Identificazione dei geni coinvolti nello sviluppo stomatale tramite punteggio del fenotipo epidermico

Sommario

Questo articolo descrive due metodi di fenotipizzazione senza l'uso di peeling epidermici per caratterizzare i geni che controllano lo sviluppo stomatico. Il primo metodo dimostra come analizzare un fenotipo stomatico utilizzando un'epidermide vegetale colorata con O-colorata con toluidina blu. Il secondo metodo descrive come identificare i ligandi stomatici e monitorare le loro attività biologiche.

Abstract

Gli stomi sono piccoli pori sulla superficie delle piante terrestri che sono coinvolti nello scambio di gas e nel rilascio di vapore acqueo e la loro funzione è fondamentale per la produttività e la sopravvivenza delle piante. Come tale, comprendere i meccanismi con cui gli stomi si sviluppano e modellano ha un enorme valore agronomico. Questo articolo descrive due metodi fenotipici che utilizzano Arabidopsis cotiledoni che possono essere utilizzati per caratterizzare i geni che controllano lo sviluppo e il pattern stomatico. Le prime sono le procedure per l'analisi dei fenotipi stomatici utilizzando cotiledoni blu O-colorati con toluidina. Questo metodo è veloce e affidabile e non richiede l'uso di peeling epidermici, che sono ampiamente utilizzati per le analisi fenotipiche ma richiedono una formazione specializzata. A causa della presenza di residui multipli di cisteina, l'identificazione e la generazione di peptidi EPF bioattivi che hanno un ruolo nello sviluppo stomatico sono stati impegnativi. Pertanto, il secondo è presentato è una procedura utilizzata per identificare i ligandi stomatici e monitorare la loro attività biologica mediante saggi biologici. Il vantaggio principale di questo metodo è che produce dati riproducibili in modo relativamente semplice, riducendo la quantità di soluzione peptidica e il tempo necessario per caratterizzare il ruolo dei peptidi nel controllo del pattern e dello sviluppo stomatico. Nel complesso, questi protocolli ben progettati migliorano l'efficienza dello studio dei potenziali regolatori stomatici, compresi i peptidi secretori ricchi di cisteina, che richiedono strutture altamente complesse per la loro attività.

Introduzione

Il corretto pattern e differenziazione degli stomi vegetali sono fondamentali per la loro funzione in due processi biologici fondamentali, la fotosintesi e la traspirazione, e sono applicati dalle vie di segnalazione del peptide EPF. In Arabidopsis, tre peptidi ricchi di cisteina secreti, EPF1, EPF2 e STOMAGEN / EPFL9, controllano diversi aspetti dello sviluppo stomatico e sono percepiti dai componenti del recettore della superficie cellulare, tra cui le chinasi del recettore della famiglia ERECTA (ER, ERL1 e ERL2), SERK e TMM 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 . Questo riconoscimento porta quindi alla downregulation dei fattori di trascrizione che promuovono la differenziazione stomatica mediante un processo MAPK-dipendente¹¹. La scoperta di questi geni stomatici fondamentali è ottenuta principalmente dallo screening fenotipico di mutanti che presentano difetti epidermici. Questo articolo presenta metodi di fenotipizzazione relativamente semplici ed efficienti per visualizzare gli stomi e altre cellule epidermiche, che sono necessari per identificare e caratterizzare i potenziali geni che controllano il pattern e la differenziazione stomatica.

