Il presente protocollo descrive come utilizzare una lesione mediata da FeCl3 per indurre trombosi arteriosa e come raccogliere e preparare campioni di lesioni arteriose nelle varie fasi della trombosi per l'analisi al microscopio elettronico.
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Articolo metodologico
Trombosi arteriosa indotta da cloruro ferrico e raccolta di campioni per l'analisi al microscopio elettronico 3D
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le malattie cardiovascolari sono una delle principali cause di mortalità e morbilità in tutto il mondo. La trombosi aberrante è una caratteristica comune di condizioni sistemiche come il diabete e l'obesità e malattie infiammatorie croniche come l'aterosclerosi, il cancro e le malattie autoimmuni. In caso di lesione vascolare, di solito il sistema di coagulazione, le piastrine e l'endotelio agiscono in modo orchestrato per prevenire il sanguinamento formando un coagulo nel sito della lesione. Le anomalie in questo processo portano a sanguinamento eccessivo o trombosi incontrollata / insufficiente attività antitrombotica, che si traduce in occlusione dei vasi e sue sequele. Il modello di danno carotidea indotto da FeCl3 è uno strumento prezioso per sondare come la trombosi inizia e progredisce in vivo. Questo modello comporta danni endoteliali / denudazione e successiva formazione di coaguli nel sito danneggiato. Fornisce un test quantitativo altamente sensibile per monitorare il danno vascolare e la formazione di coaguli in risposta a diversi gradi di danno vascolare. Una volta ottimizzata, questa tecnica standard può essere utilizzata per studiare i meccanismi molecolari alla base della trombosi, nonché i cambiamenti ultrastrutturali nelle piastrine in un trombo in crescita. Questo test è utile anche per studiare l'efficacia degli agenti antitrombotici e antipiastrinici. Questo articolo spiega come avviare e monitorare la trombosi arteriosa indotta da FeCl3 e come raccogliere campioni per l'analisi mediante microscopia elettronica.
Introduzione
La trombosi è la formazione di un coagulo di sangue che blocca parzialmente o completamente un vaso sanguigno, impedendo il flusso naturale del sangue. Ciò porta a eventi cardiovascolari gravi e fatali, come cardiopatia ischemica e ictus. Le malattie cardiovascolari sono la principale causa di morbilità e mortalità e causano un decesso su quattro in tutto il mondo 1,2,3. Sebbene la trombosi si manifesti come un malfunzionamento del sistema vascolare, potrebbe essere il risultato di un'infezione microbica o virale sottostante, di un disturbo immunitario, di un tumore maligno o....
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Protocollo
Tutti gli esperimenti discussi qui sono stati esaminati e approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) presso l'Università del Kentucky.
NOTA: Gli strumenti chirurgici sono elencati nella Figura 1 e nella Tabella dei materiali. Sono stati utilizzati topi C57BL/6J, di 8-10 settimane, ceppi maschi/femmine o rilevanti geneticamente manipolati (Knockout o Knockin).
1. Lesione dell'arteria carotide indotta da FeCl3
- Induzione dell'anestesia del topo
- Pesare il mouse.
- Anestetizzare il topo iniettan....
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Risultati
I dati sono generalmente presentati come tempo di occlusione, o tempo necessario per formare un trombo completamente occlusivo. Questi dati possono essere tracciati come una curva di sopravvivenza di Kaplan-Meier (Figura 4A)19, un dot plot con barre che mostrano il flusso sanguigno terminale al momento della cessazione del flusso sanguigno o della fine di un esperimento (Figura 4B), o come un grafico a linee (Figura 4C).
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Discussione
L'applicazione topica di FeCl3 al sistema vascolare per indurre trombosi è una tecnica ampiamente utilizzata ed è stata determinante nello stabilire ruoli per vari recettori piastrinici, vie di segnalazione del ligando e loro inibitori20,21,22,23. Il meccanismo attraverso il quale FeCl3 provoca trombosi è sfaccettato; In precedenza, la denudazione endoteliale era considera.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno conflitti di interesse relativi a questo studio.
Profili ORCID: S.J.: 0000-0001-6925-2116; S.W.W.: 00000-0001-5577-0473.
