Gli organoidi derivati dal paziente (PDO) sono una coltura tridimensionale (3D) che può imitare l'ambiente tumorale in vitro. Nel carcinoma ovarico sieroso di alto grado, le DOP rappresentano un modello per studiare nuovi biomarcatori e terapie.
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Articolo metodologico
Generazione e coltura di organoidi di alto grado derivati da pazienti con carcinoma ovarico sieroso
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Gli organoidi sono modelli tumorali dinamici 3D che possono essere coltivati con successo da tessuto tumorale ovarico derivato dal paziente, ascite o liquido pleurico e aiutano nella scoperta di nuove terapie e biomarcatori predittivi per il cancro ovarico. Questi modelli ricapitolano l'eterogeneità clonale, il microambiente tumorale e le interazioni cellula-cellula e cellula-matrice. Inoltre, hanno dimostrato di corrispondere al tumore primario morfologicamente, citologicamente, immunoistochimicamente e geneticamente. Pertanto, gli organoidi facilitano la ricerca sulle cellule tumorali e sul microambiente tumorale e sono superiori alle linee cellulari. Il presente protocollo descrive metodi distinti per generare organoidi di cancro ovarico derivati dal paziente da tumori del paziente, ascite e campioni di liquido pleurico con un tasso di successo superiore al 97%. I campioni del paziente vengono separati in sospensioni cellulari mediante digestione meccanica ed enzimatica. Le cellule vengono quindi placcate utilizzando un estratto di membrana basale (BME) e sono supportate con terreni di crescita ottimizzati contenenti integratori specifici per la coltura del carcinoma ovarico sieroso di alto grado (HGSOC). Dopo aver formato gli organoidi iniziali, le DOP possono sostenere la cultura a lungo termine, incluso il passaggio per l'espansione per esperimenti successivi.
Introduzione
Nel 2021, circa 21.410 donne negli Stati Uniti sono state diagnosticate di recente con cancro ovarico epiteliale e 12.940 donne sono morte di questa malattia1. Sebbene siano stati fatti progressi sufficienti in chirurgia e chemioterapia, oltre il 70% dei pazienti con malattia avanzata sviluppa resistenza chemioterapica e muore entro 5 anni dalla diagnosi 2,3. Pertanto, sono urgentemente necessarie nuove strategie per trattare questa malattia mortale e modelli rappresentativi e affidabili per la ricerca preclinica.
Le linee cellulari tumorali e gli xenotrapian....
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Protocollo
Tutti i campioni di tessuto umano raccolti per la ricerca sono stati ottenuti secondo il protocollo approvato dall'Institutional Review Board (IRB). I protocolli descritti di seguito sono stati eseguiti in un ambiente di coltura di tessuti umani sterili. Il consenso scritto informato è stato ottenuto da soggetti umani. Le pazienti eleggibili dovevano avere una diagnosi o una presunta diagnosi di cancro ovarico, essere disposte e in grado di firmare il consenso informato e avere almeno 18 anni di età. Il tessuto tumorale (tumore primario maligno o siti metastatici), ascite e liquido pleurico sono stati ottenuti da pazienti consenzienti al momento della procedura. Quest....
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Risultati
Per generare PDO, i campioni sono stati digeriti meccanicamente ed enzimaticamente in sospensioni monocellulari. Le cellule sono state quindi risospese in BME e integrate con mezzi specificamente ingegnerizzati (Figura 3). Gli organoidi sono tipicamente stabiliti in un arco di tempo di 10 giorni, dopo di che dimostrano organoidi discreti in coltura (Figura 4).