L'osservazione dei dettagli dell'epidermide vegetale è stata tipicamente ottenuta utilizzando peeling epidermici con o senza colorazione con un colorante come il blu di toluidina O (TBO) o la safranina^12,13,14. Tuttavia, la sfida principale di questi metodi è che richiedono una formazione specializzata per sbucciare l'epidermide fogliare senza strappare i tessuti e per osservare e analizzare attentamente i dati di pattern evitando le immagini prese da diverse parti della foglia. Anche i trattamenti chimici per eliminare i campioni di tessuto con reagenti come le soluzioni di clearing a base di cloralio idrato sono stati ampiamente utilizzati per una vasta gamma di materiali biologici ^8,15; Questi trattamenti generano una grande quantità di informazioni fenotipiche fornendo immagini di alta qualità, ma richiedono anche l'uso di sostanze chimiche pericolose (ad esempio, formaldeide, idrato di cloralio). Questo documento presenta innanzitutto un metodo di fenotipizzazione relativamente facile e conveniente che produce immagini sufficienti per l'analisi quantitativa, ma non richiede l'uso di sostanze chimiche pericolose e bucce fogliari epidermiche per la preparazione del campione. Un'epidermide cotiledonica colorata con TBO è ideale anche per lo studio dello sviluppo stomatico perché la mancanza di tricomi e il minore gradiente di sviluppo nei cotiledoni consentono l'interpretazione semplice e trattabile dei fenotipi epidermici.

I peptidi EPF stomatici appartengono al gruppo di peptidi ricchi di cisteina specifici per le piante che hanno dimensioni mature relativamente grandi e legami disolfuro intramolecolari tra residui di cisteina conservati. Il corretto ripiegamento conformazionale è fondamentale per la loro funzione biologica, ma i peptidi ricchi di cisteina, che sono prodotti dalla sintesi chimica o da un sistema di ricombinazione eterologo, possono essere inattivi e sono una miscela di^{peptidi 3,7,16} correttamente piegati e dispiegati. Pertanto, lo screening dei peptidi bioattivi che hanno un ruolo nel controllo dello sviluppo stomatico è stato un compito molto impegnativo. Questo manoscritto descrive inoltre un saggio biologico per una migliore identificazione e caratterizzazione dei peptidi stomatici bioattivi. In questo metodo, le piantine di Arabidopsis vengono coltivate in una piastra multi-pozzetto contenente mezzi con e senza potenziali peptidi per 6-7 giorni. Quindi, l'epidermide cotiledone viene visualizzata utilizzando un microscopio confocale. In generale, per visualizzare chiaramente l'attività biologica di potenziali peptidi nello sviluppo stomatico, vengono utilizzati i genotipi che producono più e/o meno cellule della linea stomatica, come il mutante epf2, che produce più cellule epidermiche, e la linea STOMAGEN-ami, che conferisce una ridotta densità delle cellule epidermiche ^2,4,5, in aggiunta al controllo wild-type Arabidopsis (Col-0) per i saggi biologici.

Nel complesso, i due protocolli qui presentati possono essere utilizzati per la valutazione rapida ed efficiente di vari fenotipi epidermici e per lo screening di piccoli peptidi e ormoni che hanno un ruolo nel controllo del pattern e dello sviluppo stomatico.

