Method Article

Visualizzazione delle proteine di riparazione del danno al DNA negli organoidi del cancro ovarico derivati dal paziente tramite saggi di immunofluorescenza

DOI:

10.3791/64881

⸱

February 24th, 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Washington University in St. Louis, 2University of California San Francisco

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il presente protocollo descrive i metodi per valutare le proteine di riparazione del danno al DNA negli organoidi di cancro ovarico derivati da pazienti. Qui sono inclusi metodi completi di placcatura e colorazione, nonché procedure di quantificazione dettagliate e oggettive.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L'immunofluorescenza è una delle tecniche più utilizzate per visualizzare antigeni bersaglio con elevata sensibilità e specificità, consentendo l'identificazione accurata e la localizzazione di proteine, glicani e piccole molecole. Mentre questa tecnica è ben consolidata nella coltura cellulare bidimensionale (2D), si sa meno del suo uso in modelli cellulari tridimensionali (3D). Gli organoidi del cancro ovarico sono modelli tumorali 3D che ricapitolano l'eterogeneità clonale delle cellule tumorali, il microambiente tumorale e le interazioni cellula-cellula e cellula-matrice. Pertanto, sono superiori alle linee cellulari per la valutazione della sensibilità ai farmaci e dei biomarcatori funzionali. Pertanto, la capacità di utilizzare l'immunofluorescenza sugli organoidi del cancro ovarico primario è estremamente utile per comprendere la biologia di questo cancro. L'attuale studio descrive la tecnica di immunofluorescenza per rilevare le proteine di riparazione del danno al DNA in organoidi di cancro ovarico (PDO) sierosi di alto grado derivati da pazienti. Dopo aver esposto le DOP a radiazioni ionizzanti, l'immunofluorescenza viene eseguita su organoidi intatti per valutare le proteine nucleari come focolai. Le immagini vengono raccolte utilizzando l'imaging z-stack al microscopio confocale e analizzate utilizzando un software di conteggio automatico dei fuochi. I metodi descritti consentono l'analisi del reclutamento temporale e speciale di proteine di riparazione del danno al DNA e la colocalizzazione di queste proteine con marcatori del ciclo cellulare.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il cancro ovarico è la principale causa di morte a causa di tumori maligni ginecologici. La maggior parte dei pazienti è trattata con farmaci dannosi per il DNA come il carboplatino, e quelli con tumori con deficit di riparazione della ricombinazione omologa (HRR) possono ricevere inibitori della poli (ADP-ribosio) polimerasi (PARP) 1,2. Tuttavia, la maggior parte dei pazienti sviluppa resistenza a queste terapie e muore entro 5 anni dalla diagnosi. La disregolazione della risposta al danno del DNA (DDR) è stata associata allo sviluppo del cancro ovarico e alla chemioterapia e alla resistenza agli inibitori di PARP3. Pertanto, lo studio della DDR è fondamentale per comprendere la fisiopatologia del cancro ovarico, i potenziali biomarcatori e le nuove terapie mirate.

Gli attuali metodi per valutare il DDR utilizzano l'immunofluorescenza (IF), in quanto ciò consente l'identificazione accurata e la localizzazione delle proteine danneggiate dal DNA e degli analoghi nucleotidici. Una volta che c'è una rottura a doppio filamento (DSB) nel DNA, la proteina istonica H2AX viene rapidamente fosforilata, formando un punto focale in cui si riuniscono le proteine di riparazione del danno al DNA4. Questa fosforilazione può essere facilmente identificata utilizzando IF; infatti, il saggio ɣ-H2AX è stato comunemente impiegato per confermare l'induzione di un DSB 5,6,7,8,9. Un aumento del danno al DNA è stato associato alla sensibilità al platino e all'efficacia degli agenti dannosi per il DNA 10,11,12 e ɣ-H2AX è stato proposto come biomarcatore associato alla risposta alla chemioterapia in altri trattamenti antitumorali 13. Su un DSB, una cellula esperta in HRR esegue una serie di eventi che portano BRCA1 e BRCA2 a reclutare RAD51 per sostituire la proteina di replicazione A (RPA) e legarsi al DNA. La riparazione HRR utilizza un modello di DNA per riparare fedelmente il DSB. Tuttavia, quando i tumori sono carenti di HRR, si basano su percorsi di riparazione alternativi come l'unione finale non omologa (NHEJ). NHEJ è noto per essere soggetto a errori e crea un elevato carico mutazionale sulla cellula, che utilizza 53BP1 come regolatore positivo14. Queste proteine danneggiano il DNA possono essere accuratamente identificate come focolai usando IF. Oltre alla colorazione per le proteine, l'IF può essere utilizzato per studiare la protezione della forcella e la formazione di gap di DNA a singolo filamento. La capacità di avere forcelle stabili è stata correlata con la risposta al platino e, recentemente, i saggi gap hanno mostrato il potenziale per prevedere la risposta agli inibitori PARP 6,15,16,17. Pertanto, la colorazione per gli analoghi nucleotidici dopo l'introduzione nel genoma è un altro modo per studiare il DDR.

