Identificazione dei geni coinvolti nello sviluppo stomatale tramite punteggio del fenotipo epidermico

Sommario

Questo articolo descrive due metodi di fenotipizzazione senza l'uso di peeling epidermici per caratterizzare i geni che controllano lo sviluppo stomatico. Il primo metodo dimostra come analizzare un fenotipo stomatico utilizzando un'epidermide vegetale colorata con O-colorata con toluidina blu. Il secondo metodo descrive come identificare i ligandi stomatici e monitorare le loro attività biologiche.

Abstract

Gli stomi sono piccoli pori sulla superficie delle piante terrestri che sono coinvolti nello scambio di gas e nel rilascio di vapore acqueo e la loro funzione è fondamentale per la produttività e la sopravvivenza delle piante. Come tale, comprendere i meccanismi con cui gli stomi si sviluppano e modellano ha un enorme valore agronomico. Questo articolo descrive due metodi fenotipici che utilizzano Arabidopsis cotiledoni che possono essere utilizzati per caratterizzare i geni che controllano lo sviluppo e il pattern stomatico. Le prime sono le procedure per l'analisi dei fenotipi stomatici utilizzando cotiledoni blu O-colorati con toluidina. Questo metodo è veloce e affidabile e non richiede l'uso di peeling epidermici, che sono ampiamente utilizzati per le analisi fenotipiche ma richiedono una formazione specializzata. A causa della presenza di residui multipli di cisteina, l'identificazione e la generazione di peptidi EPF bioattivi che hanno un ruolo nello sviluppo stomatico sono stati impegnativi. Pertanto, il secondo è presentato è una procedura utilizzata per identificare i ligandi stomatici e monitorare la loro attività biologica mediante saggi biologici. Il vantaggio principale di questo metodo è che produce dati riproducibili in modo relativamente semplice, riducendo la quantità di soluzione peptidica e il tempo necessario per caratterizzare il ruolo dei peptidi nel controllo del pattern e dello sviluppo stomatico. Nel complesso, questi protocolli ben progettati migliorano l'efficienza dello studio dei potenziali regolatori stomatici, compresi i peptidi secretori ricchi di cisteina, che richiedono strutture altamente complesse per la loro attività.

Introduzione

Il corretto pattern e differenziazione degli stomi vegetali sono fondamentali per la loro funzione in due processi biologici fondamentali, la fotosintesi e la traspirazione, e sono applicati dalle vie di segnalazione del peptide EPF. In Arabidopsis, tre peptidi ricchi di cisteina secreti, EPF1, EPF2 e STOMAGEN / EPFL9, controllano diversi aspetti dello sviluppo stomatico e sono percepiti dai componenti del recettore della superficie cellulare, tra cui le chinasi del recettore della famiglia ERECTA (ER, ERL1 e ERL2), SERK e TMM 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10

Protocollo

1. Colorazione dei cotiledoni di Arabidopsis con TBO

1. Sterilizzazione dei semi e condizioni di crescita
   1. Sterilizzare ~30 semi di Arabidopsis per genotipo in una provetta da microcentrifuga aggiungendo 1 ml di una soluzione di sterilizzazione dei semi (33% di candeggina commerciale, 0,1% Triton X-100) e dosare delicatamente per 10-12 minuti a temperatura ambiente (RT).
      NOTA: Sterilizzare ~30 semi di Arabidopsis shire (Col-0) e/o ~60 semi di piante transgeniche portatrici di un gene chimicamente inducibile (ad esempio, Est::EPF2⁷) per utilizzare piantine transgeniche coltivate su 1/2 ....

Risultati

Varie piante transgeniche stomatiche e mutanti noti per avere meno o più densità stomatica e clustering (epf2 2,5, epf1 epf2^2,5, tmm¹², una linea STOMAGEN-silenziata ^4, e linee transgeniche che trasportano il costrutto di sovraespressione Est::EPF1 o Est::EPF2 7 ) sono stati util.......

Discussione

I due metodi di analisi fenotipica per identificare e caratterizzare i geni che controllano il pattern stomatico e la differenziazione qui presentati sono saggi convenienti e affidabili poiché i protocolli non richiedono l'uso di peeling epidermici e attrezzature specializzate (che richiedono tempo e richiedono una formazione speciale per la preparazione del campione) ma producono immagini di alta qualità per l'analisi quantitativa dei fenotipi epidermici.

Una limitazione di questa tecnica per.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Vetrino coprioggetto 18 mm x 18 mm	VWR	16004-326
Piastre sterili a 24 pozzetti con coperchio	VWR	CA62406-183
Nastro chirurgico 3M Micropore	Fisher Scientific	19-027-761	Nastro di carta chirurgica microporosa utilizzato per sigillare le piastre MS
76 x 26 mm Vetrino per microscopio	TLG	GEW90-2575-03
Acido acetico, ≥ 99,8%	Fisher Scientific	A38-212
Agar	BioShop	AGR001.1
Bleech	Candeggina per uso domestico (ad es. Clorox)
Microscopio confocale	Nikon		Nikon C2 gestito da NIS-Elements
Etanolo	Greenfield	P210EAAN
FIJI	Open-srouce	(Fiji è solo) ImageJ v2.1 / 1.5.3j	Scaricato da https://imagej.net/software/fiji/
Pinza	Sigma-Aldrich	F6521
Miscela vitaminica di Gamborg	Cassson Labs	GBL01-100ML	Negozio a 4 gradi C
Glicerolo	Fisher Scientific	G33-4
Camere di crescita	Conviron,  modello E15		ciclo di luce 16h, impostato a 21° C con un'intensità luminosa di 120 µ mol· m-2· s-1.
Luci	HD Supply	25272	Luci fluorescenti nelle camere di crescita, Sylvania F72T12/CW/VHO 72"T12 VHO 4200K
Provetta per microcentrifuga	Fisher Scientific	14-222-155	Provette in cui vengono inseriti i semi di Arabidopsis thaliana per eseguire la sterilizzazione
Microscopio	Nikon		Nikon Eclipse TiE dotato di fotocamera digitale DsRi2
Murashige e sali basali Skoog	Cassson Labs	MSP01-1LT	Negozio a 4 gradi C
Piastra di Petri 100 mm x 20 mm	Fisher Scientific	08-757-11Z	Piastre di Petri in cui viene versato il terreno MS allo scopo di coltivare Arabidopsis thaliana
Propidium Iodide	VWR	39139-064
Bisturi	Fisher Scientific	08-916-5A
Saccarosio	BioShop	SUC700.5
Blu di toluidina O	Sigma-Aldrich	T3260-5G
Tris base	Sigma-Aldrich	T1503
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787-100ML
β-Estradiolo	Sigma-Aldrich	E2758