Method Article

Suggerimenti e trucchi per la preparazione dei campioni di proteoma

DOI:

10.3791/64830

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February 3rd, 2023

1Department of Chemistry, Dalhousie University

In This Article

Abstract

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ARTICOLI DISCUSSI:

Kovalchuk, S. I., Ziganshin, R., Shelukhina, I. Semplice produzione interna di colonne capillari ad altissime prestazioni con l'approccio FlashPack. Giornale degli esperimenti visualizzati. (178), E62522 (2021).

Sirois, I., Isabelle, M., Duquette, J. D., Saab, F., Caron, E. Immunopeptidomica: Isolamento di peptidi associati a MHC di classe I e II di topo e umano per analisi di spettrometria di massa. Giornale degli esperimenti visualizzati. (176), E63052 (2021).

Han, Y., Thomas, C. T., Wennersten, S. A., Lau, E., Lam, M. P. Y. Elaborazione di campioni di proteomica shotgun automatizzata da un robot da laboratorio open-source. Giornale degli esperimenti visualizzati. (176), E63092 (2021).

Nickerson, J. L. et al. Precipitazione di proteine a base di solventi organici per una robusta purificazione del proteoma prima della spettrometria di massa. Giornale degli esperimenti visualizzati. (180), E63503 (2022).

Li, D., Liang, J., Zhang, Y., Zhang, G. Un flusso di lavoro integrato di identificazione e quantificazione su metaboloma non mirato basato sul controllo FDR. Giornale degli esperimenti visualizzati. DOI: 10.3791/63625-V (2022).

Petelski, A. A., Nikolai Slavov, N., Specht, N. Preparazione proteomica a singola cellula per analisi di spettrometria di massa utilizzando la lisi a freddo-calore e un vettore isobarico. Giornale degli esperimenti visualizzati. DOI: 10.3791/63802 (2022).

Discussion

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Con i suoi notevoli guadagni in termini di sensibilità, velocità e versatilità, la moderna spettrometria di massa (MS) offre ai ricercatori maggiori opportunità per la caratterizzazione del proteoma. Con il miglioramento delle tecnologie, i ricercatori richiedono un maggiore livello di rigore nei loro risultati. Pertanto, di uguale importanza per il flusso di lavoro della proteomica sono le strategie innovative di preparazione dei campioni ideate per isolare, separare ed elaborare miscele proteomiche complesse prima della SM. La diversità chimica dei sistemi proteomici preclude un approccio unico alla preparazione dei campioni. Tuttavia, come si vede attraverso questa raccolta di metodi, sono disponibili più protocolli per massimizzare la qualità e l'affidabilità dei dati MS. Questa raccolta mira a fornire ai ricercatori strumenti e trucchi facili da implementare progettati per migliorare il risultato atteso dei flussi di lavoro proteomici e metabolomici.

Le colonne HPLC e UPLC capillari sono quasi onnipresenti per i flussi di lavoro proteomici completi. Sebbene le colonne capillari autoimpaccate siano un'alternativa a basso costo alle colonne commerciali, coloro che hanno tentato di impacchettare le proprie colonne potrebbero avere familiarità con tassi di impacchettamento incoerenti e qualità variabile delle colonne. Kovalchuk e colleghi dell'Accademia Russa delle Scienze dimostrano il loro approccio FlashPack per garantire l'impaccamento efficiente e coerente delle colonne capillari UPLC1. Una combinazione di variabili controllate con precisione riduce la formazione di cupole all'ingresso del capillare e consente un rapido riempimento della colonna utilizzando una bomba impacchettante a bassa pressione.

L'immunopeptidomica è una sottodisciplina emergente della proteomica, con implicazioni cliniche in oncologia e nelle terapie immunitarie. Un'analisi affidabile della MS richiede l'isolamento di MHC di classe I/II o di ligandi peptidici dell'antigene leucocitario umano (HLA). Per migliorare la riproducibilità di questo protocollo di isolamento, Sirois e colleghi dell'Università di Montreal dimostrano un flusso di lavoro di acquisizione dell'affinità basato su microsfere su piccola scala, insieme ai risultati previsti per la SM dell'immunopeptidoma2 recuperato.

Per migliorare ulteriormente il rigore dei dati di proteomica e facilitare l'elaborazione ad alto rendimento di un gran numero di campioni, i ricercatori si stanno rivolgendo sempre più a piattaforme robotiche per automatizzare le fasi di elaborazione dei campioni. È disponibile una piattaforma robotica a basso costo, anche se ciò richiede all'utente di programmare le fasi di manipolazione desiderate, il che può rappresentare un ostacolo all'utilizzo di questo dispositivo. Han et al. presso l'Università del Colorado Anschutz Medical Campus hanno ideato un semplice pacchetto di codifica open-source e dimostrano i passaggi di base coinvolti nella digestione delle proteine sulla piattaforma robotica Opentrons OT-23.

