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Articolo metodologico

Il modello di membrana corioallantoica del pulcino (CAM) come strumento per lo studio del trapianto di tessuto ovarico

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DOI:

10.3791/64867

⸱

23 giugno 2023

 ,  ,  ,  , 
1Gynecology Research Unit, Institut de Recherche Expérimentale et Clinique, Université Catholique de Louvain, 2Gynecology Department, Cliniques Universitaires Saint-Luc

In questo articolo

Sommario

Qui, descriviamo un protocollo per lo sviluppo di un modello di xenotrapianto di membrana corioallantoica (CAM) di pulcino per il tessuto ovarico umano e dimostriamo l'efficacia della tecnica, il tempo di rivascolarizzazione dell'innesto e la vitalità del tessuto in un periodo di innesto di 6 giorni.

Abstract

La crioconservazione e il trapianto di tessuto ovarico sono una strategia efficace per preservare la fertilità, ma presentano un grave svantaggio, vale a dire la massiccia perdita di follicoli che si verifica poco dopo il reimpianto a causa dell'attivazione anomala del follicolo e della morte. I roditori sono modelli di riferimento per studiare l'attivazione dei follicoli, ma i costi, i tempi e le considerazioni etiche stanno diventando sempre più proibitivi, guidando così lo sviluppo di alternative. Il modello di membrana corioallantoica (CAM) del pulcino è particolarmente interessante, essendo poco costoso e mantenendo l'immunodeficienza naturale fino al giorno 17 dopo la fecondazione, rendendolo ideale per studiare lo xenotrapianto a breve termine di tessuto ovarico umano. La CAM è anche altamente vascolarizzata ed è stata ampiamente utilizzata come modello per esplorare l'angiogenesi. Ciò gli conferisce un notevole vantaggio rispetto ai modelli in vitro e consente di studiare i meccanismi che influenzano il processo di perdita follicolare post-trapianto precoce. Il protocollo qui delineato mira a descrivere lo sviluppo di un modello di xenotrapianto CAM per il tessuto ovarico umano, con approfondimenti specifici sull'efficacia della tecnica, sui tempi di rivascolarizzazione dell'innesto e sulla vitalità tissutale in un periodo di innesto di 6 giorni.

Introduzione

La domanda di preservazione della fertilità per indicazioni oncologiche e benigne, oltre che per motivi sociali, è aumentata notevolmente negli ultimi decenni. Tuttavia, vari trattamenti utilizzati per curare malattie maligne e non maligne sono altamente tossici per le gonadi e possono provocare insufficienza ovarica precoce iatrogena, portando infine all'infertilità1. Le tecniche consolidate per la preservazione della fertilità includono la crioconservazione degli embrioni, la vitrificazione di ovociti immaturi o maturi e la crioconservazione del tessuto ovarico 2,3,4. Il congelamento del tessuto ovarico è l'unica opzione disponibile per preservare la fertilità nelle ragazze in età prepuberale o nelle donne che richiedono una terapia oncologica immediata. Il ripristino della funzione endocrina a seguito di trapianto di tessuto ovarico si verifica in oltre il 95% dei soggetti, con tassi di natalità che vanno dal 18% al 42%5,6,7,8,9.

Sebbene il trapianto di tessuto ovarico congelato-scongelato si sia dimostrato efficace, c'è ancora spazio per miglioramenti. Infatti, quando i frammenti corticali ovarici vengono trapiantati senza anastomosi vascolare, sperimentano un periodo di ipossia durante il quale avviene la rivascolarizzazione dell'innesto 10,11,12. La stragrande maggioranza degli studi che indagano sul trapianto di tessuto ovarico umano hanno utilizzato un modello di xenotrapianto, in cui il tessuto ovarico viene trapiantato su topi immunodeficienti. La rivascolarizzazione completa degli xenotrapianti richiede circa 10 giorni, con sia l'ospite che i vasi dell'innesto che contribuiscono alla formazione di vasi funzionali 12,13,14. Circa il 50%-90% della riserva follicolare viene persa durante questa finestra ipossica prima del completamento della rivascolarizzazione dell'innesto 10,15,16. È stato fortemente suggerito che questa massiccia perdita di follicoli si verifichi sia attraverso la morte diretta del follicolo, come dimostrato da una diminuzione del numero assoluto di follicoli rimasti dopo l'innesto, sia attraverso l'attivazione della crescita del follicolo primordiale, come indicato dai cambiamenti nelle proporzioni del follicolo verso l'aumento dei tassi di follicoli in crescita17,18.

