Scaffold di idrogel granulare di gelatina metacrilico: fabbricazione di microgel ad alta produttività, liofilizzazione, assemblaggio chimico e bioprinting 3D

Sommario

Questo articolo descrive i protocolli per la fabbricazione di microgel di gelatina metacriloile ad alta produttività utilizzando dispositivi microfluidici, la conversione di microgel in polvere risostenibile (micro-aerogel), l'assemblaggio chimico di microgel per formare scaffold di idrogel granulare e lo sviluppo di bioink granulari di idrogel con microporosità conservata per il bioprinting 3D.

Abstract

L'emergere di scaffold granulari di idrogel (GHS), fabbricati tramite l'assemblaggio di microparticelle di idrogel (HMP), ha permesso la formazione di scaffold microporosi in situ. A differenza degli idrogel sfusi convenzionali, i pori interconnessi su microscala nel GHS facilitano l'infiltrazione cellulare indipendente dalla degradazione e il trasferimento di ossigeno, nutrienti e sottoprodotti cellulari. La gelatina modificata con metacrilile (GelMA), un biopolimero (foto)chimicamente reticolabile a base di proteine contenente adesivi cellulari e porzioni biodegradabili, è stato ampiamente utilizzato come biomateriale sensibile alle cellule / istruttivo. La conversione di GelMA sfuso in GHS può aprire una pletora di opportunità per l'ingegneria e la rigenerazione dei tessuti. In questo articolo, dimostriamo le procedure di fabbricazione di microgel GelMA ad alta produttività, conversione in microgel secchi risospendibili (micro-aerogel), formazione di GHS tramite l'assemblaggio chimico di microgel e fabbricazione di bioink granulari per la bioprinting per estrusione. Mostriamo come un trattamento fisico-chimico sequenziale tramite raffreddamento e fotoreticolazione consenta la formazione di GHS meccanicamente robusto. Quando la luce è inaccessibile (ad esempio, durante l'iniezione di tessuti profondi), gli HMP GelMA reticolati singolarmente possono essere assemblati bioortogonalmente tramite reticolazione enzimatica utilizzando transglutaminasi. Infine, la bioprinting tridimensionale (3D) di GHS microporoso a bassa densità di impacchettamento HMP è dimostrata attraverso l'autoassemblaggio interfacciale di nanoparticelle caricate eterogeneamente.

Introduzione

L'assemblaggio di blocchi di costruzione HMP per formare scaffold di ingegneria tissutale ha guadagnato un'enorme attenzione negli ultimi anni¹. GHS, fabbricato tramite assemblaggio HMP, ha proprietà uniche rispetto alle loro controparti sfuse, compresa la microporosità su scala cellulare proveniente dagli spazi vuoti tra i blocchi di costruzione discreti. Ulteriori proprietà, come l'iniettabilità, la modularità e la rigidità disaccoppiata dalla porosità, rendono GHS una piattaforma promettente per migliorare la riparazione e la rigenerazione dei tessuti². Per la fabbricazione del GHS sono stati utilizzati diver....

Protocollo

NOTA: vedere la tabella dei materiali per i dettagli relativi a tutti i materiali, strumenti e reagenti utilizzati in questo protocollo.

1. Sintesi di GelMA

NOTA: la sintesi di GelMA deve essere condotta in una cappa aspirante chimica e devono essere utilizzati sempre adeguati dispositivi di protezione individuale (DPI).

1. Aggiungere 200 mL di soluzione salina tamponata fosfato di Dulbecco (DPBS, 1x) in un matraccio Erlenmeyer e riscaldare la soluzione fino a 50 °C. Coprire il pallone con un foglio di alluminio per evitare l'evaporazione.
2. Aggiungere 20 g di gel....

Risultati

GelMA è stato sintetizzato attraverso la reazione della gelatina con MA, come presentato nella Figura 1A. Adattando le condizioni di reazione, come la concentrazione di MA, sono stati ottenuti diversi gradi di sostituzione di MA. Per quantificare il grado di sostituzione MA, GelMA è stato valutato tramite ^{spettroscopia NMR 1}H (Figura 1B). I gruppi funzionali vinilici con picchi rappresentativi ai cambiamenti chimici di ~ 5-6 ppm hanno conferm.......