Ad oggi, la valutazione della DDR nel carcinoma ovarico è stata in gran parte limitata a linee cellulari 2D omogenee che non ricapitolano l'eterogeneità clonale, il microambiente o l'architettura dei tumori in vivo 18,19. Recenti ricerche suggeriscono che gli organoidi sono superiori alle linee cellulari 2D nello studio di processi biologici complessi come i meccanismi DDR6. La presente metodologia valuta RAD51, ɣ-H2AX, 53BP1, RPA e geminina nelle DOP. Questi metodi valutano l'organoide intatto e consentono lo studio dei meccanismi DDR in un contesto più simile al microambiente tumorale in vivo. Insieme alla microscopia confocale e al conteggio automatico dei fuochi, questa metodologia può aiutare a comprendere il percorso DDR nel cancro ovarico e personalizzare i piani di trattamento per le pazienti.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il tessuto tumorale e l'ascite sono stati ottenuti dopo aver ottenuto il consenso del paziente come parte di un biorepository di oncologia ginecologica approvato dal Washington University in St. Louis Institutional Review Board (IRB). Le pazienti sono state incluse se avevano un carcinoma ovarico sieroso di alto grado in stadio avanzato (HGSOC). Tutte le procedure sono state eseguite a temperatura ambiente sul banco, se non diversamente specificato. Tutti i reagenti sono stati preparati a temperatura ambiente (salvo diversa indicazione) e conservati a 4 °C.

1. Generazione di organoidi

  1. Generare gli organoidi seguendo il rapporto precedentemente pubblicato20.

2. Placcatura e irradiazione degli organoidi

  1. Utilizzando organoidi in coltura, rimuovere le linguette degli organoidi dal piatto di coltura attraverso la manipolazione manuale di una punta di pipetta. Raccogliere gli organoidi in un tubo conico da 15 ml.
  2. Centrifugare il tubo conico a 1.650 x g per 5 minuti a 4 °C. Utilizzando una pipetta, aspirare con cautela il surnatante .
  3. Aggiungere 1.000 μL di un enzima ricombinante privo di origine animale al pellet (vedi Tabella dei materiali). Mescolare la soluzione e incubare per 15 minuti a 37 °C.
  4. Centrifugare la soluzione a 1.650 x g per 5 minuti a 4 °C. Utilizzando una pipetta, aspirare con cura il surnatante.
  5. Dopo la centrifugazione e l'aspirazione, risospendere il pellet in 1.000 μL di soluzione salina tamponata fosfato.
  6. Trasferire 10 μL della soluzione in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL e miscelare con 10 μL di tripano blu.
  7. Prelevare 10 μL della soluzione di cella blu di tripano in un vetrino della camera di conteggio delle cellule e inserirlo nella macchina contacelle (vedere Tabella dei materiali).
  8. Placcare 40.000 cellule per 20 μL di estratto di membrana basale (BME) in un vetrino a 8 pozzetti (vedi Tabella dei materiali). Questo mantiene gli organoidi per 3-5 giorni per consentire alle cellule di formare organoidi e crescere fino a una dimensione adeguata.
  9. Per indurre rotture di DNA a doppio filamento, irradiare gli organoidi placcati con 10 Gray (Gy) di ɣ-irradiazione (vedi Tabella dei materiali per i dettagli dell'irradiatore).
    NOTA: Questo potrebbe richiedere fino a 5-10 minuti.
  10. Incubare gli organoidi nei loro terreni di coltura in un incubatore umidificato a 37 °C e 5% di CO2 per 4 ore.

3. Colorazione con immunofluorescenza

NOTA: I volumi si riferiscono alla quantità per pozzetto del vetrino a 8 pozzetti (~300 μL).

