forma della cellula cambia, e questo si verifica anche come risposta genetica a condizioni ambientali dannose3. La forma e le dimensioni delle cellule batteriche determinano fortemente la rigidità, la robustezza e il rapporto superficie-volume dei batteri, e questa caratteristica può essere sfruttata per processi biotecnologici6.

La microscopia elettronica viene utilizzata per studiare campioni biologici a causa dell'elevato ingrandimento che può essere raggiunto oltre i microscopi basati sulla luce. La microscopia elettronica a trasmissione (TEM) e la microscopia elettronica a scansione (SEM) sono le tecniche più comunemente utilizzate per questo scopo; Tuttavia, i campioni richiedono alcuni trattamenti prima di essere inseriti nella camera del microscopio al fine di ottenere immagini appropriate. È necessaria una copertina dorata sui campioni e il tempo utilizzato per l'acquisizione totale dell'immagine non dovrebbe essere troppo lungo. Al contrario, la microscopia a forza atomica (AFM) è una tecnica ampiamente utilizzata nell'analisi delle superfici, ma è anche impiegata nello studio di campioni biologici.

Esistono diversi tipi di modalità AFM utilizzate nell'analisi delle superfici, come la modalità di contatto, la modalità senza contatto o la maschiatura, la microscopia a forza magnetica (MFM), l'AFM conduttivo, la microscopia a forza piezoelettrica (PFM), la maschiatura della forza di picco (PFT), la risonanza di contatto e il volume della forza. Ogni modalità viene utilizzata nell'analisi dei materiali e fornisce informazioni diverse sulla superficie dei materiali e sulle loro proprietà meccaniche e fisiche. Tuttavia, alcune modalità AFM sono utilizzate per l'analisi di campioni biologici in vitro, come PFT, perché PFT consente di ottenere dati topografici e meccanici su cellule in un mezzo liquido7.

In questo lavoro, abbiamo utilizzato la modalità più semplice inclusa in ogni vecchio e semplice modello AFM: la modalità di contatto. AFM utilizza una sonda affilata (circa <50 nm di diametro) per scansionare aree inferiori a 100 μm. La sonda è allineata al campione per interagire con i campi di forza associati al campione. La superficie viene scansionata con la sonda per mantenere costante la forza. Quindi, viene generata un'immagine della superficie monitorando il movimento del cantilever mentre si muove sulla superficie. Le informazioni raccolte forniscono le proprietà nano-meccaniche della superficie, come l'adesione, l'elasticità, la viscosità e il taglio.

Nella modalità di contatto AFM, il cantilever viene scansionato attraverso il campione con una deflessione fissa. Ciò consente di determinare l'altezza dei campioni (Z), e questo rappresenta un vantaggio rispetto alle altre tecniche di microscopio elettronico. Il software AFM consente la generazione di una scansione di immagini 3D mediante l'interazione tra la punta e la superficie del campione e la deflessione della punta è correlata all'altezza del campione attraverso un laser e un rivelatore.

In modalità statica (modalità contatto) con forza costante, l'uscita presenta due immagini diverse: l'altezza (topografia z) e il segnale di deflessione o errore. La modalità statica è una modalità di imaging preziosa e semplice, in particolare per campioni robusti in aria in grado di gestire gli elevati carichi e le forze torsionali esercitate dalla modalità statica. La modalità di deflessione o errore viene azionata in modalità forza costante. Tuttavia, l'immagine topografica viene ulteriormente migliorata aggiungendo il segnale di deflessione alla struttura della superficie. In questa modalità, il segnale di deflessione viene anche definito segnale di errore poiché la deflessione è il parametro di feedback; Qualsiasi caratteristica o morfologia che appare in questo canale è dovuta all'"errore" nel ciclo di feedback o, meglio, al ciclo di feedback richiesto per mantenere un setpoint di deflessione costante.

