Qui, descriviamo un protocollo per lo sviluppo di un modello di xenotrapianto di membrana corioallantoica (CAM) di pulcino per il tessuto ovarico umano e dimostriamo l'efficacia della tecnica, il tempo di rivascolarizzazione dell'innesto e la vitalità del tessuto in un periodo di innesto di 6 giorni.
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Articolo metodologico
Il modello di membrana corioallantoica del pulcino (CAM) come strumento per lo studio del trapianto di tessuto ovarico
In questo articolo
Sommario
Abstract
La crioconservazione e il trapianto di tessuto ovarico sono una strategia efficace per preservare la fertilità, ma presentano un grave svantaggio, vale a dire la massiccia perdita di follicoli che si verifica poco dopo il reimpianto a causa dell'attivazione anomala del follicolo e della morte. I roditori sono modelli di riferimento per studiare l'attivazione dei follicoli, ma i costi, i tempi e le considerazioni etiche stanno diventando sempre più proibitivi, guidando così lo sviluppo di alternative. Il modello di membrana corioallantoica (CAM) del pulcino è particolarmente interessante, essendo poco costoso e mantenendo l'immunodeficienza naturale fino al giorno 17 dopo la fecondazione, rendendolo ideale per studiare lo xenotrapianto a breve termine di tessuto ovarico umano. La CAM è anche altamente vascolarizzata ed è stata ampiamente utilizzata come modello per esplorare l'angiogenesi. Ciò gli conferisce un notevole vantaggio rispetto ai modelli in vitro e consente di studiare i meccanismi che influenzano il processo di perdita follicolare post-trapianto precoce. Il protocollo qui delineato mira a descrivere lo sviluppo di un modello di xenotrapianto CAM per il tessuto ovarico umano, con approfondimenti specifici sull'efficacia della tecnica, sui tempi di rivascolarizzazione dell'innesto e sulla vitalità tissutale in un periodo di innesto di 6 giorni.
Introduzione
La domanda di preservazione della fertilità per indicazioni oncologiche e benigne, oltre che per motivi sociali, è aumentata notevolmente negli ultimi decenni. Tuttavia, vari trattamenti utilizzati per curare malattie maligne e non maligne sono altamente tossici per le gonadi e possono provocare insufficienza ovarica precoce iatrogena, portando infine all'infertilità1. Le tecniche consolidate per la preservazione della fertilità includono la crioconservazione degli embrioni, la vitrificazione di ovociti immaturi o maturi e la crioconservazione del tessuto ovarico 2,3,4
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Protocollo
L'uso di tessuti umani è stato approvato dall'Institutional Review Board dell'Università Cattolica di Lovanio. Le pazienti hanno dato il loro consenso informato scritto per l'uso del loro tessuto ovarico a fini di ricerca.
1. Ordinare ovuli del giorno 0 che hanno un'alta probabilità di essere embrionati
- Trova un fornitore certificato di uova bianche livornesi selezionate da Lohman di grado di laboratorio che riporti alti tassi di uova embrionate, che dipendono principalmente dall'età dei pulcini.
2. Preparazione delle uova per l'incubazione
- Prima dell'ar....
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Risultati
Tassi di sopravvivenza degli embrioni di pulcino
Il tasso di sopravvivenza dell'embrione dal windowing (giorno 3 di PS) all'innesto di tessuto ovarico (giorno 7 di PS) è stato del 79% (33/42). Poiché la percentuale di uova embrionate al giorno 0 non è nota, sono state ordinate uova soprannumerarie al giorno 0 di galline bianche livornesi selezionate da Lohman per garantire che fosse disponibile un numero sufficiente di uova embrionate per l'innesto. Un totale di 23 ovuli vitali al giorno 7 sono stati .......
