Articolo metodologico

Misurazione del diametro dei vasi retinici da immagini di angiografia fluorescente di topo

DOI:

10.3791/64964

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19 maggio 2023

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1Department of Physiology, Biomedical Center, Faculty of Medicine, University of Iceland, 2Department of Ophthalmology, National University Hospital

In questo articolo

Sommario

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La vascolarizzazione retinica del topo è particolarmente interessante per comprendere i meccanismi di formazione del pattern vascolare. Questo protocollo misura automaticamente il diametro dei vasi retinici di topo da immagini del fondo oculare dell'angiografia fluorescente a una distanza fissa dal disco ottico.

Abstract

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È importante studiare lo sviluppo della vascolarizzazione retinica nelle retinopatie in cui la crescita anormale dei vasi può portare alla perdita della vista. Le mutazioni nel gene del fattore di trascrizione associato alla microftalmia (Mitf) mostrano ipopigmentazione, microftalmia, degenerazione retinica e, in alcuni casi, cecità. L'imaging in vivo della retina del topo con mezzi non invasivi è vitale per la ricerca oculistica. Tuttavia, date le sue dimensioni ridotte, l'imaging del fondo oculare del topo è difficile e potrebbe richiedere strumenti specializzati, manutenzione e formazione. In questo studio, abbiamo sviluppato un software unico che consente l'analisi del diametro dei vasi retinici nei topi con un programma automatizzato scritto in MATLAB. Le fotografie del fondo oculare sono state ottenute con un sistema di telecamere del fondo oculare commerciale a seguito di un'iniezione intraperitoneale di una soluzione salina di fluoresceina. Le immagini sono state modificate per migliorare il contrasto e il programma MATLAB ha permesso di estrarre automaticamente il diametro vascolare medio a una distanza predefinita dal disco ottico. I cambiamenti vascolari sono stati esaminati in topi wild-type e topi con varie mutazioni nel gene Mitf analizzando il diametro dei vasi retinici. Il programma MATLAB personalizzato sviluppato qui è pratico, facile da usare e consente ai ricercatori di analizzare il diametro medio e il diametro totale medio, nonché il numero di vasi sanguigni dal sistema vascolare retinico del topo, in modo comodo e affidabile.

Introduzione

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Forse il letto vascolare più studiato nel corpo è il sistema vascolare retinico. Grazie alla sofisticazione tecnica in continuo miglioramento, la vascolarizzazione retinica è facilmente fotografabile nei pazienti viventi e utilizzata in molti campi di ricerca1. Inoltre, il sistema vascolare retinico del topo durante lo sviluppo ha dimostrato di essere un sistema modello molto efficace per la ricerca sulla biologia fondamentale della crescita vascolare. Lo scopo principale del sistema vascolare retinico è quello di fornire alla porzione interna della retina un supporto metabolico attraverso una rete capillare laminare che permea il tessuto neurale2. Tuttavia, la condizione della retina, e di conseguenza qualsiasi disfunzione o atrofia, può avere effetti significativi sia sulle biforcazioni della vascolarizzazione retinica che sul diametro delle arterie, dimostrando un'interazione tra le cellule retiniche e il sistema vascolare 3,4. È noto che numerose condizioni oculari, tra cui la retinopatia del prematuro (ROP), la retinopatia diabetica (DR), la degenerazione maculare legata all'età (AMD), il glaucoma e la neovascolarizzazione corneale, possono provocare un'angiogenesi oculare anomala5. Nel caso della vascolarizzazione retinica, i modelli murini di degenerazione retinica mostrano spesso cambiamenti paragonabili a quelli osservati nelle malattie vascolari umane 6,7. La famiglia dei supergeni Myc dei fattori fondamentali di trascrizione elica-ansa-elica-cerniera include il gene del fattore di trascrizione associato alla microftalmia (Mitf) espresso nell'epitelio pigmentato retinico (RPE)8,9,10.