È interessante notare che precedenti lavori di ricerca che utilizzano vari tessuti ovarici animali innestati sulla membrana corioallantoica del pulcino (CAM), che ha una costituzione che imita il tipico sito di innesto del peritoneo, hanno riportato l'inibizione dell'attivazione spontanea del follicolo, con la riserva follicolare primordiale che rimane intatta fino a 10 giorni 19,20,21,22. Il nostro team ha precedentemente dimostrato che l'innesto di tessuto ovarico umano congelato-scongelato alla CAM costituiva un approccio affidabile per studiare il trapianto di tessuto ovarico umano nei suoi primi stadi ischemici23 e recentemente ha dimostrato che questo metodo di innesto era in grado di contrastare l'attivazione del follicolo24.

Il modello CAM è particolarmente interessante non solo perché gli ovuli sono molto più economici dei topi, ma anche per la natura altamente vascolarizzata della CAM, che consente di esaminare l'associazione tra l'attivazione del follicolo e la rivascolarizzazione dell'innesto ovarico. Il sistema aviario è, infatti, uno dei modi più comuni e versatili per studiare l'angiogenesi25. Lo sviluppo embrionale del pulcino (DE) richiede 21 giorni fino alla schiusa e la CAM si forma entro i primi 4-5 giorni attraverso la fusione dell'allantoide e del corion26. In particolare, l'embrione di pulcino è un ospite naturalmente immunodeficiente fino al 17° giorno di disfunzione erettile, quindi gli esperimenti di xenotrapianto possono essere eseguiti senza alcun rischio di rigetto del trapianto27,28. Inoltre, l'approccio basato su modelli CAM non solleva preoccupazioni etiche o giuridiche in termini di diritto europeo29, il che lo rende un'alternativa interessante ad altri modelli animali. Per quanto riguarda le condizioni di allevamento, gli embrioni di pulcino necessitano solo di un'incubatrice impostata a 37 °C con un'umidità relativa dell'aria del 40%-60%. Questi requisiti di sperimentazione limitati riducono significativamente i costi di ricerca rispetto all'uso di topi immunodeficienti.

Il protocollo qui presentato ha lo scopo di descrivere lo sviluppo di un modello di xenotrapianto CAM per il tessuto ovarico umano e fornire approfondimenti specifici sull'efficacia della tecnica, sui tempi di rivascolarizzazione dell'innesto e sulla vitalità tissutale per un periodo di innesto di 6 giorni. Questo protocollo potrebbe essere di grande interesse per studiare i meccanismi alla base della perdita precoce di follicoli post-trapianto e studiare l'impatto di diversi agenti (fattori di crescita, ormoni, ecc.) su questo fenomeno.

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Protocollo

L'uso di tessuti umani è stato approvato dall'Institutional Review Board dell'Università Cattolica di Lovanio. Le pazienti hanno dato il loro consenso informato scritto per l'uso del loro tessuto ovarico a fini di ricerca.

1. Ordinare ovuli del giorno 0 che hanno un'alta probabilità di essere embrionati

  1. Trova un fornitore certificato di uova bianche livornesi selezionate da Lohman di grado di laboratorio che riporti alti tassi di uova embrionate, che dipendono principalmente dall'età dei pulcini.