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Discussione
La parte più impegnativa del protocollo qui descritto è fare il piccolo foro necessario per aspirare l'albume al fine di staccare il CAM dal guscio d'uovo prima di creare una finestra. L'applicazione di una pressione eccessiva può provocare una penetrazione eccessiva o addirittura rompere e distruggere l'uovo, causando danni irreversibili alla CAM e alla sua vascolarizzazione. Per ridurre al minimo gli errori durante i tentativi iniziali di separare la CAM, si consiglia vivamente di esercitarsi a praticare piccoli fori n.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori ringraziano Mira Hryniuk, BA, per aver revisionato la lingua inglese dell'articolo.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Ago ipodermico Agani, 19 G | Terumo Europe | AN*1950R1 | Ago da 19 G per aspirare l'albume |
| Siringa Terumo, 5 mL Luer lock concentrico | Terumo Europe | SS*05LE1 | Siringa sterile da 5 ml |
| Caseviewer v2.2 | 3DHISTECH | Software di analisi delle immagini | |
| Etere etilico | Merck Chemicals | 603-022-00-4 | Etere sterile per traumatizzare il CAM |
| Eosina Y soluzione acquosa 0,5% | Merck | 1098441000 | Soluzione colorante |
| Formaldeide 4% soluzione acquosa tamponata (Formalina 10%) | VWR | 97139010 | Formaldeide utilizzata per la fissazione dei tessuti |
| Frigorifero | Liebherr | 7081260 | Frigorifero a 4 gradi; C utilizzato per l'inclusione di paraffina |
| Piastra riscaldante | Schott | SLK2 | Piastra riscaldante utilizzata per asciugare i vetrini |
| Incubatore | Thermo Forma Scientific 3111 | 10365156 | Forno utilizzato per l'incubazione dei vetrini |
| Microscopio Leica CLS 150 XE Sorgente di luce fredda | Leica | CLS 150 XE | Sorgente di luce fredda focale per candele |
| Panno per la pulizia delle lenti, grado 541 | VWR | 111-5003 | Tessuto da immergere in etere sterile per traumatizzare |
| l'ematossilina | MERCK | di | 1092491000 Soluzione colorante |
| Metanolo | VWR | 20847307 | Metanolo |
| ThermoScientific-MICROM | HM325-2 | Microtomo | |
| Pannoramico P250 Flash III | 3DHISTECH/ | Scanner per vetrini con ingrandimento 20x | |
| Paraformaldeide | Merck | 1,04,00,51,000 | Soluzione per inclusione di paraffina |
| Paraplast Plus R | Sigma | P3683-1KG | Piastra di Petri per paraffina |
| , 60x15 mm, sterile | Greiner | 628161 | Piastra di Petri sterile |
| Portaspilli | Fine Science Tools | 26016-12 | Portaspilli |
| Polyhatch | Brinsea | CP01F | Incubatrice per uova con rotatore automatico |
| Lama per sega a traforo, 132 mm | Sencys | / | Lama per creare una finestra nel guscio d'uovo |
| Perni di inserimento in acciaio inox | Fine Science Tools | 26007-02 | Perno dritto per fare un foro nel guscio d'uovo |
| Steril-Helios | Angelantoni Industrie | ST-00275400000 | Cappa a flusso laminare |
| Superfrost Plus bords rodé s 90° | VWR | 631-9483 | Vetrini |
| Tissue-Tek VIP 6Al | Sakura | 60320417-0711 VID6E3-1 | Dispositivo di inclusione automatica |
| Pinze in titanio | Strumenti di scienza fine | 11602-16 | Pinze per la rimozione del guscio d'uovo e la manipolazione del tessuto ovarico |
| Toluene, pa | VWR | 28701364 | Soluzione di inclusione della paraffina |
Riferimenti
- Cacciottola, L., Donnez, J., Dolmans, M. M. Ovarian tissue and oocyte cryopreservation prior to iatrogenic premature ovarian insufficiency. Best Practice & Research Clinical Obstetrics & Gynaecology. 81, 119-133 (2022).
- Dolmans, M. -M., Hossay, C., Nguyen, T. Y. T., Poirot, C.
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Ristampe e permessi