Il design unico di AFM lo rende compatto - abbastanza piccolo da stare su un tavolo - pur avendo una risoluzione abbastanza alta per risolvere i passaggi atomici. L'apparecchiatura AFM ha un costo inferiore rispetto alle apparecchiature per altri microscopi elettronici e i costi di manutenzione sono minimi. Il microscopio non richiede un laboratorio con condizioni particolari come una camera bianca o uno spazio isolato; Ha solo bisogno di una scrivania priva di vibrazioni. Per l'AFM, i campioni non devono essere sottoposti a una preparazione elaborata come per altre tecniche (copertura dorata, dimagrimento); Solo un campione secco deve essere attaccato al portacampioni.

Utilizziamo la modalità di contatto AFM per osservare le morfologie batteriche e gli effetti delle NP. Si può osservare la popolazione e la morfologia cellulare dei batteri fissati su un supporto, così come il danno cellulare prodotto dalle nanoparticelle sulle specie batteriche. Le immagini ottenute dalla modalità di contatto AFM confermano che si tratta di uno strumento potente e non limitato da reagenti e procedure complicate, rendendolo un metodo semplice, veloce ed economico per la caratterizzazione batterica.

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Protocollo

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1. Isolamento batterico e identificazione

  1. Isolamento di un ceppo endofitico dai meristemi del bulbo d'aglio:
    1. Posizionare frammenti di meristemi di 2 mm provenienti da bulbi d'aglio precedentemente sbucciati, disinfettati e tagliati su agar di soia tripticasi (TSA) come mezzo di crescita ricco e incubare a 25 °C per 1 giorno.
    2. Sulla base delle differenze morfologiche delle colonie batteriche - forma, dimensione, colore, bordo, luce trasmessa, luce riflessa, consistenza, consistenza e produzione di pigmento - descrivere i diversi morfotipi osservati e purificare striando una colonia rappresentativa di ciascun morfotipo.
    3. Conservare tutti i ceppi batterici purificati in glicerolo al 30% a -80 °C.
    4. Identificare un ceppo selezionato casualmente (9AP) sequenziando il rDNA 16S. Estrarre il DNA seguendo il metodo di Hoffman e Winston8.
    5. Amplificare l'rRNA 16S mediante reazione a catena della polimerasi (PCR) con 100 ng di DNA, 1x tampone polimerasi, 4 mM MgCl2, 0,4 mM dNTPs, 10 pmol ciascuno di oligonucleotidi universali 27F/1492r e 1 U di DNA polimerasi9. Utilizzare le seguenti condizioni di termociclatore: 95 °C per 5 min per la denaturalizzazione iniziale; seguiti da 35 cicli di 1 min a 94 °C come temperatura di denaturalizzazione, 1 min a 56 °C come temperatura di ibridazione e 1 min a 72 °C come temperatura di estensione; e poi 10 minuti a 72 °C come estensione finale.
    6. Sequenziare capillarmente il prodotto della PCR utilizzando gli stessi oligonucleotidi; Utilizzare il metodo dideossi-terminale con il kit di installazione a matrice per il sequenziamento capillare10 ed eseguire l'elettroforesi in un sistema multicapillare automatizzato11.
    7. Modificare manualmente le sequenze, confrontare la sequenza con la libreria GenBank utilizzando una ricerca BLAST e identificare provvisoriamente il ceppo con il gold standard di almeno il 98,7% di identità con la specie più vicina12,13.
      NOTA: Il ceppo 9AP è stato identificato come appartenente alla specie di Pseudomonas hunanensis, con un'identità del 99,86% con la sequenza per il ceppo P. hunanensis LV (JX545210).

2. Preparazione del campione batterico per l'osservazione morfologica mediante AFM

  1. In condizioni sterili, posizionare una goccia della sospensione batterica (Pseudomonas hunanensis, Staphylococcus aureus) su un vetrino.
  2. Fissare i campioni sul vetrino riscaldando a secco. Passare il vetrino delicatamente su una fiamma più volte fino a quando il campione è asciutto.
    NOTA: La fissazione dei campioni è una tecnica di routine in microbiologia per osservare organismi procarioti fissi e per simulare la loro struttura come cellule viventi il più fedelmente possibile.
  3. Posizionare i campioni fissi in una capsula di Petri e portarli all'apparecchiatura AFM per l'osservazione.
    NOTA: Poiché i campioni possono essere alterati dalle condizioni meteorologiche nel tempo, riservare un tempo massimo di 24 ore per l'analisi nell'apparecchiatura AFM. Mantenere i campioni liberi da polvere.