Protocollo

1. Colorazione dei cotiledoni di Arabidopsis con TBO

1. Sterilizzazione dei semi e condizioni di crescita
   1. Sterilizzare ~30 semi di Arabidopsis per genotipo in una provetta da microcentrifuga aggiungendo 1 ml di una soluzione di sterilizzazione dei semi (33% di candeggina commerciale, 0,1% Triton X-100) e dosare delicatamente per 10-12 minuti a temperatura ambiente (RT).
      NOTA: Sterilizzare ~30 semi di Arabidopsis shire (Col-0) e/o ~60 semi di piante transgeniche portatrici di un gene chimicamente inducibile (ad esempio, Est::EPF2⁷) per utilizzare piantine transgeniche coltivate su 1/2 piastre di Murashige e Skoog (MS) (2,16 g/L contenenti 0,8% di agar [p/v]) senza induttore (ad esempio, β-estradiolo) come controlli (Figura 1 e Figura 2).
   2. Rimuovere la soluzione di sterilizzazione, lavare i semi quattro volte con 1 ml di acqua sterile in una cappa a flusso laminare e risospenderli in ~ 200 μL di agar sterile allo 0,1%.
   3. Seminare ~30 semi per genotipo su piastre di agar 1/2 MS o 1/2 piastre di agar MS contenenti un induttore (ad esempio, 10 μM β-estradiolo) per l'induzione chimica del transgene (ad esempio, Est::EPF2⁷) usando una pipetta e sigillare con nastro micropore.
      NOTA: I semi devono essere distribuiti uniformemente sul piatto per evitare di metterli nelle immediate vicinanze, in quanto ciò impedirà alle piantine di crescere uniformemente.
   4. Stratificare i semi ponendo le piastre a 4 °C senza luce per 3-5 giorni per sincronizzare la germinazione.
   5. Dopo la stratificazione, incubare le placche in una camera di crescita a 22 °C sotto 120 μmol·m⁻²·s⁻¹ di luce con un fotoperiodo di 16 ore di luce e 8 ore di buio per 10 giorni.
2. Campionamento e colorazione TBO di Arabidopsis cotiledoni
   1. A 10 giorni dalla germinazione, selezionare attentamente e ritagliare uno dei cotiledoni dalle singole piantine che crescono uniformemente con altre piantine sul piatto per limitare la variabilità.
      NOTA: I cotiledoni sono campionati da piantine di 10 giorni perché non hanno tricomi e cellule epidermiche immature, il che semplifica l'interpretazione dei fenotipi epidermici.
   2. Porre ciascun cotiledone in una provetta da microcentrifuga contenente 1 mL di una soluzione di fissaggio (etanolo 9:1 in acido acetico) usando una pinza e lasciare il campione nella soluzione di fissaggio per una notte, almeno e a temperatura ambiente.
      NOTA: I campioni possono quindi essere conservati fino a un paio d'anni in questa condizione. L'immagine Figura 2E è stata presa da un campione di cotiledone che è stato conservato in soluzione di fissaggio per oltre 3 anni. È importante conservare il cotiledone in una soluzione di fissaggio immediatamente dopo il taglio e posizionare non più di cinque cotiledoni in ciascuna provetta da microcentrifuga per una successiva preparazione omogenea del campione.
   3. Rimuovere la soluzione di fissaggio e aggiungere 1 mL di etanolo al 70%. Dopo aver invertito il tubo un paio di volte, lasciare il tubo contenente i campioni a RT per ~ 30 min.
   4. Ripetere il passaggio 1.2.3 utilizzando 1 ml di etanolo al 50% e poi al 20% di etanolo.
   5. Sostituire 1 mL di etanolo al 20% con 1 mL di acqua distillata, quindi lasciare il tubo contenente i campioni di cotiledone per ~ 30 minuti dopo aver invertito il tubo alcune volte.
      NOTA: I campioni possono rimanere in acqua distillata per più di 24 ore, ma questo non è raccomandato per ottenere immagini di buona qualità (immagini ben colorate per diversi tipi di cellule epidermiche) per l'analisi quantitativa.
   6. Rimuovere tutta l'acqua distillata dal tubo. Quindi, aggiungere immediatamente ~ 200 μL di soluzione colorante TBO (0,5% TBO in H 2 O, filtrato) per ~₂min.
      NOTA: Assicurarsi che ogni campione di cotiledone sia uniformemente esposto alla soluzione TBO facendo scorrere delicatamente le provette durante l'incubazione. Per evitare la sovracolorazione con TBO (la tempistica della colorazione è essenziale e può essere variabile per ciascun genotipo), non elaborare più di sei provette contenenti campioni alla volta.
   7. Rimuovere la soluzione colorante TBO il più accuratamente possibile, quindi lavare immediatamente i campioni un paio di volte aggiungendo 1 ml di acqua distillata fresca.
3. Imaging e analisi dei dati
   1. Prendi un vetrino da microscopio e aggiungi una goccia di glicerolo al 15% (~ 50 μL). Posizionare il cotiledone con il lato abassiale verso l'alto in glicerolo al 15% sul vetrino usando una pinza fine. Quindi, coprirlo delicatamente con un vetrino di copertura in modo che eventuali bolle d'aria formate possano essere rimosse dal campione.
   2. Immagine del lato abassiale dell'epidermide cotiledone utilizzando un microscopio a campo luminoso (Figura 1 e Figura 2), quindi esaminare il fenotipo epidermico contando il numero di stomi e altri tipi di cellule epidermiche.
   3. Per ogni genotipo, calcolare il fenotipo epidermico utilizzando le seguenti formule descritte da Jangra et ^al.17:
      Indice stomatico (%) = (Numero di stomi/Numero totale di cellule epidermiche) × 100
      Densità stomatica (mm⁻²) = Numero di stomi/Area (mm²)
      NOTA: Immagine di almeno otto cotiledoni (N = 8) per ciascun genotipo e documentare il fenotipo epidermico di ciascun genotipo confrontandolo con il fenotipo della pianta wild-type e/o delle piante transgeniche che esprimono un transgene chimicamente inducibile coltivato senza induttore.

