Articolo metodologico

Generazione di sporozoiti geneticamente modificati di Plasmodium berghei

DOI:

10.3791/64992

⸱

5 maggio 2023

 , 
1Center for Tropical and Emerging Global Diseases, University of Georgia, 2Department of Cellular Biology, University of Georgia

In questo articolo

Sommario

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La malaria si trasmette attraverso l'inoculazione dello stadio sporozoite di Plasmodium da parte di zanzare infette. Il Plasmodium transgenico ci ha permesso di comprendere meglio la biologia della malaria e ha contribuito direttamente agli sforzi di sviluppo del vaccino contro la malaria. In questo articolo descriviamo una metodologia semplificata per generare sporozoiti transgenici di Plasmodium berghei .

Abstract

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La malaria è una malattia mortale causata dal parassita Plasmodium e si trasmette attraverso la puntura delle zanzare femmine di zanzara Anopheles . Lo stadio sporozooitico di Plasmodium depositato dalle zanzare nella pelle degli ospiti vertebrati subisce una fase di sviluppo obbligatorio nel fegato prima di iniziare la malaria clinica. Sappiamo poco sulla biologia dello sviluppo del Plasmodium nel fegato; l'accesso allo stadio di sporozoite e la capacità di modificare geneticamente tali sporozoiti sono strumenti fondamentali per studiare la natura dell'infezione da Plasmodium e la conseguente risposta immunitaria nel fegato. Qui presentiamo un protocollo completo per la generazione di sporozoiti transgenici di Plasmodium berghei . Modifichiamo geneticamente P. berghei allo stadio sanguigno e usiamo questa forma per infettare le zanzare Anopheles quando assumono un pasto di sangue. Dopo che i parassiti transgenici si sono sviluppati nelle zanzare, isoliamo lo stadio di sporozoite del parassita dalle ghiandole salivari della zanzara per la sperimentazione in vivo e in vitro . Dimostriamo la validità del protocollo generando sporozoiti di un nuovo ceppo di P. berghei che esprime la subunità 11 della proteina fluorescente verde (GFP) (GFP11) e mostriamo come potrebbe essere utilizzato per studiare la biologia della malaria allo stadio epatico.

Introduzione

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Nonostante i progressi nello sviluppo di farmaci e nella ricerca sulla prevenzione e il trattamento della malaria, il carico globale di malattia della malaria rimane elevato. Oltre mezzo milione di persone muoiono di malaria ogni anno, con i più alti livelli di mortalità osservati tra i bambini che vivono in regioni endemiche per la malaria, comel'Africa sub-sahariana. La malaria è causata dal parassita Plasmodium, che viene trasmesso all'uomo attraverso la puntura di zanzare Anopheles femmine che portano il parassita nelle loro ghiandole salivari. Lo stadio infettivo del Plasmodium, gli sporozoiti, si deposita nella pelle dei vertebrati ospiti durante un pasto di sangue e viaggia attraverso il flusso sanguigno per infettare le cellule del fegato, dove subiscono uno sviluppo obbligatorio (costituendo la malaria pre-eritrocitica) prima di infettare gli eritrociti. L'infezione degli eritrociti dà inizio allo stadio ematico della malaria ed è responsabile della totalità della morbilità e della mortalità associate alla malattia 2,3.

La natura obbligata dello sviluppo pre-eritrocitario del Plasmodium lo ha reso un bersaglio attraente per gli sforzi di profilassi di vaccini e farmaci4. Un prerequisito per studiare la biologia della malaria pre-eritrocitica, così come lo sviluppo di vaccini o farmaci mirati allo stadio epatico, è l'accesso agli sporozoiti di Plasmodium. Inoltre, la nostra capacità di generare sporozoiti di Plasmodium geneticamente modificati è stata determinante per il successo di tali sforzi di ricerca 5,6,7,8,9. Linee transgeniche di Plasmodium che esprimono proteine reporter fluorescenti o luminescenti ci hanno permesso di seguirne lo sviluppo in vivo e in vitro10,11. I parassiti geneticamente attenuati (GAP), generati attraverso la delezione di più geni nel Plasmodium, sono anche alcuni dei candidati vaccini più promettenti12,13.