3. Effetto antibatterico delle nanoparticelle di MgO contro i batteri

NOTA: La sintesi e la caratterizzazione delle NP di MgO sono state pubblicate in precedenza14. In questo lavoro, l'attività antibatterica dei nanomateriali è stata stimata sulla base del manuale del Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) utilizzando metodi di macrodiluizione e microdiluizione per l'inibizione15,16.

  1. Stima dell'attività inibitoria minima (MIC) e dei battericidi (CMB)
    1. Precrescita dei ceppi
      1. Inoculare una quantità appropriata di Escherichia coli o Staphylococcus aureus in brodo nutriente per ottenere una concentrazione finale di 1 × 108 CFU/ml.
      2. Incubare la sospensione a 37 °C (± 2 °C) per 18-24 ore.
    2. Postcrescita di ceppi acclimatati
      1. Immergere un anello batteriologico sterile nella sospensione, toccando il fondo del tubo.
      2. Eseguire striature con il cappio su agar eosina e blu di metilene e agar nutriente.
      3. Incubare le piastre di agar a 37 °C (± 2 °C) per 24 ore.
    3. Selezione delle colonie per la preparazione dell'inoculo standardizzato
      1. Prendi da tre a cinque colonie con lo stesso tipo morfologico toccando la parte superiore della colonia nella capsula di Petri con un anello batteriologico.
      2. Trasferire e immergere la selezione in 3-5 ml di brodo Müller-Hinton.
      3. Incubare a 37 °C (± 2 °C) per ottenere una torbidità di 1 × 10 8 CFU/mL o 2 × 108 CFU/mL.
        NOTA: In questo lavoro, gli standard di torbidità di McFarland sono stati utilizzati come riferimento per le sospensioni batteriologiche; in particolare, lo standard 0,5 corrisponde approssimativamente a una sospensione omogenea di E. coli di 1,5 × 108 cellule/ml. Uno spettrofotometro UV-Vis è stato utilizzato per misurare la torbidità.
      4. Prendi 1 ml e aggiungilo a 9 ml di brodo sterile. Prelevare 200 μL di questa diluizione e aggiungerla a 19,8 mL di brodo sterile per ottenere una concentrazione finale di 5 × 105 CFU/ml.
    4. Concentrazioni richieste di nanoparticelle di MgO
      1. Utilizzare un ultrasuoni per la preparazione delle soluzioni.
      2. Sospendere il nanomateriale in acqua sterile al doppio della concentrazione necessaria per ottenere soluzioni seriali.
      3. Aggiungere queste sospensioni a tubi sterili contenenti brodo Müller-Hinton per ottenere la nuova gamma di concentrazioni richieste per l'esperimento.
        NOTA: Per la microdiluizione sono state applicate le seguenti concentrazioni di NP di MgO: 30 ppm, 60 ppm, 120 ppm, 250 ppm, 500 ppm, 1.000 ppm, 2.000 ppm, 3.000 ppm, 4.000 ppm e 8.000 ppm.
    5. Preparazione della microdiluizione15
      1. Preparare una nuova e sterile micropiastra da 96 pozzetti (micropiastra). Etichetta colonna n. 12 della micropiastra come colonna di sterilità; etichettare la colonna n. 11 come colonna di controllo della crescita.
      2. Aggiungere 120 μL delle sospensioni di nanoparticelle con le diverse concentrazioni alle colonne n. 1-10.
      3. Inoculare 120 μL di batteri (5 × 105 CFU/ml) nei pozzetti nelle colonne n. 1-10.
        NOTA: Per questo studio, la riga G e la riga H erano controlli con ceftriaxone alle concentrazioni suggerite dagli standard CLSI: 8 ppm, 4 ppm, 2 ppm, 1 ppm, 0,5 ppm, 0,25 ppm, 0,125 ppm, 0,06 ppm e 0,03 ppm.
      4. Incubare la micropiastra a 96 pozzetti per 24 ore a 37 °C (35 °C ± 2 °C). Infine, analizza i pozzi.
  2. Osservazione dei cambiamenti morfo-strutturali indotti da nanoparticelle di MgO nei ceppi batterici mediante AFM
    1. Prelevare 250 μL dai pozzetti delle prove di microdiluizione, mescolare con 750 μL di acqua sterile e centrifugare a 2.000 × g da 2 min a 5 min a 5 °C.
    2. Lavare i precipitati tre volte con 1 ml di acqua sterile ogni volta e, alla fine dei lavaggi, aggiungere 500 μL di acqua.
    3. Per ottenere le immagini AFM, prelevare 10-20 μL della sospensione finale di ciascun pozzetto di partenza, eseguire uno striscio su un vetrino precedentemente pulito dagli ultrasuoni (30 min) e asciugare a temperatura ambiente per 1 ora.