2. Preparazione delle uova per l'incubazione

  1. Prima dell'arrivo delle uova, assemblare e bilanciare l'incubatrice a 37 °C con un'umidità relativa dell'aria del 40%-60%. Monitorare la temperatura e l'umidità dell'aria inserendo un termometro e un igrometro nell'incubatrice. Assicurarsi che il coperchio dell'incubatrice sia dotato di una finestra di vetro per consentire il controllo dei parametri interni dell'incubatrice senza doverla aprire (Figura 1).
  2. Dopo aver ricevuto le uova del giorno 0 da pulcini bianchi livornesi selezionati da Lohman da un fornitore di uova certificato di laboratorio, pulire la superficie dei gusci con carta umidificata e asciugarli immediatamente.
    NOTA: Poiché la membrana del guscio d'uovo è porosa, è possibile utilizzare acqua sterilizzata in autoclave per pulire le superfici delle uova e controllare l'umidità all'interno dell'incubatrice al fine di ridurre al minimo i rischi di contaminazione.
  3. Etichettare le uova utilizzando un pennarello (ad es. data e numero di uova).
  4. Incubare le uova con l'estremità appuntita rivolta verso il basso e ruotarle per consentire lo sviluppo della CAM. Ruotare manualmente le uova di 180° due o tre volte al giorno o utilizzare un rotatore automatico.
    NOTA: Per garantire che le uova vengano effettivamente ruotate, il guscio dell'uovo può essere contrassegnato con una "X" e una "O" sui due lati laterali opposti utilizzando una matita o un pennarello. La finestra di vetro nel coperchio dell'incubatrice consente di controllare la rotazione delle uova senza aprire il dispositivo.

3. Aprire il guscio d'uovo il giorno 3 di DE

NOTA: Una finestra rettangolare viene realizzata nel guscio d'uovo il giorno 3 di ED.

  1. Preparare la cappa a flusso laminare per lavorare in condizioni sterili. Posizionare i seguenti strumenti sotto il cofano e disinfettarli con etanolo al 70% (se non già sterilizzati):
    -Portauova
    -Candela a uovo o fonte di luce fredda focale
    -Marcatore
    -Perno dritto sterile
    -Ago sterile da 19 G
    -Siringa sterile da 5 mL
    -Lama per sega a traforo
    -Pinza sterile
    -Nastro adesivo
  2. Trasferisci un uovo dall'incubatrice al portauova posto sotto il cofano e spegni il rotatore delle uova.
  3. Al buio, identifica la sacca d'aria dell'uovo posizionando la candela dell'uovo (o la fonte di luce fredda focale) contro il guscio dell'uovo. La sacca d'aria è localizzata all'estremità smussata dell'uovo. Usa un pennarello per individuare il centro della sacca d'aria sul guscio d'uovo.
  4. Accendi le luci. Fai un piccolo foro nel guscio d'uovo dove viene segnato ruotando delicatamente uno spillo dritto sterile. Di solito è sufficiente una piccola apertura di circa 1 mm di diametro.
    NOTA: Fare attenzione a non spingere lo spillo fino in fondo attraverso l'uovo. Se ciò accade, scarta l'uovo.
  5. Collegare un ago sterile da 19 G a una siringa sterile da 5 ml.
  6. Al buio, individuare il sacco vitellino utilizzando la candela dell'uovo (o una fonte di luce fredda focale) e forare l'uovo attraverso il foro praticato al punto 3.4 con l'ago sterile da 19 G inclinato a 45° verso il fondo dell'uovo; Fare molta attenzione a non rompere il sacco vitellino. Aspirare tra 1,5-2 mL di albume per staccare il CAM dal guscio, quindi chiudere il foro con un pezzo di nastro adesivo.
    NOTA: Se il sacco vitellino viene interrotto durante l'aspirazione, il liquido aspirato nella siringa sarà di colore giallo anziché trasparente (albume). In tal caso, sostituire l'ago e la siringa. Se viene aspirata una quantità relativamente grande di tuorlo d'uovo, può mettere a repentaglio la vitalità dell'embrione.
  7. Accendi le luci. Posiziona l'uovo orizzontalmente e disegna una finestra rettangolare di 1 cm x 1,5 cm con un pennarello. Non ingrandire la finestra rispetto alla larghezza abituale del nastro adesivo standard.
  8. Tieni l'uovo in una mano e sega delicatamente la finestra precedentemente disegnata nel guscio dell'uovo usando una lama per sega a traforo. Assicurarsi che il guscio non si rompa e non tagliare fino al CAM depresso. Soffiare regolarmente per rimuovere polvere e detriti del guscio.
  9. Far scorrere la pinza sterile sotto il pezzo rettangolare del guscio segato e afferrarla abilmente per rimuoverla in modo pulito senza danneggiare il CAM. Inoltre, scartare la membrana esterna bianca per poter vedere l'embrione e la sua CAM.
    NOTA: Se un po' di polvere o detriti di guscio d'uovo cadono sul CAM, è possibile rimuoverlo utilizzando una pinza sterile, facendo molta attenzione a non strappare il CAM.
  10. Identificare gli ovuli embrionati vitali. Sono distinguibili dal loro albume chiaro e dall'anello vascolare intorno all'embrione, dove a volte può essere rilevato un battito cardiaco anche in questa fase (giorno 3 della DE). Scartare gli embrioni non fecondati o morti.
  11. Posiziona del nastro adesivo sulla finestra appena creata per evitare la disidratazione. Assicurati di piegare un'estremità su se stessa per facilitare la rimozione.
  12. Rimetti l'uovo nell'incubatrice con la finestra aperta rivolta verso l'alto e il nastro adesivo che non tocca il CAM. Usa un pezzo di carta piegato o parte della griglia per uova per evitare che l'uovo rotoli. Assicurarsi che il vassoio rotante sia spento.
  13. Ripetere i passaggi 3.2-3.12 per aprire le uova rimanenti.