Discussione

La gelatina e i suoi derivati sono i biomateriali a base proteica più comunemente usati per la fabbricazione di HMP. La sfida del compromesso tra produttività e monodispersità delle dimensioni delle particelle può essere superata utilizzando dispositivi microfluidici a emulsificazione graduale. Questi dispositivi sono in grado di formare più di 40 milioni di goccioline all'ora, con un coefficiente di variazione inferiore al 5%²⁷. In questo articolo, abbiamo discusso la microfabbricazione di goccio.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
1H,1H-perfluoro-1-ottanolo	Alfa Aesar, MA, USA	B20156-18	di purezza al 98%
	Integra Miltex, NY, USA	33-31A-P/25	Punzone per biopsia da 1,5 mm con sistema a stantuffo
Ago smussato	SANANTS	30-002-25	25 G
Bruker Avance NEO 400 MHz	400 MHz Bruker NEO, MA, USA		Dispositivo NMR
Centrifuga	Eppendorf, Germania	5415 C
Provetta da centrifuga	Celltreat, MA, USA	229423
Filtri per caffè	BUNN, IL, USA	20104.0006	BUNN 8-12 Filtri per caffè da tazza, 6 ciascuno, 100 ct
Essiccatore	Thermo Scientific	5311-0250	Nalgene Essiccatore sottovuoto, coperchio e corpo in PC, 280 mm OD
Ossido di deuterio	Sigma, MA, USA	151882
Membrana per dialisi (12-14 kDa)	Spectrum Laboratories, NJ, USA	08-667E
Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco (DPBS, 1x)	Sigma, MA, USA	56064C-10L	polvere secca, senza calcio, senza magnesio, adatta per colture cellulari
Pallone di Erlenmeyer	Corning, NY, USA	4980	Corning PYREX
Etanolo	VWR, PA, USA	89125-188	Koptec 200 proof
Fiale criogeniche con filettatura esterna (crioviali)	Corning, NY, USA	430659
Liofilizzatore	Labconco, MO, USA	71042000	Dotato di pompa a vuoto (Catalog# 7587000)
Gelatina in polvere	Sigma, MA, USA	G1890-5100G	Tipo A da pelle suina, forza del gel ~300 g Bloom
Glass vetrini per microscopio	VWR, PA, USA	82027-788
	Piastra riscaldante	FOUR E'S SCIENTIFIC	Agitatore magnetico da 5 pollici Temp massima 280 ... C/536 ° F
Kimwipes	Fischer scientific, MA, USA	06-666
KMPR 1000 fotoresist negativi serie	Kayaku Advanced Materials, MA, USA		121619 KMPR1025 e KMP1035 sono inclusi
LAPONITE XLG	BYK USA Inc., CT, USA	2344265
Litio fenil-2,4,6-trimetilbenzoilfosfinato (LAP)	Sigma, MA, USA	900889-1G	>95%
Luer-Lok connettore	BD, NJ, USA	BD 302995
MA/BA Gen4-Serie Mask- und Bond-Aligner	SÜ SS MicroTeck, dispositivo tedesco		di nanofabbricazione
Anidride metacilato	Sigma, MA, USA	276685-100ML	contiene 2.000 ppm topanolo A come inibitore, 94%
Milli-Q acqua	Millipore Corporation, MA, USA	ZRQSVR5WW	resistività elettrica &asinto; 18 M & Omega; a 25 & deg; C, Direct-Q 5 UV Sistema di purificazione dell'acqua a distanza
Novec 7500 fluido tecnico 3M	, MN, USA		3M ID  7100003723
Forno	VWR, PA, USA	VWR-1410	1410 Forno sottovuoto
Parafilm	Fischer scientific, MA, USA	HS234526C
Pipetta Pasteur	VWR, PA, USA	14673-010
Piastra di Petri	VWR, PA, USA	25384-092	polistirene
Pico-Surf	Sphere Fluidics, UK	C022	(5% (p/p) in Novec 7500)
Pipetta	VWR, PA, USA	89079-970
Puntali per pipette	VWR, PA, USA	87006-060
Camera di pulizia al plasma	Harrick Plasma, NY, USA	PDC-001-HP
Polidimetilsilossano	Dow Corning, MI, Stati Uniti	d'America 2065623	SYLGARD 184 Kit elastomero siliconico
Pipetta a spostamento positivo	Microman E M100E, Gilson, OH, USA	Cialde di silicio M100E
	UniversityWafer, MA, USA	452/1196	da 4 pollici di grado meccanico
	VWR, PA, USA	231-0104
Monouso SU-8	Kayaku Advanced Materials, MA, USA
Pompa a siringa	Harvard Apparatus, MA, USA	70-2001	PHD 2000
Tricloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluoroottil)silano	Millipore Sigma, MA, USA	448931-10G	97%
Tygon tubi	Saint-globain, PA, USA	AAD04103
Luce UV	QUANS		Tensione: 85 V-265 V AC / Potenza: 20 W
Unità di filtrazione sottovuoto	VWR, PA, USA	10040-460	0.20 &; m
Vortex	Fischer scientific, USA	14-955-151	Mini miscelatore a vortice

Punzone per biopsia MI0102003 Spatola