4. Misurazioni AFM

NOTA: Qui, il microscopio a forza atomica in modalità contatto è stato montato su una postazione di lavoro antivibrante che ha permesso l'isolamento del microscopio da qualsiasi fonte vibrazionale meccanica e ha mantenuto il sistema livellato. Le interferenze elettriche sono ridotte con i filtri di linea e la protezione da sovratensioni. L'AFM utilizzato qui allinea automaticamente il raggio laser al fotorivelatore.

  1. Accendere il computer e l'AFM, quindi selezionare la modalità Contatto, le sonde contAI-G e le opzioni di Pendenza automatica negli strumenti software. I valori predefiniti del controller Z sono Setpoint = 20 nM, P-Gain = 10.000, I-Gain = 1.000, D-Gain = 0 e Tensione di punta = 0 mV.
  2. Posizionare i campioni nella modalità di contatto AFM utilizzando una testina di scansione da 70 μm. Abbiamo utilizzato cantilever in silicio ContAI-G con una costante di molla di 0,13 N/m.
  3. Utilizzare un dispositivo fotocamera montato su due obiettivi integrati nella testina di scansione per ottenere una rapida visione della superficie dell'area sotto la sonda.
  4. Eseguire manualmente uno spostamento nel piano XY per scegliere l'area desiderata. La sonda è fatta per avvicinarsi elettronicamente al campione di superficie fino al raggiungimento delle condizioni di contatto. Regolare elettronicamente il piano di misura XY dello scanner e la superficie del campione riducendo le pendenze nelle direzioni XY.
  5. Utilizzare i parametri standard del software: 1 linea al secondo a 256 punti per linea.
  6. Innanzitutto, eseguire un intervallo di scansione completo di un'area di 70 μm x 70 μm; Quindi, selezionate un'area più piccola utilizzando lo strumento zoom. L'AFM ottimizza automaticamente l'intervallo del grafico in Z.
    NOTA: diminuendo le linee al secondo, il tempo di scansione totale aumenta, la qualità della scansione è più definita e viene eliminato anche il rumore della misurazione.
  7. Per selezionare una nuova area dal campione, ritrarre elettronicamente il cantilever e spostare il campione lungo il piano XY. Eseguire una nuova scansione utilizzando la procedura descritta nei passaggi 4.5 e 4.6.
    NOTA: le scansioni ottenute sono mostrate in una scala a barre monocolore, in cui i colori chiari sono associati ad altitudini più elevate e i colori scuri sono associati ad altitudini più profonde. Il software AFM genera una vista 3D della scansione che consente di apprezzare i dettagli della superficie misurata.
  8. Eseguire l'elaborazione dei dati utilizzando il livellamento riga per riga nel menu Strumenti dell'immagine nella selezione del filtro, che è il metodo di livellamento più utilizzato e più semplice.
    NOTA: Questo metodo di livellamento prende ogni linea orizzontale o verticale prodotta nell'immagine AFM e la adatta a un'equazione polinomiale.
  9. Ottimizza l'altezza massima e minima nella barra dei colori a destra per ottenere la migliore risoluzione dell'immagine.
  10. Eseguire l'analisi dell'immagine utilizzando il menu Analisi nella barra degli strumenti. Determinare le altezze e le distanze selezionando i punti iniziale e finale una volta selezionato l'utensile desiderato.
    NOTA: gli utenti devono provare i diversi filtri del menu Strumenti per evitare artefatti dell'immagine della punta dovuti all'appiattimento utilizzato nel processo di livellamento. Gli artefatti dell'immagine appaiono come linee di striature e sono mostrati in alcune delle immagini AFM.