I tensioattivi come la SDS sono comunemente impiegati per facilitare l'estrazione cellulare e la solubilizzazione del proteoma prima della SM. Tuttavia, la rimozione della SDS potrebbe essere incompleta o altrimenti rischiare la perdita del campione. Nickerson e colleghi della Dalhousie University dimostrano una cartuccia usa e getta per automatizzare il processo di precipitazione delle proteine4. Una combinazione di sale e solvente organico è fondamentale per massimizzare il recupero delle proteine e può essere eseguita in un tempo minimo ad alte rese.

La metabolomica sta seguendo le orme dell'analisi del proteoma, con un database in crescita di spettri MS di riferimento utilizzati per identificare metaboliti sconosciuti in flussi di lavoro mirati e non mirati. Analogamente all'analisi proteomica, le identificazioni spettrali sono soggette a false corrispondenze positive e quindi una segnalazione statistica del tasso di false scoperte (FDR) è essenziale per filtrare i risultati a bassa confidenza. Li e colleghi dell'Università di Jinan hanno collaborato con Chi-Biotech Co. per produrre un flusso di lavoro basato sul web basato sul loro programma XY-Meta e generare un database di esche target di metaboliti5. Dimostrano i passaggi per generare il database target e filtrare i risultati metabolomici in base a un FDR desiderato.

Infine, un protocollo per l'isolamento del proteoma a singola cellula è dimostrato da Petelski e colleghi della Northeastern University6. Il protocollo Single-Cell ProtEomics (SCoPE2) consente ai ricercatori di quantificare centinaia di migliaia di proteine in un singolo esperimento, utilizzando un vettore isobarico per ridurre la perdita di campioni. La chiave del protocollo è una rapida fase di ciclo termico per lisare le cellule, nonché un'efficiente digestione triptica utilizzando una quantità maggiore del tipico di enzima e marcatura isobarica con tag TMT.

Nonostante decenni di esperienza nella proteomica, questo campo in fase di maturazione si è semplicemente evoluto per affrontare problemi più impegnativi. La capacità di elaborare un numero maggiore di campioni, o quantità minori di materiale, con maggiore coerenza e fiducia nell'output dei dati continua a guidare le innovazioni tecnologiche. Lo scambio di idee relative alle manipolazioni chimiche, agli approcci strumentali e informatici è essenziale per la crescita di questo campo. Il "problema" di un ricercatore potrebbe essere già stato risolto con un semplice "suggerimento o trucco" per superare la sfida. È quindi un segno positivo che siano disponibili così tante strategie uniche per l'analisi del proteoma. Per quelle sfide che rimangono, è probabile che qualcuno stia già lavorando a una possibile soluzione.

Disclosures

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L'autore non ha nulla da rivelare.

Acknowledgements

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Questo lavoro è stato supportato dal Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada, NSERC RGPIN 05145-17.

References

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  1. Kovalchuk, S. I., Ziganshin, R., Shelukhina, I. Simple in-house ultra-high performance capillary column manufacturing with the FlashPack approach. Journal of Visualized Experiments. (178), e62522(2021).
  2. Sirois, I., Isabelle, M., Duquette, J. D., Saab, F., Caron, E. Immunopeptidomics: Isolation of mouse and human MHC Class I- and II-associated peptides for mass spectrometry analysis. Journal of Visualized Experiments. (176), e63052(2021).
  3. Han, Y., Thomas, C. T., Wennersten, S. A., Lau, E., Lam, M. P. Y. Shotgun proteomics sample processing automated by an open-source lab robot. Journal of Visualized Experiments. (176), e63092(2021).
  4. Nickerson, J. L., et al. Organic solvent-based protein precipitation for robust proteome purification ahead of mass spectrometry. Journal of Visualized Experiments. (180), e63503(2022).
  5. Li, D., Liang, J., Zhang, Y., Zhang, G. An integrated workflow of identification and quantification on FDR control-based untargeted metabolome. Journal of Visualized Experiments. , e63625(2022).
  6. Petelski, A. A., Nikolai Slavov, N., Specht, N. Single-cell proteomics preparation for mass spectrometry analysis using freeze-heat lysis and an isobaric carrier. Journal of Visualized Experiments. , e63802(2022).

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