Articolo metodologico

Modalità di contatto Microscopia a forza atomica come tecnica rapida per l'osservazione morfologica e l'analisi del danno cellulare batterico

DOI:

10.3791/64823

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30 giugno 2023

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1Centro Universitario de los Lagos, Universidad de Guadalajara, 2Centro Nacional de Recursos Genéticos, Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias

In questo articolo

Sommario

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Qui, presentiamo l'applicazione della microscopia a forza atomica (AFM) come metodo semplice e veloce per la caratterizzazione batterica e analizziamo dettagli come la dimensione e la forma batterica, i biofilm di coltura batterica e l'attività delle nanoparticelle come battericidi.

Abstract

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La microscopia elettronica è uno degli strumenti necessari per caratterizzare le strutture cellulari. Tuttavia, la procedura è complicata e costosa a causa della preparazione del campione per l'osservazione. La microscopia a forza atomica (AFM) è una tecnica di caratterizzazione molto utile grazie alla sua alta risoluzione in tre dimensioni e all'assenza di qualsiasi requisito per il vuoto e la conduttività del campione. AFM può visualizzare un'ampia varietà di campioni con diverse topografie e diversi tipi di materiali.

AFM fornisce informazioni topografiche 3D ad alta risoluzione dal livello di angstrom alla scala dei micron. A differenza della microscopia tradizionale, AFM utilizza una sonda per generare un'immagine della topografia superficiale di un campione. In questo protocollo, l'uso di questo tipo di microscopia è suggerito per la caratterizzazione morfologica e del danno cellulare di batteri fissati su un supporto. Sono stati utilizzati ceppi di Staphylococcus aureus (ATCC 25923), Escherichia coli (ATCC 25922) e Pseudomonas hunanensis (isolati da campioni di bulbo d'aglio). In questo lavoro, le cellule batteriche sono state coltivate in specifici terreni di coltura. Per osservare il danno cellulare, Staphylococcus aureus ed Escherichia coli sono stati incubati con diverse concentrazioni di nanoparticelle (NP).

Una goccia di sospensione batterica è stata fissata su un supporto di vetro e le immagini sono state scattate con AFM a diverse scale. Le immagini ottenute hanno mostrato le caratteristiche morfologiche dei batteri. Inoltre, utilizzando l'AFM, è stato possibile osservare il danno alla struttura cellulare causato dall'effetto delle NP. Sulla base delle immagini ottenute, l'AFM a contatto può essere utilizzato per caratterizzare la morfologia delle cellule batteriche fissate su un supporto. L'AFM è anche uno strumento adatto per lo studio degli effetti delle NP sui batteri. Rispetto alla microscopia elettronica, l'AFM è una tecnica economica e facile da usare.

Introduzione

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Diverse forme batteriche sono state notate per la prima volta da Antony van Leeuwenhoek nel 17 ° secolo1. I batteri sono esistiti in una grande diversità di forme fin dai tempi antichi, che vanno dalle sfere alle cellule ramificate2. La forma cellulare è una condizione fondamentale per i tassonomisti batterici per descrivere e classificare ogni specie batterica, principalmente per la separazione morfologica dei phyla gram-positivi e gram-negativi3. Diversi elementi sono noti per determinare le forme cellulari batteriche, che sono tutti coinvolti nelle coperture cellulari e nel supporto come compon....

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Protocollo

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1. Isolamento batterico e identificazione

  1. Isolamento di un ceppo endofitico dai meristemi del bulbo d'aglio:
    1. Posizionare frammenti di meristemi di 2 mm provenienti da bulbi d'aglio precedentemente sbucciati, disinfettati e tagliati su agar di soia tripticasi (TSA) come mezzo di crescita ricco e incubare a 25 °C per 1 giorno.
    2. Sulla base delle differenze morfologiche delle colonie batteriche - forma, dimensione, colore, bordo, luce trasmessa, luce riflessa, consistenza, consistenza e produzione di pigmento - descrivere i diversi morfotipi osservati e purificare striando una colonia rappresentativa di ciascun morfotipo.
      3. ....