I modelli di malaria di roditori e primati non umani ci hanno aiutato a comprendere i meccanismi delle interazioni ospite-parassita nella malaria umana a causa delle somiglianze nella biologia e nel ciclo vitale tra le specie di Plasmodium 14. L'uso di specie di Plasmodium che infettano i roditori, ma non gli esseri umani (ad esempio, P. berghei) consente il mantenimento dell'intero ciclo di vita del parassita e la generazione di sporozoiti infettivi per lo studio della malaria allo stadio epatico in un ambiente controllato di livello 1 di biosicurezza. Esiste già una varietà di protocolli separati per la generazione di parassiti transgenici del Plasmodium 15, l'infezione delle zanzare16 e l'isolamento degli sporozoiti17. In questo articolo, delineiamo un protocollo completo che combina queste metodologie al fine di generare e isolare sporozoiti transgenici di P. berghei, utilizzando il nuovo ceppo transgenico PbGFP11 come esempio. PbGFP 11 traffica l'undicesimo filamento β della proteina fluorescente verde (GFP), GFP11, nel vacuolo parassitoforo (PV) generato negli epatociti ospiti. PbGFP 11 è usato in combinazione con epatociti transgenici (Hepa1-6 background) che esprimono residui che costituiscono il frammento GFP 1-10 (GFP 1-10) nel citoplasma (cellule Hepa GFP 1-10). PbGFP11 riporta la lisi PV negli epatociti ospiti attraverso l'auto-complementazione e la riformazione della GFP funzionale e il segnale di fluorescenza verde18. Da notare che GFP 11 è codificato come una serie di sette sequenze tandem in PbGFP11 per migliorare il segnale di fluorescenza risultante. Dopo aver colorato gli sporozoiti PbGFP11 con il colorante citoplasmatico CellTrace Violet (CTV), possiamo rintracciare i parassiti. La lisi di tali parassiti intracellulari colorati con CTV provoca di per sé la fuoriuscita di CTV nel citoplasma della cellula ospite e la colorazione della cellula ospite. Oltre a visualizzare e distinguere la lisi di Plasmodium PV e/o del parassita negli epatociti dell'ospite, questo sistema può essere utilizzato in modo affidabile per studiare le vie immunitarie responsabili di uno di questi processi, attraverso la perturbazione genetica o terapeutica delle componenti molecolari di tali vie.

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Protocollo

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Tutte le ricerche che hanno coinvolto animali vertebrati nel nostro laboratorio sono state eseguite in conformità con le linee guida e i protocolli per l'uso degli animali dell'Università della Georgia.

1. Generazione di topi infetti da P. berghei

  1. Avviare l'infezione allo stadio ematico in topi C57BL/6 (B6) maschi o femmine di 6-8 settimane utilizzando parassiti selvatici di P. berghei. Per fare ciò, trasferire sangue crioconservato infetto da P. berghei (2 x 105 globuli rossi infetti), ricostituito in 400 μL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), in uno o due topi donatori intraperitoneali (i.p.).
  2. Trasferire il sangue fresco raccolto attraverso il sanguinamento retro-orbitale dai topi donatori a 5 giorni dopo l'infezione (d.p.i.) in due topi B6 naïve. Per fare ciò, raccogliere 200 μL di sangue, ricostituire con 300 μL di PBS e iniettare 200 μL i.p. nei topi riceventi. Assicurarsi che la parassitemia nei donatori in questo momento sia del 2%-5%19,20.
  3. Monitorare la parassitemia come descritto in precedenza19,20, a partire da 2 d.p.i. nei riceventi. Quando la parassitemia varia dal 3% al 5% (circa 5 d.p.i.), sopprimere i topi riceventi e poi raccogliere il sangue attraverso la puntura cardiaca o il sanguinamento retro-orbitale. Sopprimere i topi usando l'inalazione di anidride carbonica seguita da lussazione cervicale, o secondo le linee guida istituzionali.
    NOTA: Una volta che la parassitemia supera il 5%, l'efficienza di trasfezione può essere ridotta a causa dell'aumento della prevalenza di globuli rossi infetti multipli.