È stato dimostrato che numerosi organi, tra cui l'occhio, l'orecchio, il sistema immunitario, il sistema nervoso centrale, i reni, le ossa e la pelle, sono regolati da Mitf 9,11,12,13. Abbiamo scoperto che la struttura e la funzione dell'RPE sono influenzate nei topi portatori di varie mutazioni nel gene Mitf, con conseguente degenerazione retinica e, infine, perdita della vista10. Recentemente, è stato dimostrato che il numero di vasi e il diametro dei vasi differiscono significativamente tra i topi mutanti Mitf e i topi wild-type14. Ricercatori e medici possono ora quantificare con precisione la vascolarizzazione retinica in vivo grazie agli sviluppi dell'imaging retinico. Dal 1800, ricercatori e medici hanno sfruttato il vantaggio della visualizzazione della vascolarizzazione retinica e l'angiografia con fluoresceina (FA) ha mostrato sia il flusso sanguigno retinico che la degradazione della barriera emato-retinica15.

Questo articolo illustra come analizzare il diametro dei vasi retinici da immagini FA di topo con un codice scritto su misura nel software MATLAB.

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Protocollo

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Tutti gli esperimenti sono stati approvati dall'Autorità islandese per gli alimenti e la veterinaria (licenza MAST n. 2108002). Tutti gli studi sugli animali sono stati condotti secondo la dichiarazione dell'Associazione per la ricerca sulla visione e l'oftalmologia (ARVO) per l'uso degli animali nella ricerca oftalmica e sulla vista. In questo studio sono stati utilizzati topi C57BL/6J e Mitfmi-vga9/+ maschi e femmine. I topi C57BL/6J (n = 7) sono stati utilizzati come controllo. I tipi selvatici sono stati ottenuti commercialmente (vedi Tabella dei materiali), ma tutti i topi mutanti (n = 7) sono stati allevati e allevati in strutture per animali nel Centro Biomedico dell'Università dell'Islanda. Nel presente studio sono stati utilizzati animali di 3 mesi; Tuttavia, il protocollo si applica anche agli animali di età pari o superiore a 1 mese.

1. Preparazione sperimentale

  1. Preparare la miscela per l'anestesia. Assumere una fiala di 2 mL di soluzione madre di ketamina (25 mg/mL) e 250 μL di soluzione madre di xilazina (2%) per preparare una soluzione di lavoro di miscela ketamina/xilazina (25 mg/mL di ketamina e 20 mg/mL di xilazina) (vedere la Tabella dei materiali).
  2. Anestetizzare il topo con un'iniezione intraperitoneale della miscela ketamina/xilazina, con un volume di liquido pari a quattro volte il peso corporeo del topo; ad esempio, un topo di 20 g di peso ha bisogno di 35 μL di soluzione di lavoro xilazina/ketamina per ottenere una dose di lavoro di una miscela di xilazina (4 mg/kg di peso corporeo) e ketamina (40 mg/kg di peso corporeo).
  3. Dilatare le pupille con un collirio al 10% di fenilefrina cloridrato e all'1% di tropicamide subito dopo l'anestesia.
  4. Attendere che l'animale sia completamente anestetizzato e che le sue pupille siano ampiamente dilatate.
  5. Preparare la soluzione salina di fluoresceina. Aggiungere 9 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS; 1x) a 1 mL di soluzione di fluoresceina (100 mg/mL di concentrazione madre) (vedere la Tabella dei materiali). La concentrazione finale della soluzione di lavoro è di 10 mg/mL.

2. Imaging in vivo della vascolarizzazione retinica utilizzando un sistema di imaging retinico per roditori

  1. Somministrare la soluzione di lavoro alla fluoresceina per via intraperitoneale (5 μL/g di peso corporeo) all'animale anestetizzato.
  2. Applicare una goccia di gel di metilcellulosa al 2% sulla superficie corneale e quindi posizionare l'animale sul tavolino di posizionamento del sistema di imaging (vedere la Tabella dei materiali).
  3. Posizionare l'obiettivo della fotocamera del fondo oculare per l'imaging retinico in modo che tocchi direttamente e delicatamente la cornea del topo. Per posizionare la testa del nervo ottico al centro del campo visivo, regolare leggermente l'allineamento.
  4. Passare al canale fluorescente verde sulla fundus camera.
  5. Concentrati sui vasi retinici per scattare immagini.
  6. Per trovare il punto temporale ideale, scattare una serie di foto a 1, 3, 5 e 10 minuti (ma non più di 10 minuti) dopo l'iniezione di fluoresceina.
    NOTA: Il trattamento con FA deve essere completato entro 10 minuti, poiché dopo tale tempo la fluoresceina potrebbe diffondersi troppo e i vasi diventare impercettibili.
  7. Al termine dell'imaging, mentre il topo è ancora anestetizzato, sopprimerlo mediante lussazione cervicale.