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Risultati

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Le immagini della morfologia e delle dimensioni dei ceppi di S. aureus e P. hunanensis , così come l'organizzazione della popolazione di entrambi i ceppi, sono state prese mediante microscopia a forza atomica in modalità contatto. Le immagini di S. aureus hanno mostrato che la sua popolazione era distribuita per zone con aggregati di cocchi (Figura 1A). Con l'aumento della scala, c'è stato un maggiore apprezzamento della distribuzione della popolazione e della morf.......

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Discussione

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La microscopia è una tecnica comunemente usata nei laboratori biologici che consente di studiare la struttura, le dimensioni, la morfologia e la disposizione cellulare dei campioni biologici. Per migliorare questa tecnica, possono essere utilizzati diversi tipi di microscopi che differiscono tra loro in termini di caratteristiche ottiche o elettroniche, che determinano la potenza di risoluzione dello strumento.

Nella ricerca scientifica, l'uso della microscopia è richiesto per la caratterizzaz.......

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Dichiarazioni

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Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.

Ringraziamenti

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Ramiro Muniz-Diaz ringrazia CONACyT per la borsa di studio.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
AFM EasyScan 2NanoSurffuori produzioneMezzi di misura
loop batteriologicoNo aplicanon applicabilestrumento per l'inoculazione batterica
BigDye Terminator v3.1ThermoFisher Scientific4337455Kit di installazione Matrix
Bioeditnon applicabileversione 7.2.5Editor di allineamento
delle sequenzeSpettrometro Cary 60Agilent Technologiesnon applicabile
ceftriazoneMercknon applicabile
centrifugaeppendorfnon applicabileper rimuovere le particelle che interferiscono con AFM
ContAI-G Silicio cantileverBudgetSensorsContAl-G-10Mezzi di misura
eosina e blu di metilene agarMerckterreno dicoltura batterica
Escherichia coliAmerican Tipo Collezione di coltureATCC 25922ceppo batterico
GoTaq Flexi DNA polimerasiPromegaM8295PCR di micropiastra genica 16S rRNA
Thermo Scientific10558295per analisi di microdiluizione
Mü ller-Hinton brodoMercknon applicabilecoltura batterica medium
nutriente agarMercknon applicabilecoltura batterica medium
nutriente brodoMercknon applicabileterreno di coltura batterica
di Petrinon applicabilenon applicabilecrescita di batteri
Pseudomonas hunanensis 9APnon applicabilenon applicabileisolato dal bulbo d'aglio mediante sequenziamento Sanger CNRG
Macrogennon applicabileservizio di sequenziamento
ScienceDesk Anti-Vibration workstationThorLabs
vetrini non applicabilenon applicabilesupporto in vetro per analisi di campioni batterici
Staphylococcus aureusCollezione di colture di tipo americanoATCC 25923ceppo batterico
ThermalcyclerApplied BiosystemsVeriti-4375786Amplificazione PCR
Tripticaseina agar di soiaBDBA-256665ultrasuoni per terreni di crescita
Cole-Parmer Processore a ultrasuoni, 220 V CAnon applicabileper la miscelazione delle diluizioni di nanoparticelle
antibiotica non applicabilepiastre

Riferimenti

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  1. Koch, A. L. Growth and form of the bacterial cell wall. American Scientist. 78 (4), 327-341 (1990).
  2. Si, F., Li, B., Margolin, W., Sun, S. X. Bacterial growth and form under mechanical compression. Scientific Report. 5, 11367(2015).
  3. Pavlova, M. D., Asaturova, A. M., Kozit....

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Atomic Force MicroscopyContact Mode AFMBacterial Cell DamageMorphological ObservationNanoparticle ExposureSample FixingStaphylococcus AureusEscherichia ColiSurface TopographyImage Analysis

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