Il presente protocollo descrive i metodi per valutare le proteine di riparazione del danno al DNA negli organoidi di cancro ovarico derivati da pazienti. Qui sono inclusi metodi completi di placcatura e colorazione, nonché procedure di quantificazione dettagliate e oggettive.
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Articolo metodologico
Visualizzazione delle proteine di riparazione del danno al DNA negli organoidi del cancro ovarico derivati dal paziente tramite saggi di immunofluorescenza
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'immunofluorescenza è una delle tecniche più utilizzate per visualizzare antigeni bersaglio con elevata sensibilità e specificità, consentendo l'identificazione accurata e la localizzazione di proteine, glicani e piccole molecole. Mentre questa tecnica è ben consolidata nella coltura cellulare bidimensionale (2D), si sa meno del suo uso in modelli cellulari tridimensionali (3D). Gli organoidi del cancro ovarico sono modelli tumorali 3D che ricapitolano l'eterogeneità clonale delle cellule tumorali, il microambiente tumorale e le interazioni cellula-cellula e cellula-matrice. Pertanto, sono superiori alle linee cellulari per la valutazione della sensibilità ai farmaci e dei biomarcatori funzionali. Pertanto, la capacità di utilizzare l'immunofluorescenza sugli organoidi del cancro ovarico primario è estremamente utile per comprendere la biologia di questo cancro. L'attuale studio descrive la tecnica di immunofluorescenza per rilevare le proteine di riparazione del danno al DNA in organoidi di cancro ovarico (PDO) sierosi di alto grado derivati da pazienti. Dopo aver esposto le DOP a radiazioni ionizzanti, l'immunofluorescenza viene eseguita su organoidi intatti per valutare le proteine nucleari come focolai. Le immagini vengono raccolte utilizzando l'imaging z-stack al microscopio confocale e analizzate utilizzando un software di conteggio automatico dei fuochi. I metodi descritti consentono l'analisi del reclutamento temporale e speciale di proteine di riparazione del danno al DNA e la colocalizzazione di queste proteine con marcatori del ciclo cellulare.
Introduzione
Il cancro ovarico è la principale causa di morte a causa di tumori maligni ginecologici. La maggior parte dei pazienti è trattata con farmaci dannosi per il DNA come il carboplatino, e quelli con tumori con deficit di riparazione della ricombinazione omologa (HRR) possono ricevere inibitori della poli (ADP-ribosio) polimerasi (PARP) 1,2. Tuttavia, la maggior parte dei pazienti sviluppa resistenza a queste terapie e muore entro 5 anni dalla diagnosi. La disregolazione della risposta al danno del DNA (DDR) è stata associata allo sviluppo del cancro ovarico e alla chemioterapia e alla resistenza agli inibitori di....
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Protocollo
Il tessuto tumorale e l'ascite sono stati ottenuti dopo aver ottenuto il consenso del paziente come parte di un biorepository di oncologia ginecologica approvato dal Washington University in St. Louis Institutional Review Board (IRB). Le pazienti sono state incluse se avevano un carcinoma ovarico sieroso di alto grado in stadio avanzato (HGSOC). Tutte le procedure sono state eseguite a temperatura ambiente sul banco, se non diversamente specificato. Tutti i reagenti sono stati preparati a temperatura ambiente (salvo diversa indicazione) e conservati a 4 °C.
1. Generazione di organoidi
- Generare gli organoidi seguen....
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Risultati
Il protocollo presentato può colorare, visualizzare e quantificare con successo le proteine di riparazione del danno al DNA nucleare negli organoidi. Questa tecnica è stata utilizzata per colorare e valutare le DOP sia prima che dopo l'irradiazione. Le PDO sono state esposte a 10 Gy di radiazioni e valutate per i seguenti biomarcatori: ɣ-H2AX (Figura 1), un marker di danno al DNA; RAD51 (Figura 2), un indicatore per HRR; 53BP1, un marcatore di NHEJ; RPA, un mark.......