3. Analisi del diametro del vaso retinico

  1. Aprire il programma MATLAB (vedere Tabella dei materiali).
  2. Scaricare e salvare il codice "fundusDiameter.m" (vedere File di codifica supplementare 1, File di codifica supplementare 2 e File di codifica supplementare 3).
  3. Apri la cartella in cui è stato salvato il codice. Trascina il codice e rilascialo sulla cartella corrente in MATLAB.
  4. Trascinare e rilasciare l'immagine FFA (immagine dell'angiografia a fluorescenza del fondo oculare) o le immagini che si desidera analizzare sulla cartella corrente in MATLAB.
  5. Premere lo strumento Esegui dalla barra degli strumenti di MATLAB.
  6. Apparirà una finestra pop-up. Scrivere il nome del file dell'immagine di interesse nella casella Inserisci nome file e premere OK.
    NOTA: Non cambiare o modificare il resto dei parametri.
  7. Selezionare il centro del disco ottico, quindi selezionare il bordo del disco ottico. Il software ora calcola l'intensità dei pixel nelle immagini del fondo del mouse in un cerchio con un raggio che è il doppio di quello del disco ottico, in senso orario dal centro del disco ottico (Figura 1).
  8. Successivamente, assicurarsi che il software tracci il diametro medio del vaso (in pixel) di ciascun vaso nel fondo oculare in funzione del numero di vasi (Figura 2).
  9. Successivamente, assicurarsi che il software trasferisca i dati di misurazione per ogni recipiente in un documento Excel, in cui vengono calcolati la media, la mediana e la deviazione standard di questi valori (Tabella 1 e Tabella 2).
  10. Sposta i valori dalla tabella dei risultati a un foglio di calcolo selezionando tutti i valori nella tabella. Incolla i valori nel foglio di calcolo.
  11. Traccia i grafici ed esegui analisi statistiche utilizzando i dati incollati in un programma di fogli di calcolo a scelta (vedi Tabella dei materiali).

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Risultati

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La Figura 1 mostra il processo utilizzato per analizzare il sistema vascolare retinico, che viene applicato alle immagini FFA di topo di tutti i topi testati. Un raggio due volte più grande del disco ottico viene utilizzato per misurare l'intensità dei pixel in una direzione circolare, in senso orario, dal centro del disco ottico. Contrassegna i pixel con un punto iniziale o finale quando si imbatte rispettivamente in punti al di sopra e al di sotto di una soglia specificata dall'utente. Que...

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Discussione

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Il presente articolo è il primo a presentare un metodo per analizzare il diametro dei vasi retinici e la vascolarizzazione retinica da immagini di FA di topo. Poiché per acquisire immagini della vascolarizzazione retinica è stato utilizzato solo l'imaging del fondo oculare, il metodo presenta diversi inconvenienti, uno dei quali è che si possono dedurre solo alterazioni negli strati superficiali della vascolarizzazione retinica nei topi esaminati in questo studio; Eventuali differenze negli strati più profondi sono ancor...

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Dichiarazioni

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Gli autori dichiarano che non esistono interessi concorrenti.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è stato supportato da una borsa di studio post-dottorato dell'Icelandic Research Fund (217796-052) (A.G.L.) e dell'Helga Jónsdóttir and Sigurlidi Kristjánsson Memorial Fund (A.G.L e T.E.). Gli autori ringraziano il Prof. Eiríkur Steingrímsson per aver fornito i topi.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
1% Tropicamide (Mydriacyl)Alcon Inc LaboratoriesAgente midriatico
2% MethocelOmniVision Eye CareIdrossipropryl metilcellulosa gel
C57BL / 6JJackson Laboratory000664Topi wild type
Excel per Microsoft 365Microsoft IncPacchetto software
Fluoresceina salesodicoSigma-Aldrich28803-100GAngiografia fluorescente
Matlab 8.0The MathWorks, Inc.Pacchetto software
Micron IV telecamera per fondo oculare per roditoriPhoenix-Micron40-2200Fotografia del fondo
Fenilefrina 10% conBausch & LombAgente midriatico
Soluzione salina tamponata con fosfato - 100 compresseGibco18912-014Diluizione
Sigmaplot 13Jandel Scientific SoftwarePacchetto software
S-Ketamina, 25 mg/mLPfizer Inc.PAA104470Anestesia IP
oculare