2. Generazione di schizonti nella cultura

  1. Raccogliere il sangue dei topi infetti nella fase 1.3 (circa 2 mL in totale da due topi) in 5 mL di soluzione di Alsever (vedere Tabella dei materiali) in un ambiente sterile. Eseguire i passaggi da 2.1 a 3.12 in condizioni sterili.
    NOTA: Le condizioni sterili includono l'uso di guanti, la pulizia di guanti e superfici con etanolo al 70%, l'utilizzo di materiali di consumo e materiali sterili e il lavoro all'interno di un armadio di biosicurezza.
  2. Centrifugare il sangue per 8 minuti a 450 x g a temperatura ambiente (RT). Scartare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 10 mL di terreno RPMI completo (RPMI 1640 con il 20% di siero fetale bovino [FBS] e l'1% di penicillina-streptomicina, v/v).
  3. Centrifugare per 8 minuti a 450 x g a RT. Risospendere il pellet in 25 mL di terreno RPMI completo e trasferirlo in un matraccio di coltura T75 con tappo filtrante.
  4. Porre in un incubatore a 36,5 °C e 5% di CO2 , agitando delicatamente per mantenere le cellule in sospensione per 16 ore.
  5. Al punto di tempo di 16 ore, controlla lo sviluppo di schizont. A tale scopo, raccogliere 500 μL del campione, centrifugare a 450 x g per 8 minuti, risospendere il pellet in 10 μL di terreno RPMI completo e preparare uno striscio di sangue sottile. Colorare lo striscio di sangue con la colorante di Giemsa19 (vedere la tabella dei materiali) e determinare la frequenza degli schizonti (Figura 1).
  6. Per un'efficienza di trasfezione ottimale, il 60%-70% dei parassiti dovrebbe essere allo stadio di schizont. Se viene determinato un numero inferiore a questa soglia, continuare la coltura come nel passaggio 2.4 e controllare ogni ora per assicurarsi che la soglia di cui sopra venga superata prima di procedere.

3. Trasfezione di Plasmodium schizonts

  1. Preparare un tampone di centrifugazione a gradiente ricostituendo 13 mL di terreno di prova a gradiente di densità (vedere Tabella dei materiali) con 1,44 mL di NaCl da 1,5 M e 5,6 mL di NaCl 0,15 M in una provetta da centrifugazione da 50 mL.
  2. Trasferire 25 mL di emocoltura in una nuova provetta da centrifugazione da 50 mL. Stratificare con cura 20 mL di tampone di centrifugazione a gradiente sul fondo della provetta di centrifugazione utilizzando una pipetta di vetro stretta per creare una colonna a gradiente. Fare attenzione a non disturbare gli strati e le interfacce del liquido e garantire una chiara divisione tra il tampone e il fluido.
  3. Centrifugare per 20 minuti a 450 x g senza freno a RT. Utilizzando una pipetta Pasteur, rimuovere con cautela lo strato di schizont15 situato all'interfaccia tra il terreno di coltura e il tampone di centrifugazione a gradiente e inserirlo in una nuova provetta di centrifugazione da 50 mL.
  4. Risospendere gli schizonti isolati in un terreno RPMI completo e portare il volume totale a 40 mL. Centrifugare a 450 x g per 8 minuti a RT ed eliminare il surnatante.
  5. Risospendere gli schizonti in 10 mL di terreno RPMI completo. Quindi, trasferire 1 mL di questa soluzione in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL per ogni trasfezione e centrifugare a 16.000 x g per 5 s per pellettare i globuli rossi infetti. I globuli rossi infetti derivati da due topi nel modo sopra descritto possono essere utilizzati per un massimo di 10 trasfezioni separate.
  6. Combinare 100 μL di tampone per elettroporazione (soluzione nucleofettrice dal kit di elettroporazione; vedere Tabella dei materiali) a RT con 5 μg di DNA plasmidico bersaglio circolare o linearizzato (fino a un volume massimo di 10 μL), a seconda dei casi per ciascuna trasfezione in provette separate per microcentrifuga da 1,5 mL. Un campione "senza plasmide" deve essere incluso come controllo per la trasfezione e la selezione degli antibiotici.
  7. Rimuovere il surnatante dopo la centrifugazione dal punto 3.5 e risospendere con cautela i globuli rossi infetti nella soluzione nucleofettrice preparata + DNA plasmidico (dal passaggio 3.6).
  8. Trasferire la sospensione (soluzione nucleofettore + plasmide + schizonti; massimo 110 μL) in cuvette per elettroporazione. Trasfettare utilizzando un programma nucleofettore adatto (U-033, vedi Tabella dei materiali).
    NOTA: Assicurarsi che i passaggi da 3.8 a 3.10 vengano eseguiti a RT.
  9. Aggiungere 100 μL di terreno RPMI completo alla cuvetta e trasferire l'intera soluzione (ora 200 μL di volume totale) in una provetta per microcentrifuga da 1,5 mL e mantenere a RT.
  10. Iniettare la soluzione da 200 μL di parassiti trasfettati nei topi per via endovenosa (e.v.), lavorando per ridurre al minimo il tempo tra la trasfezione e l'iniezione finale nei topi.
    NOTA: Gli schizonti trasfettati vengono iniettati nei topi meno di 5 minuti dopo l'elettroporazione per massimizzare l'efficienza del protocollo.