  1. Dopo l'irradiazione e l'incubazione degli organoidi, aspirare il mezzo con una pipetta, con attenzione in modo da non interrompere la matrice 3D. Lavare con 300 μL di PBS.
  2. Fissare gli organoidi in 300 μL di paraformaldeide al 2% (PFA) per 10 minuti.
    NOTE: Non lasciare troppo a lungo, poiché il BME si depolimerizza e potrebbe essere aspirato.
  3. Lavare gli organoidi con 300 μL di tampone colorante (vedere Tabella dei materiali). Mettere su uno shaker per 5 min.
  4. Per la permeabilizzazione, aggiungere delicatamente 300 μL di tampone di permeabilizzazione (vedere Tabella dei materiali) e incubare per 20 minuti. Lavare con 300 μL di tampone anticolorante. Mettere su uno shaker per 5 min.
  5. Aggiungere 300 μL di tampone colorante per bloccare la fase di permeabilizzazione. Mettere su uno shaker per 30 minuti. Aspirare il tampone anticolorante con una pipetta.
  6. Aggiungere 300 μL di anticorpi primari (coniglio anti-RAD51, topo anti-Geminina, coniglio anti-RPA, topo anti-ɣH2AX, coniglio anti-Geminina, topo anti-53BP1; vedi Tabella dei materiali) diluiti in tampone colorante. Incubare a 4 °C per 16 h.
    NOTA: Evitare la co-colorazione con lo stesso animale ospite. Lasciare il coperchio spento per evitare che gli anticorpi si mescolino nei pozzetti vicini.
  7. Rimuovere la soluzione anticorpale primaria. Eseguire tre lavaggi con 300 μL di tampone colorante per 5 minuti ciascuno sullo shaker.
  8. Aggiungere 300 μL di soluzione di anticorpi secondari (Alexa fluor 488 anti-topo di capra e Alexa fluor 647 di capra anti-coniglio; vedi tabella dei materiali) diluita in tampone colorante e incubare per 1 ora al buio.
    NOTA: tutti i passaggi successivi devono essere eseguiti al buio.
  9. Aspirare la soluzione anticorpale secondaria. Aggiungere 300 μL di DAPI diluito. Mettere su uno shaker per 5 min.
  10. Eseguire tre lavaggi con 300 μL di tampone colorante per 5 minuti ciascuno sullo shaker. Rimuovere il tampone anticolorante e staccare le camere utilizzando il kit di rimozione fornito con le guide della camera (vedere la tabella dei materiali).
    NOTA: assicurarsi di non spingersi troppo in avanti in modo da interrompere la matrice 3D.
  11. Utilizzando una punta per pipetta p200 con la punta tagliata, aggiungere il mezzo di montaggio (vedere Tabella dei materiali) per coprire ciascun pozzetto con una linguetta organoide (ad esempio, 20-30 μL per ciascuna linguetta organoide).
  12. Posizionare un coprislip sopra il campione, evitando bolle.
  13. Prendi lo smalto trasparente e dipingilo sui lati del vetro di copertura per sigillare il vetrino. Lasciate indurire per 1 ora e disponetelo a -20 °C.
    NOTA: Dopo l'imaging, il vetrino può essere conservato per almeno 6 mesi con una perdita minima di fluorescenza.

4. Imaging

  1. Acquisire immagini utilizzando un microscopio confocale (vedi Tabella dei materiali) con obiettivo 63x con olio ad immersione.
    NOTA: Se si esegue l'imaging delle proteine nucleari, 63x è vantaggioso, ma anche 40x è accettabile.
  2. Utilizzare DAPI per localizzare gli organoidi attraverso l'oculare. Selezionare i filtri appropriati per la microscopia in base ai fluorofori utilizzati. Impostare i parametri per l'acquisizione delle immagini z-stack.
    NOTA: I fluorofori utilizzati nello studio erano DAPI, 488 e 647. I laser 405, 488 e 638 sono stati accesi per visualizzare la colorazione.
    NOTA: lo z-stack consigliato dipende dal potere risolutivo dell'obiettivo.
  3. Regola l'immagine dal vivo: imposta la messa a fuoco, l'intensità del laser, ecc.
    NOTA: maggiore è l'intensità del laser, maggiore è la probabilità che il campione venga foto-sbiancato. Pertanto, selezionare un'intensità laser ottimale.
  4. Acquisire lo z-stack.
    NOTA: Questo potrebbe richiedere fino a 5-10 minuti.
  5. Dalle immagini raccolte nello z-stack, eseguire lo screenshot di almeno tre immagini per stack.
    NOTA: Assicurarsi di ottenere schermate in tutto lo stack in modo da non duplicare i nuclei durante la quantificazione.
  6. Salvare ogni file come file TIFF e procedere all'analisi (passaggio 5).