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Discussione
Il cancro ovarico è estremamente mortale a causa del suo stadio avanzato alla diagnosi, così come lo sviluppo comune della resistenza alla chemioterapia. Molti progressi nella ricerca sul cancro ovarico sono stati fatti utilizzando linee cellulari tumorali e modelli PDX; Tuttavia, vi è un'evidente necessità di un modello in vitro più rappresentativo e conveniente. Le PDO hanno dimostrato di rappresentare accuratamente l'eterogeneità del tumore, il microambiente tumorale e le caratteristiche genomiche e trascritt.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Siamo grati per la guida di Ron Bose, MD, PhD, e l'assistenza di Barbara Blachut, MD, nello stabilire questo protocollo. Vorremmo anche riconoscere la Scuola di Medicina della Washington University nel Dipartimento di Ostetricia e Ginecologia di St. Louis e la Divisione di Oncologia Ginecologica, il Dean's Scholar Program della Washington University e il Reproductive Scientist Development Program per il loro sostegno a questo progetto.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 1% HEPES | Life Technologies | 15630080 | |
| 1% Penicillina-Streptomicina | Fisher Scientific | 30002CI | |
| 1,5 mL Provette Eppendorf | Genesee Scientific | 14125 | |
| Piatto per coltura tissutale da 10 cm | TPP | 93100 | |
| 10 mL Pipetta | |||
| 100 µ m Cell Filter | MidSci | 100ICS | |
| 15 mL provette da centrifuga | Corning | 430052 | |
| 2 mL Cryovial | Simport Scientific | T301-2 | |
| 2% Paraformaldeide Fissativo | Sigma-Aldrich | ||
| 37 ° C bagnomaria | NEST | 602052 | |
| 3dGRO R-Spondin-1 Integratore per terreni condizionati | Millipore Sigma | SCM104 | |
| Piastre a 6 pozzetti | TPP | 92006 | |
| 70% Etanolo | Sigma-Aldrich | R31541GA | |
| A83-01 | Sigma-Aldrich | SML0788 | |
| Advanced DMEM/F12 | ThermoFisher | 12634028 | |
| Centrifuga Agar | Lamda Biotech | C121 | |
| B-27 | Life Technologies | 17504044 | |
| Cultrex Tipo 2 | R& D Systems | 3533-010-02 | estratto di membrana basale |
| DNase I | New England Bio Labs | M0303S | |
| DNase I Buffer di reazione | New England Bio Labs | M0303S | |
| EGF | PeproTech | AF-100-15 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| FGF-10 | PeproTech | 100-26 | |
| FGF2 | PeproTech | 100-18B | |
| gentleMACS C Tubes | Miltenyi BioTech | 130-096-334 | |
| gentleMACS Octo Dissociatore con riscaldatori | Miltenyi BioTech | 130-096-427 | Utilizziamo il protocollo del produttore. |
| per | 35050061 | dipeptide, L-alanil-L-glutammina | |
| ematossilina ed eosina | Scientific NC1470670 | ||
| Histoplast Cera di paraffina | Fisher Scientific | 22900700 | |
| Contenitore di congelamento Mr. Frosty | Fisher Scientific | 07202363S | |
| N-acetilcisteina | Sigma-Aldrich | A9165 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | |
| p1000 Pipetta con punte | |||
| p200 Pipetta con puntali | |||
| Pipette Pasteur 9" | Fisher Scientific | 1367820D | |
| PBS | Fisher Scientific | MT21031CM | |
| Pipet Controller | |||
| Prostaglandin E2 | R& D Systems | 2296 | |
| Puromicina | ThermoFisher | A1113802 | |
| Noggin murino ricombinante | PeproTech | 250-38 | |
| Coltura cellulare di recupero Mezzo di congelamento | Invitrogen | 12648010 | |
| tampone per lisi dei globuli rossi BioLegend | 420301 | ||
| Inibitore ROCK (Y-27632) | R& D Systems | 1254/1 | |
| SB202190 | Sigma-Aldrich | S7076 | |
| T75 Flask | MidSci | TP90076 | |
| cappa per coltura tissutale | |||
| inclusione tissutale | |||
| TrypLE Express | Invitrogen | 12604013 | enzima ricombinante di tipo II privo di origine animale |
| Collagenase | Life Technologies | 17101015 | |
| Vortex |
Riferimenti
- Bray, F., et al. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (6), 394-424 (2018).
- Drost, J., Clevers, H. Organ....
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Ristampe e permessi