4. Innesto di tessuto ovarico umano congelato-scongelato nella CAM

NOTA: Il trapianto alla CAM dovrebbe idealmente essere iniziato tra i giorni 7-10 della DE.

  1. Scongelare le strisce corticali ovariche crioconservate sotto la cappa a flusso laminare seguendo il protocollo descritto altrove30.
  2. Tagliare le strisce corticali in tre frammenti di 4 mm x 2 mm x 1 mm. Utilizzare un pezzo come controllo non innestato e gli altri due per lo xenotrapianto per 1 giorno o 6 giorni.
    NOTA: Se è disponibile una quantità sufficiente di tessuto, lavorare in duplicato.
  3. Trasferisci un uovo dall'incubatrice al portauova posizionato sotto il cofano, con la finestra rivolta verso l'alto.
  4. Stacca il nastro adesivo dalla finestra e assicurati che l'embrione sia vitale. In questa fase, gli embrioni vitali sono caratterizzati da un'ampia vascolarizzazione, un albume chiaro, un battito cardiaco visibile e un certo movimento embrionale.
  5. Preparare il sito di innesto traumatizzando delicatamente una piccola area della CAM posando una striscia di 1 cm2 di carta sterile per lenti estratta con etere sulla superficie epiteliale e rimuovendola immediatamente.
    NOTA: La CAM è una barriera impenetrabile a meno che la membrana non sia stata traumatizzata dall'asportazione della parte peridermica superiore del doppio strato epiteliale, lasciando intatto lo strato basale. Questa tecnica migliora anche il processo di rivascolarizzazione attivando la guarigione delle ferite. Se la carta sterile estratta con etere rimane troppo a lungo sulla CAM, la membrana potrebbe aderire alla carta della lente e strapparsi. Se ciò accade, scarta l'uovo.
  6. Afferrare una striscia corticale ovarica congelata e scongelata (4 mm x 2 mm x 1 mm) con una pinza microchirurgica e posizionarla sulla CAM traumatizzata con il lato midollare contro la CAM. Innestare un pezzo di tessuto per ovulo.
  7. Copri la finestra con del nastro adesivo e rimetti con cura l'uovo nell'incubatrice. Assicurati che l'apertura del guscio d'uovo sia in posizione verticale e che l'uovo sia sicuro.
  8. Ripetere i passaggi 4.1-4.7 per l'innesto di tutti i tessuti rimanenti.
    NOTA: Gli impianti devono essere controllati ogni giorno di innesto per valutare la vitalità dell'embrione e monitorare i cambiamenti nel sistema vascolare.