5. Analisi

NOTA: Utilizzare JCountPro per tutte le analisi delle immagini seguendo il rapporto21 pubblicato in precedenza. Per ottenere questo software, fare riferimento alla pubblicazione associata.

  1. Nel pannello di analisi degli oggetti (nella parte superiore del programma) nella scheda di selezione dei file (nella parte inferiore del programma), selezionare i file TIFF .
  2. Fare clic su Aggiungi per spostare i file selezionati nel gruppo di file selezionati. Seleziona Schermo.
  3. Nella scheda di segmentazione, selezionare il blu come colore dei nuclei. Selezionare Segmentazione automatica per ottimizzare la soglia dei nuclei.
    NOTA: se la segmentazione automatica non identifica accuratamente gli oggetti, l'utente può regolare la regolazione fine e la regolazione non elaborata sull'immagine o consultare il manuale dell'utente per ottimizzare ulteriormente la segmentazione.
  4. Nel pannello oggetti, selezionate Suddivisione automatica oggetti di grandi dimensioni e ottimizzate le dimensioni dei nuclei.
    Nota : i nuclei hanno in genere una dimensione incondizionata di 5.000 pixel, mentre la dimensione condizionale è 1.500 pixel. Consultare il manuale dell'utente per ottimizzare ulteriormente le dimensioni degli oggetti.
  5. Selezionare Identifica oggetti per testare i parametri.
    NOTA: se questi parametri non sono accurati, le dimensioni e la regolazione possono essere regolate insieme ad altre impostazioni. Consultare il manuale dell'utente per istruzioni relative a un'ulteriore ottimizzazione.
  6. Dopo aver regolato i parametri per l'immagine, selezionare Identifica oggetti in tutte le immagini per identificare i nuclei in tutte le immagini selezionate.
  7. Selezionate il pannello Analisi dei fuochi (nella parte superiore del programma).
  8. Nella scheda Seleziona file (nella parte inferiore del programma), selezionare i file TIFF utilizzati per l'analisi degli oggetti e selezionare i pulsanti freccia (>>) per spostare le immagini nel gruppo di file di immagine.
  9. Nel gruppo di directory sotto i file di immagine che sono stati spostati, fare doppio clic sulla cartella Modifica manuale e selezionare per spostare i file IOC nel gruppo File di raccolta oggetti.
    NOTA: tutti i file TIFF selezionati devono avere file IOC corrispondenti.
  10. Premere Seleziona per spostare i file nel gruppo di file selezionato. Selezionare la scheda Conteggio fuochi nella parte inferiore del programma.
  11. Ottimizza i parametri seguendo i passaggi seguenti.
    1. Indice delle impostazioni del cappello a cilindro: 12.
    2. Canale di messa a fuoco: selezionare il colore dei fuochi (verde: ɣ-H2AX; rosso: RAD51).
    3. Impostazioni cupola H: altezza cupola %: 30; soglia %: 28 e 28.
    4. Impostazione forma/dimensione: dimensione minima dello stato attivo, pixel: 5. Selezionare Applica forma/dimensione. Dimensione massima della messa a fuoco (condizionale): 32. Rotondità minima, x100: 96. Messa a fuoco massima, pixel: 60.
    5. Filtro antirumore: dimensione 1.
      NOTA: Se si determina se un nucleo è positivo per la colorazione della geminina, sotto il secondo canale selezionare il verde e sotto l'analisi selezionare l'intensità.
  12. Per testare i parametri impostati, selezionare i seguenti pulsanti nell'ordine indicato: Top Hat > H-Dome > Foci Count.
    NOTA: se questi parametri non funzionano, le dimensioni e l'ottimizzazione possono essere regolate insieme ad altre impostazioni. Consulta il manuale dell'utente per saperne di più su come ottimizzare ulteriormente l'immagine.