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Discussione
La risposta al danno del DNA svolge un ruolo fondamentale sia nello sviluppo del cancro ovarico che nella resistenza alla chemioterapia. Pertanto, una conoscenza approfondita dei meccanismi di riparazione del DNA è imperativa. Qui viene presentata una metodologia per studiare le proteine di riparazione del danno al DNA in organoidi intatti 3D. Viene sviluppato un protocollo riproducibile e affidabile che utilizza anticorpi caratteristici per valutare il danno al DNA, la ricombinazione omologa, l'unione finale non omologa.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Siamo grati per la guida di Pavel Lobachevsky, PhD nello stabilire questo protocollo. Vorremmo anche ringraziare la School of Medicine della Washington University nel Dipartimento di Ostetricia e Ginecologia di St. Louis e la Divisione di Oncologia Ginecologica, il Dean's Scholar Program della Washington University, la Gynecologic Oncology Group Foundation e il Reproductive Scientist Development Program per il loro sostegno a questo progetto.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 1x soluzione salina tamponata con fosfato con calcio e magnesio (PBS++) | Sigma | 14-040-133 | |
| 1x soluzione salina tamponata con fosfato senza calcio e magnesio (PBS) | Fisher Scientific | ||
| Anticorpo Ant-53BP1 | BD Biosciences | 612522 | diluito a 1:500 in tampone di colorazione |
| Anticorpo anti-geminina | Abcam | ab104306 | diluito a 1:200 in tampone di colorazione |
| Anticorpo Anti-Geminina | ProteinTech | 10802-1-AP | diluito a 1:400 in tampone di colorazione |
| Anti-RAD51 Antibody | Abcam | ab133534 | diluito a 1:1000 in tampone di colorazione |
| Anti-yH2AX Antibody | Millipore-Sigma | 05-636 | diluito a 1:500 in tampone di colorazione |
| Anticorpo Ant-fosfo-RPA32 (S4/S8) Laboratori | di Betal. | A300-245A-M | diluito a 1:200 in tampone di colorazione |
| Albumina sierica bovina (BSA) | Fisher Scientific | BP1605 100 | |
| Centrifuga; Sorvall St 16R Centrifuga | Thermo Scientific | ||
| Microscopio confocale, sistema confocale Leica SP5 DMI4000 | Leica | ||
| Provette coniche, 15 mL | Corning | 14-959-53A | |
| Contacellule automatizzato Countess 3 FL (macchina contacellule) | Thermo Scientific | ||
| Countess Camera di Conteggio Cellule Vetrini | Thermo Scientific | C10228 | |
| Vetrino coprioggetto | LA Colors | Qualsiasi smalto trasparente sarà sufficiente | |
| Cultrex Estratto di membrana basale RGF, tipo 2 | R& Sistemi D | 3533-010-02 | Probabilmente potrebbe utilizzare Matrigel o un'altra matrice BME |
| DAPI | Thermo Scientific | R37606 | Reagente NucBlue Fixed Cell ReadyProbes, diluito in 1x PBS |
| Glicina | Fisher Scientific | ||
| JCountPro | JCountPro | Per accedere al software, Email: jcountpro@gmail.com | |
| Provette per microcentrifuga | Fisher Scientific | 07-000-243 | |
| Smalto per unghie | StatLab | SL102450 | |
| Parafomraldeide (PFA), 2% | Scienze della microscopia elettronica | 157-4 | Diluire al 4% di PFA in PBS++ per ottenere il tampone |
| permeabilizzazione | Prodotto in laboratorio | 0,2% X-100 Triton in PBS++ | |
| Pipetta | Rainin | 17014382 | |
| Puntali per pipette | Rainin | ||
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo Scientific | P36930 | |
| Tampone di colorazione | Prodotto in laboratorio | 0,5% BSA, 0,15% glicina, 0,1% X-100 Triton in PBS++ | |
| Thermo Scientific Sistema di scorrimento a camera Nunc Lab-Tek II | Thermo Scientific | 12-565-8 | |
| Triton X-100 | Sigma-Alderich | ||
| Soluzione di Tripano Blu, 0,4% | Thermo Scientific | ||
| TrypLE | Express Invitrogen | 12604013 | enzima ricombinante |
| X-RAD 320 Biological Irradiator | Irradiazione a raggi X di precisione | X-RAD320 |
Riferimenti
- Lheureux, S., Gourley, C., Vergote, I., Oza, A. M. Epithelial ovarian cancer. Lancet Oncology. 393 (10177), 1240-1253 (2019).
- Tew, W. P., et al. PARP inhibitors in the management of ovarian cancer: ASCO guideline. Journal of Clinical Oncology. 38 (30), 3468-3493 (2....
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Ristampe e permessi