5. Raccolta degli innesti

NOTA: Gli xenotrapianti devono essere prelevati al più tardi entro il 17° giorno di DE, poiché il sistema immunitario dell'embrione diventa maturo e competente a partire dal 18° giorno.

  1. Posiziona l'uovo su una griglia e ingrandisci la finestra nel guscio dell'uovo per consentire una migliore visualizzazione dell'innesto e una più facile manipolazione.
  2. Valutare macroscopicamente l'innesto, e prestare particolare attenzione alla reazione vascolare della CAM nei confronti dell'innesto. Scatta fotografie o video digitali per la registrazione.
  3. Afferrare il tessuto o la CAM circostante con una pinza e utilizzare le forbici o un bisturi per asportare con attenzione l'innesto dalla CAM.
    NOTA: Gli innesti vengono ricoperti da un secondo strato di CAM intorno al 3° giorno dell'innesto e alla fine vengono incapsulati. Potrebbero anche essersi spostati all'interno dell'uovo entro il 6° giorno, rendendo difficile il loro recupero in alcuni casi.
  4. Analizzare i tessuti asportati con qualsiasi metodo appropriato per l'esperimento dato. Nel presente studio, pezzi di tessuto sono stati fissati in paraformaldeide, inclusi in paraffina e colorati con ematossilina ed eosina seguendo i passaggi descritti di seguito:
    1. Fissare i frammenti in paraformaldeide al 4% per 24 ore e incorporarli in paraffina utilizzando un dispositivo di inclusione automatica con i passaggi indicati nella Tabella 1.
    2. Lasciare i blocchi incorporati in paraffina per una notte a 4°C prima di tagliarli in sezioni spesse 5 μm con un microtomo.
    3. Stendere le sezioni di tessuto su un vetrino posto su una piastra calda (30 °C) e lasciarle asciugare per 2 ore, seguite da 24 ore in forno a 37 °C.
    4. Successivamente, colorare i vetrini con ematossilina ed eosina seguendo un protocollo descritto altrove31. Successivamente, digitalizzare i campioni utilizzando uno scanner per vetrini e analizzarli utilizzando un software di analisi delle immagini.

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Risultati

Tassi di sopravvivenza degli embrioni di pulcino
Il tasso di sopravvivenza dell'embrione dal windowing (giorno 3 di PS) all'innesto di tessuto ovarico (giorno 7 di PS) è stato del 79% (33/42). Poiché la percentuale di uova embrionate al giorno 0 non è nota, sono state ordinate uova soprannumerarie al giorno 0 di galline bianche livornesi selezionate da Lohman per garantire che fosse disponibile un numero sufficiente di uova embrionate per l'innesto. Un totale di 23 ovuli vitali al giorno 7 sono stati ...

