TrackMate Analysis of Calcium Imaging (TACI) è un plugin ImageJ open source per l'analisi 3D dell'imaging del calcio che esamina il movimento sull'asse z e identifica il valore massimo di ogni z-stack per rappresentare l'intensità di una cella nel punto temporale corrispondente. Può separare i neuroni che si sovrappongono nella direzione laterale (x / y) ma su diversi piani z.
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Articolo metodologico
TACI: un plugin ImageJ per l'analisi 3D dell'imaging del calcio
In questo articolo
Sommario
Abstract
La ricerca nelle neuroscienze si è evoluta per utilizzare complessi strumenti di imaging e computazionali per estrarre informazioni complete dai set di dati. L'imaging del calcio è una tecnica ampiamente utilizzata che richiede un software sofisticato per ottenere risultati affidabili, ma molti laboratori faticano ad adottare metodi computazionali quando aggiornano i protocolli per soddisfare gli standard moderni. Le difficoltà sorgono a causa della mancanza di conoscenze di programmazione e paywall per il software. Inoltre, le cellule di interesse mostrano movimenti in tutte le direzioni durante l'imaging del calcio. Sono stati sviluppati molti approcci per correggere il movimento nella direzione laterale (x/y).
Questo documento descrive un flusso di lavoro che utilizza un nuovo plug-in ImageJ, TrackMate Analysis of Calcium Imaging (TACI), per esaminare il movimento sull'asse z nell'imaging 3D del calcio. Questo software identifica il valore massimo di fluorescenza da tutte le posizioni z in cui appare un neurone e lo utilizza per rappresentare l'intensità del neurone nella posizione t corrispondente. Pertanto, questo strumento può separare i neuroni che si sovrappongono nella direzione laterale (x / y) ma appaiono su piani z distinti. Come plug-in ImageJ, TACI è uno strumento computazionale open source e facile da usare per l'analisi 3D dell'imaging del calcio. Abbiamo convalidato questo flusso di lavoro utilizzando neuroni termosensibili larvali di mosca che mostravano movimenti in tutte le direzioni durante la fluttuazione della temperatura e un set di dati di imaging del calcio 3D acquisito dal cervello del moscerino.
Introduzione
Il livello di calcio intracellulare è un marcatore preciso di eccitabilità neuronale. L'imaging del calcio misura i cambiamenti nel calcio intracellulare per comprendere l'attività neuronale1. Gli studi nelle neuroscienze hanno sempre più utilizzato questo metodo a causa dello sviluppo di tecniche per misurare la concentrazione intracellulare di calcio, compresi gli indicatori di calcio geneticamente codificati (GECI), come GCaMP2,3, che possono essere espressi in modo non invasivo in specifici gruppi di neuroni attraverso approcci genetici. I minori costi dei laser e dei componenti del....
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Protocollo
1. Imaging del calcio
- Preparazione delle larve di mosca
NOTA: Le mosche e le larve sono mantenute a 25 °C in un ciclo luce:buio di 12 ore:12 ore.- Anestetizzare le mosche con CO2. Ordinare 20-45 maschi e 20-45 femmine in ogni fiala di mosca e dare loro almeno 24 ore a 48 ore per riprendersi dall'esposizione a CO2 .
NOTA: L'esposizione della mosca alla CO2 dovrebbe durare per il minor tempo possibile. - Per sincronizzare l'età delle larve, picchiettare le mosche in nuove fiale contenenti granuli di lievito e consentire loro 4-8 ore per deporre le uova. Rimuovere le mosche capovolgendoli in....
- Anestetizzare le mosche con CO2. Ordinare 20-45 maschi e 20-45 femmine in ogni fiala di mosca e dare loro almeno 24 ore a 48 ore per riprendersi dall'esposizione a CO2 .
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Risultati
Flusso di lavoro di analisi 3D di imaging del calcio
In questo studio, abbiamo sviluppato un nuovo plug-in ImageJ, TACI, e descritto un flusso di lavoro per tracciare la deriva z e analizzare l'imaging 3D del calcio che individua le risposte delle singole cellule che appaiono in più posizioni z (Figura 1). Questo strumento ha quattro funzioni: RENAME, ORGANIZE, EXTRACT e MERGE. Innanzitutto, se i nomi del.......
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Discussione
Questo studio ha sviluppato un nuovo plug-in ImageJ, TACI, e ha descritto un flusso di lavoro che analizza l'imaging 3D del calcio. Molti strumenti attualmente disponibili si concentrano sulla correzione del movimento x/y, sebbene anche il movimento sull'asse z debba essere esplicitamente diagnosticato o corretto6. Durante l'acquisizione di immagini in un organismo vivo, il movimento sull'asse z è inevitabile anche quando l'organismo è immobilizzato e alcuni stimoli, come il cambiamento di tempera.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.