2. Biosaggi per peptidi stomatici

NOTA: la procedura per i test biologici è illustrata nella Figura 3.

1. Sterilizzazione dei semi e condizioni di crescita
   1. Sterilizzare ~ 25 semi per ogni trattamento come sopra e seminare circa la metà dei semi su ciascuna delle due piastre di agar 1/2 MS in una cappa a flusso laminare.
      NOTA: Utilizzare il genotipo con cellule epidermiche alte e/o basse (ad esempio, epf2²) invece di utilizzare uno sfondo wild-type (ad esempio, Col-0) per rilevare facilmente le attività biologiche dei peptidi sul pattern e sulla differenziazione delle cellule epidermiche (Figura 4).
   2. Stratificare i semi per 3 giorni a 4 °C al buio.
   3. Estrarre ciascuna delle due piastre ad intervalli di ~10 ore e incubare i semi su piastre a 22 °C sotto 120 μmol·m−²·s⁻¹ di luce con un fotoperiodo di 16 ore di luce e 8 ore di buio per 1 giorno.
2. Trattamento e imaging dei peptidi
   1. In una cappa a flusso laminare, trapiantare con cura 10-12 piantine di Arabidopsis vecchie di un giorno da ciascuna delle due piastre preparate in una piastra a 24 pozzetti contenente 1,5 ml di mezzo liquido 1/2 MS in ciascun pozzetto (~ 20 piantine per pozzetto).
      NOTA: La tempistica del trattamento peptidico per le piantine è fondamentale per gli esiti fenotipici del trattamento peptidico, quindi preparare i semi su due piastre separate per ottenere due diverse fasi di sviluppo della piantina per il trattamento.
   2. Aggiungere un tampone da solo (50 mM Tris-HCl [pH 8,0]) o due diverse concentrazioni del peptide (tipicamente, 1 μM e 2,5 μM peptide in 50 mM Tris-HCl [pH 8,0]) a ciascun pozzetto contenente ~ 20 piantine di Arabidopsis di un giorno germinate su piastre di agar 1/2 MS.
      NOTA: Rimuovere le aliquote della soluzione peptidica da un congelatore e tenerle a RT per alcuni minuti prima del trattamento. I peptidi conservati in un congelatore a -80 °C sono stabili per un paio d'anni, ma i cicli di congelamento-scongelamento dovrebbero essere evitati conservando la soluzione peptidica in piccole aliquote.
   3. Dopo aver mescolato delicatamente le piantine con un tampone da solo o una soluzione peptidica usando una pipetta, sigillare la piastra con nastro a micropori. Incubare la piastra di analisi in condizioni di lunga giornata (fotoperiodo 16 ore, 120 μmol·m−2·s⁻¹ luce) per 5-7 giorni a ²² °C.
      NOTA: Evitare che le piantine crescano troppo vicine tra loro per consentire a ciascuna piantina di avere un'esposizione uniforme alla soluzione peptidica. Ruotare delicatamente la piastra per 2-3 ore prima di incubare la piastra in una camera di crescita per aumentare l'aerazione.
   4. Trasferire ogni piantina dal pozzetto contenente tampone da solo o peptide su un vetrino di copertura e sezionare il cotiledone della piantina. Posizionare il lato abassiale del cotiledone usando una pinza e tagliarlo a pezzetti.
   5. Prendi un altro vetrino da microscopio pulito e posiziona su di esso una goccia di soluzione di ioduro di propidio (~ 25 μL, 2 mg / ml in H₂O).
   6. Posizionare uno dei piccoli pezzi di cotiledone in una goccia di soluzione di ioduro di propidio usando una pinza e posizionare delicatamente il vetrino di copertura. Applicare un'ulteriore soluzione di ioduro di propidio sul bordo del coprivetrino per rimuovere eventuali bolle d'aria che si sono formate.
   7. Immagine del lato abassiale del cotiledone usando un microscopio confocale e confronta le immagini con le immagini di piantine coltivate in mezzo 1/2 MS contenente solo tampone.
      NOTA: Le immagini presentate nella Figura 4 sono state prese da piantine selvatiche Col-0 o epf2^2,5 che sono state trattate solo con tampone (Figura 4A, B) o due lotti di soluzione peptidica EPF2 (Figura 4C-F) e sono state conservate a -80 °C per 1 anno.