  13. Una volta ottimizzati i parametri per le immagini selezionate, selezionare Conteggio automatico per contare i fuochi in ogni immagine per nuclei. Se si desidera il secondo canale, il programma determinerà l'intensità che può essere utilizzata.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il protocollo presentato può colorare, visualizzare e quantificare con successo le proteine di riparazione del danno al DNA nucleare negli organoidi. Questa tecnica è stata utilizzata per colorare e valutare le DOP sia prima che dopo l'irradiazione. Le PDO sono state esposte a 10 Gy di radiazioni e valutate per i seguenti biomarcatori: ɣ-H2AX (Figura 1), un marker di danno al DNA; RAD51 (Figura 2), un indicatore per HRR; 53BP1, un marcatore di NHEJ; RPA, un mark...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La risposta al danno del DNA svolge un ruolo fondamentale sia nello sviluppo del cancro ovarico che nella resistenza alla chemioterapia. Pertanto, una conoscenza approfondita dei meccanismi di riparazione del DNA è imperativa. Qui viene presentata una metodologia per studiare le proteine di riparazione del danno al DNA in organoidi intatti 3D. Viene sviluppato un protocollo riproducibile e affidabile che utilizza anticorpi caratteristici per valutare il danno al DNA, la ricombinazione omologa, l'unione finale non omologa...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Siamo grati per la guida di Pavel Lobachevsky, PhD nello stabilire questo protocollo. Vorremmo anche ringraziare la School of Medicine della Washington University nel Dipartimento di Ostetricia e Ginecologia di St. Louis e la Divisione di Oncologia Ginecologica, il Dean's Scholar Program della Washington University, la Gynecologic Oncology Group Foundation e il Reproductive Scientist Development Program per il loro sostegno a questo progetto.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1x soluzione salina tamponata con fosfato con calcio e magnesio (PBS++)Sigma14-040-133
1x soluzione salina tamponata con fosfato senza calcio e magnesio (PBS)Fisher Scientific 
Anticorpo Ant-53BP1 BD Biosciences612522diluito a 1:500 in tampone di colorazione
Anticorpo anti-gemininaAbcamab104306diluito a 1:200 in tampone di colorazione
Anticorpo Anti-Geminina ProteinTech10802-1-APdiluito a 1:400 in tampone di colorazione
Anti-RAD51 Antibody Abcamab133534diluito a 1:1000 in tampone di colorazione
Anti-yH2AX Antibody Millipore-Sigma05-636diluito a 1:500 in tampone di colorazione
Anticorpo Ant-fosfo-RPA32 (S4/S8) Laboratoridi Betal.A300-245A-Mdiluito a 1:200 in tampone di colorazione
Albumina sierica bovina (BSA)Fisher Scientific BP1605 100
Centrifuga; Sorvall St 16R CentrifugaThermo Scientific 
Microscopio confocale, sistema confocale Leica SP5 DMI4000Leica 
Provette coniche, 15 mLCorning 14-959-53A
Contacellule automatizzato Countess 3 FL (macchina contacellule) Thermo Scientific 
Countess Camera di Conteggio Cellule VetriniThermo Scientific C10228
Vetrino coprioggettoLA ColorsQualsiasi smalto trasparente sarà sufficiente
Cultrex  Estratto di membrana basale RGF, tipo 2  R& Sistemi D 3533-010-02Probabilmente potrebbe utilizzare Matrigel o un'altra matrice BME 
DAPI Thermo Scientific   R37606Reagente NucBlue Fixed Cell ReadyProbes, diluito in 1x PBS 
Glicina Fisher Scientific 
JCountProJCountProPer accedere al software, Email: jcountpro@gmail.com 
Provette per microcentrifuga Fisher Scientific 07-000-243
Smalto per unghie StatLabSL102450
Parafomraldeide (PFA), 2% Scienze della microscopia elettronica 157-4Diluire al 4% di PFA in PBS++ per ottenere il tampone
permeabilizzazioneProdotto in laboratorio0,2% X-100 Triton in PBS++ 
PipettaRainin17014382
Puntali per pipette Rainin 
ProLong Gold Antifade MountantThermo Scientific   P36930
Tampone di colorazione Prodotto in laboratorio0,5% BSA, 0,15% glicina, 0,1% X-100 Triton in PBS++ 
Thermo Scientific Sistema di scorrimento a camera Nunc Lab-Tek II Thermo Scientific 12-565-8
Triton X-100Sigma-Alderich 
Soluzione di Tripano Blu, 0,4%Thermo Scientific 
TrypLEExpress Invitrogen12604013enzima ricombinante
X-RAD 320 Biological IrradiatorIrradiazione a raggi X di precisione X-RAD320
ICN186045475004240389584AMQAF2000NC0756056 di PFA al 2% 170149671133248100115250061 senza origine animale.

References

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