Ringraziamenti
Uno Zeiss LSM 880 nel Fralin Imaging Center è stato utilizzato per raccogliere i dati di imaging del calcio. Ringraziamo la dottoressa Michelle L Olsen e Yuhang Pan per la loro assistenza con il software IMARIS. Riconosciamo il Dr. Lenwood S. Heath per i commenti costruttivi sul manoscritto e Steven Giavasis per i commenti sul file README di GitHub. Questo lavoro è stato supportato da NIH R21MH122987 (https://www.nimh.nih.gov/index.shtml) e NIH R01GM140130 (https://www.nigms.nih.gov/) a L.N. I finanziatori non hanno avuto alcun ruolo nella progettazione dello studio, nella raccolta e analisi dei dati, nella decisione di pubblicare o nella preparazione del manoscritto.....
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Smussato Fill Needel | BD | 303129 | |
| Cloruro di calcio diidrato | Fisher Scientific | 10035-04-8 | Ingrediente alimentare per mosche |
| Anidride carbonica | Airgas | UN1013 | Cilindro in acciaio ad alta pressione |
| Kit gorgogliatore CO2 | Genesee | 59-180 | |
| Microscopio confocale LSM880 | Zeiss | 4109002107876000 | Un Axio Observer Z1 invertito, dotato di 5 laser, 2 rivelatori PMT standard, detettori GaAsP a 32 canali, un rivelatore Airyscan e Definite Messa a fuoco.2. |
| Software DAQami | Misurazione Calcolo | ||
| Destrosio | Genesee | 62-113 | Ingrediente alimentare per mosche |
| Drosophila Agar | Genesee | 66-111 | Ingrediente alimentare per mosche |
| Etanolo | Decon Labs, Inc. | 64-17-5 | Ingrediente del cibo per mosche |
| Fly line: Ir21a-Gal4 | Dr. Paul Garrity lab | Un regalo gentile | |
| Fly line: Ir21a-Gal80 | Dr. Lina Ni lab | ||
| Fly line: Ir68a-Gal4 | Dr. Aravinthan DT Samuel lab | Un regalo gentile | |
| Fly line: Ir93a-Gal4 | Dr. Paul Garrity lab | Un regalo gentile | |
| Fly line: UAS-GCaMP6 | Bloomington Drosophila Stock Center | 42750 | |
| Flypad | Genesee | 59-114 | |
| Regolatore in ottone forgiato per uso generale | Gentec | G152 | |
| Gibco PBS pH 7.4 (1x) | Thermo Fisher Scientific | 10010-031 | |
| Tubo Drosophila verde | Genesee | 59-124 | |
| Composto per il trasferimento di calore | MG Chemicals | 860-60G | |
| Dissipatore di calore | Digi-Key Electronics | ATS2193-ND | Ridimensiona a 12,9 x 5,5 cm |
| Illuminatore | AmScope | LED-6W | |
| Lievito secco inattivo | Genesee | 62-108 | Ingrediente alimentare per mosche |
| Incubatore | Pervical | DR-41VL | Luce: ciclo di buio: 12h:12h; Temperatura: 25 ° C; umidità: 40-50% RH. |
| Metil-4-idrossibenzoato | Thermo Scientific | 126965000 | Fly food ingrediete |
| Micro vetro di copertura | VWR | 48382-126 | Vetrini per microscopio 22 x 40 mm |
| Fisher Scientific | 12-544-2 | 25 x 75 x 1,0 mm | |
| Smalto per unghie | Kleancolor | ||
| Narrow Drosophila | fiale Genesee | 32-113RL | |
| Obiettivo | Zeiss | 420852-9871-000 | LD LCI Plan-Apochromat 25x/0.8 Imm Corr DIC M27 |
| Modulo di raffreddamento | Peltier TE Technology | TE-127-1.0-0.8 | 30 x 30 mm |
| Spine | Genesee | 49-102 | |
| alimentazione | Specialisti CSI1802X | 10 volt DC 2.0 amp alimentatore da banco lineare | |
| Princeton Artist Brush Nepture | Princeton Artist Brush Co. | Serie 4750, misura 2 | |
| Sodio potassio L-tartrato tetraidrato | Thermo Scientific | 033241-36 | Ingrediente alimentare per mosche |
| Inserto di fase | Wienecke e Sinske | 432339-9030-000 | |
| Stereomicroscopio | Olympus | SZ61 | Qualsiasi stereomicroscopio funziona |
| T-Fitting | Genesee | 59-123 | |
| Dispositivo di acquisizione dati a termocoppia | Measurement Computing | USB-2001-TC | termocoppia a canale singolo |
| Physitemp | IT-24P | ||
| Farina di mais gialla | Genesee | 62-101 | Ingrediente alimentare per mosche |
| Stadio piezoelettrico asse Z | Wienecke e Sinske | 432339-9000-000 |
Riferimenti
- Grienberger, C., Konnerth, A. Imaging calcium in neurons. Neuron. 73 (5), 862-885 (2012).
- Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 19 (2), 137-141 (2001).
- Zhang, Y.....
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Ristampe e permessi