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Discussione

La parte più impegnativa del protocollo qui descritto è fare il piccolo foro necessario per aspirare l'albume al fine di staccare il CAM dal guscio d'uovo prima di creare una finestra. L'applicazione di una pressione eccessiva può provocare una penetrazione eccessiva o addirittura rompere e distruggere l'uovo, causando danni irreversibili alla CAM e alla sua vascolarizzazione. Per ridurre al minimo gli errori durante i tentativi iniziali di separare la CAM, si consiglia vivamente di esercitarsi a praticare piccoli fori n...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Gli autori ringraziano Mira Hryniuk, BA, per aver revisionato la lingua inglese dell'articolo.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Ago ipodermico Agani, 19 GTerumo EuropeAN*1950R1Ago da 19 G per aspirare l'albume
Siringa Terumo, 5 mL Luer lock concentricoTerumo EuropeSS*05LE1Siringa sterile da 5 ml
Caseviewer v2.23DHISTECHSoftware di analisi delle immagini
Etere etilicoMerck Chemicals603-022-00-4Etere sterile per traumatizzare il CAM
Eosina Y soluzione acquosa 0,5%Merck1098441000Soluzione colorante
Formaldeide 4% soluzione acquosa tamponata (Formalina 10%)VWR97139010Formaldeide utilizzata per la fissazione dei tessuti
FrigoriferoLiebherr7081260Frigorifero a 4 gradi; C utilizzato per l'inclusione di paraffina
Piastra riscaldanteSchottSLK2Piastra riscaldante utilizzata per asciugare i vetrini
IncubatoreThermo Forma Scientific 311110365156Forno utilizzato per l'incubazione dei vetrini
Microscopio Leica CLS 150 XE Sorgente di luce freddaLeicaCLS 150 XESorgente di luce fredda focale per candele
Panno per la pulizia delle lenti, grado 541VWR111-5003Tessuto da immergere in etere sterile per traumatizzare
l'ematossilinaMERCKdi1092491000 Soluzione colorante
MetanoloVWR20847307Metanolo
ThermoScientific-MICROMHM325-2Microtomo
Pannoramico P250 Flash III3DHISTECH/Scanner per vetrini con ingrandimento 20x
Paraformaldeide Merck1,04,00,51,000Soluzione per inclusione di paraffina
Paraplast Plus RSigmaP3683-1KGPiastra di Petri per paraffina
, 60x15 mm, sterileGreiner628161Piastra di Petri sterile
PortaspilliFine Science Tools26016-12Portaspilli
PolyhatchBrinseaCP01FIncubatrice per uova con rotatore automatico
Lama per sega a traforo, 132 mmSencys/Lama per creare una finestra nel guscio d'uovo
Perni di inserimento in acciaio inoxFine Science Tools26007-02Perno dritto per fare un foro nel guscio d'uovo
Steril-Helios Angelantoni IndustrieST-00275400000Cappa a flusso laminare
Superfrost Plus bords rodé s 90°VWR631-9483Vetrini
Tissue-Tek VIP 6AlSakura60320417-0711 VID6E3-1Dispositivo di inclusione automatica
Pinze in titanioStrumenti di scienza fine11602-16Pinze per la rimozione del guscio d'uovo e la manipolazione del tessuto ovarico
Toluene, paVWR28701364Soluzione di inclusione della paraffina
Mayer MERCK