Riferimenti

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  1. Cheung, C. Y., Ikram, M. K., Chen, C., Wong, T. Y. Imaging retina to study dementia and stroke. Progress in Retinal and Eye Research. 57, 89-107 (2017).
  2. Selvam, S., Kumar, T., Fruttiger, M. Retinal vasculature development in health and disease. Progress in Retinal and Eye Research. 63, 1-19 (2018).
  3. Ma, Y., et al. Quantitative analysis of retinal vessel attenuation in eyes with retinitis pigmentosa. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (7), 4306-4314 (2012).
  4. Eysteinsson, T., Hardarson, S. H., Bragason, D., Stefansson, E. Retinal vessel oxygen saturation and vessel diameter in retinitis pigmentosa. Acta Ophthalmologica. 92 (5), 449-453 (2014).
  5. Al-Latayfeh, M., Silva, P. S., Sun, J. K., Aiello, L. P. Antiangiogenic therapy for ischemic retinopathies. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2 (6), 006411(2012).
  6. Wang, S., Villegas-Perez, M. P., Vidal-Sanz, M., Lund, R. D. Progressive optic axon dystrophy and vacuslar changes in rd mice. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41 (2), 537-545 (2000).
  7. Liu, H., et al. Photoreceptor cells influence retinal vascular degeneration in mouse models of retinal degeneration and diabetes. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 57 (10), 4272-4281 (2016).
  8. Steingrimsson, E., Copeland, N. G., Jenkins, N. A. Melanocytes and the microphthalmia transcription factor network. Annual Review of Genetics. 38, 365-411 (2004).
  9. Arnheiter, H. The discovery of the microphthalmia locus and its gene. Mitf. Pigment Cell & Melanoma Research. 23 (6), 729-735 (2010).
  10. Garcia-Llorca, A., Aspelund, S. G., Ogmundsdottir, M. H., Steingrimsson, E., Eysteinsson, T. The microphthalmia-associated transcription factor (Mitf) gene and its role in regulating eye function. Scientific Reports. 9 (1), 15386(2019).
  11. Bharti, K., Liu, W., Csermely, T., Bertuzzi, S., Arnheiter, H. Alternative promoter use in eye development: the complex role and regulation of the transcription factor MITF. Development. 135 (6), 1169-1178 (2008).
  12. Lu, S. Y., Li, M., Lin, Y. L. Mitf induction by RANKL is critical for osteoclastogenesis. Molecular Biology of the Cell. 21 (10), 1763-1771 (2010).
  13. Pillaiyar, T., Manickam, M., Jung, S. H. Recent development of signaling pathways inhibitors of melanogenesis. Cellular Signalling. 40, 99-115 (2017).
  14. Danielsson, S. B., Garcia-Llorca, A., Reynisson, H., Eysteinsson, T. Mouse microphthalmia-associated transcription factor (Mitf) mutations affect the structure of the retinal vasculature. Acta Ophthalmologica. 100 (8), 911-918 (2022).
  15. Burns, S. A., Elsner, A. E., Gast, T. J. Imaging the retinal vasculature. Annual Review of Vision Science. 7, 129-153 (2021).
  16. Wei, W., et al. Automated vessel diameter quantification and vessel tracing for OCT angiography. Journal of Biophotonics. 13 (12), e202000248(2020).
  17. Salas, M., et al. Compact akinetic swept source optical coherence tomography angiography at 1060 nm supporting a wide field of view and adaptive optics imaging modes of the posterior eye. Biomedical Optics Express. 9 (4), 1871-1892 (2018).
  18. Albanna, W., et al. Non-invasive evaluation of neurovascular coupling in the murine retina by dynamic retinal vessel analysis. PLoS One. 13 (10), e0204689(2018).
  19. Moult, E. M., et al. Evaluating anesthetic protocols for functional blood flow imaging in the rat eye. Journal of Biomedical Optics. 22 (1), 16005(2017).

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