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Risultati

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Le immagini della morfologia e delle dimensioni dei ceppi di S. aureus e P. hunanensis , così come l'organizzazione della popolazione di entrambi i ceppi, sono state prese mediante microscopia a forza atomica in modalità contatto. Le immagini di S. aureus hanno mostrato che la sua popolazione era distribuita per zone con aggregati di cocchi (Figura 1A). Con l'aumento della scala, c'è stato un maggiore apprezzamento della distribuzione della popolazione e della morf...

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Discussione

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La microscopia è una tecnica comunemente usata nei laboratori biologici che consente di studiare la struttura, le dimensioni, la morfologia e la disposizione cellulare dei campioni biologici. Per migliorare questa tecnica, possono essere utilizzati diversi tipi di microscopi che differiscono tra loro in termini di caratteristiche ottiche o elettroniche, che determinano la potenza di risoluzione dello strumento.

Nella ricerca scientifica, l'uso della microscopia è richiesto per la caratterizzaz...

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Dichiarazioni

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Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.

Ringraziamenti

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Ramiro Muniz-Diaz ringrazia CONACyT per la borsa di studio.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
AFM EasyScan 2NanoSurffuori produzioneMezzi di misura
loop batteriologicoNo aplicanon applicabilestrumento per l'inoculazione batterica
BigDye Terminator v3.1ThermoFisher Scientific4337455Kit di installazione Matrix
Bioeditnon applicabileversione 7.2.5Editor di allineamento
delle sequenzeSpettrometro Cary 60Agilent Technologiesnon applicabile
ceftriazoneMercknon applicabile
centrifugaeppendorfnon applicabileper rimuovere le particelle che interferiscono con AFM
ContAI-G Silicio cantileverBudgetSensorsContAl-G-10Mezzi di misura
eosina e blu di metilene agarMerckterreno dicoltura batterica
Escherichia coliAmerican Tipo Collezione di coltureATCC 25922ceppo batterico
GoTaq Flexi DNA polimerasiPromegaM8295PCR di micropiastra genica 16S rRNA
Thermo Scientific10558295per analisi di microdiluizione
Mü ller-Hinton brodoMercknon applicabilecoltura batterica medium
nutriente agarMercknon applicabilecoltura batterica medium
nutriente brodoMercknon applicabileterreno di coltura batterica
di Petrinon applicabilenon applicabilecrescita di batteri
Pseudomonas hunanensis 9APnon applicabilenon applicabileisolato dal bulbo d'aglio mediante sequenziamento Sanger CNRG
Macrogennon applicabileservizio di sequenziamento
ScienceDesk Anti-Vibration workstationThorLabs
vetrini non applicabilenon applicabilesupporto in vetro per analisi di campioni batterici
Staphylococcus aureusCollezione di colture di tipo americanoATCC 25923ceppo batterico
ThermalcyclerApplied BiosystemsVeriti-4375786Amplificazione PCR
Tripticaseina agar di soiaBDBA-256665ultrasuoni per terreni di crescita
Cole-Parmer Processore a ultrasuoni, 220 V CAnon applicabileper la miscelazione delle diluizioni di nanoparticelle
antibiotica non applicabilepiastre

Riferimenti

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