Riferimenti

  1. Cacciottola, L., Donnez, J., Dolmans, M. M. Ovarian tissue and oocyte cryopreservation prior to iatrogenic premature ovarian insufficiency. Best Practice & Research Clinical Obstetrics & Gynaecology. 81, 119-133 (2022).
  2. Dolmans, M. -M., Hossay, C., Nguyen, T. Y. T., Poirot, C. Fertility preservation: How to preserve ovarian function in children, adolescents and adults. Journal of Clinical Medicine. 10 (22), 5247(2021).
  3. Donnez, J., Dolmans, M. -M. Fertility preservation in women. New England Journal of Medicine. 377 (17), 1657-1665 (2017).
  4. Donnez, J., Dolmans, M. -M. Fertility preservation in women. Nature Reviews Endocrinology. 9 (12), 735-749 (2013).
  5. Dolmans, M. -M., et al. Transplantation of cryopreserved ovarian tissue in a series of 285 women: a review of five leading European centers. Fertility and Sterility. 115 (5), 1102-1115 (2021).
  6. Shapira, M., Dolmans, M. -M., Silber, S., Meirow, D. Evaluation of ovarian tissue transplantation: results from three clinical centers. Fertility and Sterility. 114 (2), 388-397 (2020).
  7. Jensen, A. K., et al. Outcomes of transplantations of cryopreserved ovarian tissue to 41 women in Denmark. Human Reproduction. 30 (12), 2838-2845 (2015).
  8. Vander Ven, H., et al. Ninety-five orthotopic transplantations in 74 women of ovarian tissue after cytotoxic treatment in a fertility preservation network: Tissue activity, pregnancy and delivery rates. Human Reproduction. 31 (9), 2031-2041 (2016).
  9. Diaz-Garcia, C., et al. Oocyte vitrification versus ovarian cortex transplantation in fertility preservation for adult women undergoing gonadotoxic treatments: A prospective cohort study. Fertility and Sterility. 109 (3), 478-485 (2018).
  10. Nisolle, M., Casanas-Roux, F., Qu, J., Motta, P., Donnez, J. Histologic and ultrastructural evaluation of fresh and frozen-thawed human ovarian xenografts in nude mice. Fertility and Sterility. 74 (1), 122-129 (2000).
  11. Van Eyck, A. -S., et al. Electron paramagnetic resonance as a tool to evaluate human ovarian tissue reoxygenation after xenografting. Fertility and Sterility. 92 (1), 374-381 (2009).
  12. Van Eyck, A. -S., et al. Both host and graft vessels contribute to revascularization of xenografted human ovarian tissue in a murine model. Fertility and Sterility. 93 (5), 1676-1685 (2010).
  13. Hossay, C., et al. Can frozen-thawed human ovary withstand refreezing-rethawing in the form of cortical strips. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 37 (12), 3077-3087 (2020).
  14. Manavella, D. D., et al. Two-step transplantation with adipose tissue-derived stem cells increases follicle survival by enhancing vascularization in xenografted frozen-thawed human ovarian tissue. Human Reproduction. 33 (6), 1107-1116 (2018).
  15. Rahimi, G., et al. Re-vascularisation in human ovarian tissue after conventional freezing or vitrification and xenotransplantation. European Journal of Obstetrics & Gynecology and Reproductive Biology. 149 (1), 63-67 (2010).
  16. Cacciottola, L., Manavella, D. D., Amorim, C. A., Donnez, J., Dolmans, M. -M. In vivo characterization of metabolic activity and oxidative stress in grafted human ovarian tissue using microdialysis. Fertility and Sterility. 110 (3), 534-544 (2018).
  17. Gavish, Z., et al. Follicle activation is a significant and immediate cause of follicle loss after ovarian tissue transplantation. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 35 (1), 61-69 (2018).
  18. Masciangelo, R., Hossay, C., Donnez, J., Dolmans, M. -M. Does the Akt pathway play a role in follicle activation after grafting of human ovarian tissue. Reproductive BioMedicine Online. 39 (2), 196-198 (2019).
  19. Fortune, J. E., Cushman, R. A., Wahl, C. M., Kito, S. The primordial to primary follicle transition. Molecular and Cellular Endocrinology. (1-2), 53-60 (2000).
  20. Cushman, R. A. Bovine ovarian cortical pieces grafted to chick embryonic membranes: A model for studies on the activation of primordial follicles. Human Reproduction. 17 (1), 48-54 (2002).
  21. Gigli, I., Cushman, R. A., Wahl, C. M., Fortune, J. E. Evidence for a role for anti-Müllerian hormone in the suppression of follicle activation in mouse ovaries and bovine ovarian cortex grafted beneath the chick chorioallantoic membrane. Molecular Reproduction and Development. 71 (4), 480-488 (2005).
  22. Qureshi, A. I., et al. Testosterone selectively increases primary follicles in ovarian cortex grafted onto embryonic chick membranes: relevance to polycystic ovaries. Reproduction. 136 (2), 187-194 (2008).