Risultati

Varie piante transgeniche stomatiche e mutanti noti per avere meno o più densità stomatica e clustering (epf2 2,5, epf1 epf2^2,5, tmm¹², una linea STOMAGEN-silenziata ^4, e linee transgeniche che trasportano il costrutto di sovraespressione Est::EPF1 o Est::EPF2 7 ) sono stati util...

Discussione

I due metodi di analisi fenotipica per identificare e caratterizzare i geni che controllano il pattern stomatico e la differenziazione qui presentati sono saggi convenienti e affidabili poiché i protocolli non richiedono l'uso di peeling epidermici e attrezzature specializzate (che richiedono tempo e richiedono una formazione speciale per la preparazione del campione) ma producono immagini di alta qualità per l'analisi quantitativa dei fenotipi epidermici.

Una limitazione di questa tecnica per...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Vetrino coprioggetto 18 mm x 18 mm	VWR	16004-326
Piastre sterili a 24 pozzetti con coperchio	VWR	CA62406-183
Nastro chirurgico 3M Micropore	Fisher Scientific	19-027-761	Nastro di carta chirurgica microporosa utilizzato per sigillare le piastre MS
76 x 26 mm Vetrino per microscopio	TLG	GEW90-2575-03
Acido acetico, ≥ 99,8%	Fisher Scientific	A38-212
Agar	BioShop	AGR001.1
Bleech	Candeggina per uso domestico (ad es. Clorox)
Microscopio confocale	Nikon		Nikon C2 gestito da NIS-Elements
Etanolo	Greenfield	P210EAAN
FIJI	Open-srouce	(Fiji è solo) ImageJ v2.1 / 1.5.3j	Scaricato da https://imagej.net/software/fiji/
Pinza	Sigma-Aldrich	F6521
Miscela vitaminica di Gamborg	Cassson Labs	GBL01-100ML	Negozio a 4 gradi C
Glicerolo	Fisher Scientific	G33-4
Camere di crescita	Conviron,  modello E15		ciclo di luce 16h, impostato a 21° C con un'intensità luminosa di 120 µ mol· m-2· s-1.
Luci	HD Supply	25272	Luci fluorescenti nelle camere di crescita, Sylvania F72T12/CW/VHO 72"T12 VHO 4200K
Provetta per microcentrifuga	Fisher Scientific	14-222-155	Provette in cui vengono inseriti i semi di Arabidopsis thaliana per eseguire la sterilizzazione
Microscopio	Nikon		Nikon Eclipse TiE dotato di fotocamera digitale DsRi2
Murashige e sali basali Skoog	Cassson Labs	MSP01-1LT	Negozio a 4 gradi C
Piastra di Petri 100 mm x 20 mm	Fisher Scientific	08-757-11Z	Piastre di Petri in cui viene versato il terreno MS allo scopo di coltivare Arabidopsis thaliana
Propidium Iodide	VWR	39139-064
Bisturi	Fisher Scientific	08-916-5A
Saccarosio	BioShop	SUC700.5
Blu di toluidina O	Sigma-Aldrich	T3260-5G
Tris base	Sigma-Aldrich	T1503
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787-100ML
β-Estradiolo	Sigma-Aldrich	E2758