Ringraziamenti
Gli autori ringraziano i membri del Whiteheart Laboratory per la loro attenta lettura di questo manoscritto. Il lavoro è stato supportato da sovvenzioni del NIH, NHLBI (HL56652, HL138179 e HL150818) e un Department of Veterans Affairs Merit Award a S.W.W., R01 HL 155519 a BS e NIBIB intramural program grant a R.D.L.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 0,9% soluzione salina | Fisher Scientific | BP358-212 | NaCl utilizzato per produrre una soluzione di soluzione salina allo 0,9% |
| Siringa da 1 ml | Becton, Dickinson e compagnia | ||
| 190 Proof Etanolo | KOPTEC | V1101 | Utilizzato per fare una soluzione di etanolo al 70% da utilizzare per preparare il topo per la chirurgia. |
| 2,2,2 Tribromoetanolo | Sigma Aldrich | 48402 | |
| 25 Yard sutura di seta intrecciata nera (5-0) | DEKNATEL | 136082-1204 | |
| 26G x 3/8 ago | Becton, Dickinson e compagnia | 305110 | |
| 2-metil-2-butanolo | Sigma Aldrich | 240486 | |
| Pipetta di trasferimento da 7,5 mL, graduata a 3 mL | Globe Scientific Inc. | 135010 | |
| Tamponi per la preparazione dell'alcol (70% alcol isopropilico) | Medline | MDS090735 | |
| Araldite GY 502 | Servizi di microscopia elettronica | 10900 | |
| Piatto per colture cellulari 35 mm x 10 mm | Corning Incorporated | ||
| Bilancia compatta | La scienza di Ward | 470314-390 | |
| Forbici da dissezione, lunghezza 12,5 cm | Strumento di precisione mondiale | 15922-G | |
| Attivatore DMP-30 | Servizi di microscopia elettronica | 13600 | |
| Anidride dodenilsuccinica/ Servizi di | microscopia elettronica DDSA | 13700 | |
| Doggy Poo Bags/sacchetto per lo smaltimento delle carcasse di animali | Crown Products | PP-RB-200 | |
| Doppler FlowProbe | Transonic Systems Inc. | Resina EMBED 812 MA0.5PSB | |
| Servizi di microscopia elettronica | 14900 | ||
| Alcool etilico, anidro 200 proof | Servizi di microscopia elettronica | 15055 | |
| Pinze per medicazione per occhi, 4" completamente curve, standard, punte larghe 0,8 mm | Carta da filtro Integra Miltex | 18-784 | |
| VWR | 28310-106 | ||
| Forbici fini - Strumenti per la scienza fine affilati e smussati | 14028-10 | ||
| Punzoni per orecchie con passante per le dita | Strumenti di Fine Science | 24212-01 | |
| Spugne di garza 2" x 2" – 12 strati | Dukal Corporation | 2128 | |
| Glutaraldeide (soluzione al 10%) | Servizi di microscopia elettronica | 16120 | |
| Lama chirurgica in acciaio al carbonio Integra Miltex #10 | Integra® Miltex® | 4110 | |
| Cloruro di ferro (III) | SIGMA-ALDRICH | 157740-100G | |
| Manico per coltello Miltex® Acciaio Inox Extra Fine Misura 3 | Integra Lifesciences | 157510 | |
| Acido L-aspartico | Sigma Pescatore | A93100 | |
| Acido L-aspartico | Fisher Scientific | BP374-100 | |
| Nitrato di piombo | Fisher Scientific | L-62 | |
| LEICA S8AP0 Microscopio | LEICA | Non più disponibile | Non più disponibile presso l'azienda |
| LEICA S8AP0 Microscopio Stand | LEICA | 10447255 | Non più disponibile presso l'azienda |
| Tergicristalli per tessuti leggeri | VWR | 82003-822 | |
| Pinze per microdissezione; 1x2 denti, curva completa; larghezza punta 0,8 mm; lunghezza 4 | Roboz Surgical Instrument Company | RS-5157 | |
| tetrossido di osmio 4% soluzione acquosa | Servizi di microscopia elettronica | 19150 | |
| Paraformaldeide (soluzione al 16%) | Servizi di microscopia elettronica | 15710 | |
| Ferricianuro di potassio | SIGMA-ALDRICH | P-8131 | |
| Ossido di propilene, reagente ACS | Servizi di microscopia elettronica | 20401 | |
| Pipetta classica Rainin PR-10 | di portata da ricerca 17008649 | Rainin | |
| Sistemi transonici Inc. | T402B01481 | Modello: T402 | |
| Scotch Magic Invisible Tape, 3/4" x 1000", Clear | Scotch | ||
| Tappetino riscaldato per piccoli animali | K& H Produzione Inc. | Modello: tampone di | |
| 0,2 M, pH7,4 | Servizi di microscopia elettronica. | 11623 | |
| Applicatori sterili in cotone con punta | Prodotti medici puritani | 25-806 1WC | |
| Steromaster Illuminator | Fisher Scientific | 12-562-21 | Non più disponibile presso l'azienda |
| Surgical Dumont #7 Pincipe | Strumenti di Fine Science | 11271-30 | |
| Tiocarbobidrazide (TCH) | SIGMA-ALDRICH | 88535 | |
| Ricariche universali per punte per pipette a bassa ritenzione (0,1-10 &; L) | VWR | 76323-394 | |
| con acetato di uranile | 22400 | ||
| Veet Gel Cream Hair Remover | Reckitt Benckiser | 3116875 | |
| Bianco Antistatico Esagonali Pesare Barche, Medio, 64 x 15 x 19 mm | Fisher Scientific | Software S38975 | |
| WinDAQ/100 per Windows | DATAQ Instruments, Inc. | Versione 3.38 | Disponibile gratuitamente per il download. https://www.dataq.com/products/windaq/ |
| ZEISS AxioCam Icc 1 | ZEISS | 57615 |
Riferimenti
- Lozano, R., et al. Global and regional mortality from 235 causes of death for 20 age groups in 1990 and 2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010. Lancet. 380 (9859), 2095-2128 (2012).
- Raskob, G. E., et al.
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Ristampe e permessi