  23. Martinez-Madrid, B., et al. Chick embryo chorioallantoic membrane (CAM) model: A useful tool to study short-term transplantation of cryopreserved human ovarian tissue. Fertility and Sterility. 91 (1), 285-292 (2009).
  24. Hossay, C., et al. Follicle outcomes in human ovarian tissue: Effect of freezing, culture, and grafting. Fertility and Sterility. 119 (1), 135-145 (2023).
  25. Ribatti, D. The Chick Embryo Chorioallantoic Membrane in the Study of Angiogenesis and Metastasis. , Springer. Dordrecht, the Netherlands. (2010).
  26. Pawlikowska, P., et al. Exploitation of the chick embryo chorioallantoic membrane (CAM) as a platform for anti-metastatic drug testing. Scientific Reports. 10 (1), 16876(2020).
  27. Davison, T. F. The immunologists' debt to the chicken. British Poultry Science. 44 (1), 6-21 (2003).
  28. Schilling, M. A., et al. Transcriptional innate immune response of the developing chicken embryo to Newcastle disease virus infection. Frontiers in Genetics. 9, 61(2018).
  29. Directives originating from the EU. Directive 2010/63/EU of the European Parliament and of the Council of 22 September 2010 on the protection of animals used for scientific purposes (Text with EEA relevance). The National Archives. , Available from: https://www.legislation.gov.uk/eudr/2010/63/contents (2010).
  30. Dolmans, M. -M., et al. A review of 15 years of ovarian tissue bank activities. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 30 (3), 305-314 (2013).
  31. Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. Cold Spring Harbor Protocols. 2008 (5), 4986(2008).
  32. Anderson, R. A., McLaughlin, M., Wallace, W. H. B., Albertini, D. F., Telfer, E. E. The immature human ovary shows loss of abnormal follicles and increasing follicle developmental competence through childhood and adolescence. Human Reproduction. 29 (1), 97-106 (2014).
  33. Sharrow, A. C., Ishihara, M., Hu, J., Kim, I. H., Wu, L. Using the chicken chorioallantoic membrane in vivo model to study gynecological and urological cancers. Journal of Visualized Experiments. (155), e60651(2020).
  34. Lokman, N. A., Elder, A. S. F., Ricciardelli, C., Oehler, M. K. Chick chorioallantoic membrane (CAM) assay as an in vivo model to study the effect of newly identified molecules on ovarian cancer invasion and metastasis. International Journal of Molecular Sciences. 13 (8), 9959-9970 (2012).
  35. Sys, G. M. L., et al. The In ovo CAM-assay as a xenograft model for sarcoma. Journal of Visualized Experiments. (77), e50522(2013).
  36. Li, M., et al. The in ovo chick chorioallantoic membrane (CAM) assay as an efficient xenograft model of hepatocellular carcinoma. Journal of Visualized Experiments. (104), e52411(2015).
  37. Cloney, K., Franz-Odendaal, T. A. Optimized ex-ovo culturing of chick embryos to advanced stages of development. Journal of Visualized Experiments. (95), e52129(2015).
  38. Yalcin, H. C., Shekhar, A., Rane, A. A., Butcher, J. T. An ex-ovo chicken embryo culture system suitable for imaging and microsurgery applications. Journal of Visualized Experiments. (44), e2154(2010).
  39. Schomann, T., Qunneis, F., Widera, D., Kaltschmidt, C., Kaltschmidt, B. Improved method for ex ovo-cultivation of developing chicken embryos for human stem cell xenografts. Stem Cells International. 2013, 960958(2013).
  40. Beck, K., Singh, J., Dar, M. A., Anzar, M. Short-term culture of adult bovine ovarian tissues: chorioallantoic membrane (CAM) vs. traditional in vitro culture systems. Reproductive Biology and Endocrinology. 16 (1), 21(2018).
  41. Israely, T., Nevo, N., Harmelin, A., Neeman, M., Tsafriri, A. Reducing ischaemic damage in rodent ovarian xenografts transplanted into granulation tissue. Human Reproduction. 21 (6), 1368-1379 (2006).
  42. Donnez, J., et al. Livebirth after orthotopic transplantation of cryopreserved ovarian tissue. The Lancet. 364 (9443), 1405-1410 (2004).
  43. Dolmans, M. -M., et al. Short-term transplantation of isolated human ovarian follicles and cortical tissue into nude mice. Reproduction. 134 (2), 253-262 (2007).
  44. Baird, D. T., Webb, R., Campbell, B. K., Harkness, L. M., Gosden, R. G. Long-term ovarian function in sheep after ovariectomy and transplantation of autografts stored at −196 C. Endocrinology. 140 (1), 462-471 (1999).
  45. Ribatti, D., Vacca, A., Roncali, L., Dammacco, F. The chick embryo chorioallantoic membrane as a model for in vivo research on anti-angiogenesis. Current Pharmaceutical Biotechnology. 1 (1), 73-82 (2000).

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