4. Selezione dei parassiti trasfettati

  1. Controllare i livelli di parassitemia nei topi inoculati con gli schizonti trasfettati giornalmente a partire da 2 d.p.i. per verificare l'infezione.
  2. Una volta verificata l'infezione, iniziare la selezione del farmaco utilizzando la somministrazione orale del farmaco in acqua potabile, offerta ad libitum.
    NOTA: La pirimetamina è stata impiegata come marcatore farmacologico selezionabile per il plasmide. In questo caso, 17,5 mg di pirimetamina sono stati aggiunti a 250 mL di acqua pulita (concentrazione finale di 70 mg/L). Inoltre, 10 g di zucchero sono stati aggiunti a quest'acqua per incoraggiare un adeguato consumo dell'acqua contenente pirimetamina da parte dei topi.
  3. Monitorare la parassitemia ogni due giorni utilizzando strisci di sangue realizzati con 5 μl di sangue, a partire da 6 giorni dopo l'inizio del trattamento con pirimetamina. La mancanza di parassiti rilevabili dopo 15 giorni indica una trasfezione fallita; In questo caso, riavviare il processo dal passaggio 1.1 per un nuovo tentativo.
  4. Quando la parassitemia raggiunge almeno l'1%, trasferire i parassiti a topi B6 naïve per la creazione di ceppi di parassiti allo stadio ematico. Continuare la selezione nei topi appena infettati fino a quando la parassitemia non raggiunge il 2%-5%, a quel punto generare scorte e crioconservarle21.

5. Infezione delle zanzare con le linee transgeniche

  1. Infettare topi B6 con 200 μL di sangue contenente i parassiti selezionati (2 x 105 globuli rossi infetti/topo, e.v.). Determinare la parassitemia in questi topi il giorno dell'alimentazione e dell'infezione da zanzare. La parassitemia tra il 2% e il 5% è ottimale per l'infezione delle zanzare. Una volta verificata, trasferire immediatamente l'infezione alle zanzare femmine di zanzara Anopheles stephensi secondo i passaggi 5.2-5.4).
    NOTA: Le incubatrici contenenti zanzare per l'infezione devono essere mantenute a 20.5 °C, all'80% di umidità e con un ciclo luce/buio di 12 ore (luci accese tra le 07:00 e le 19:00).
  2. Il giorno prima dell'infezione da zanzare, separare le zanzare femmine posizionando una fonte di calore sopra la gabbia contenente zanzare sia maschi che femmine, come una sottile vescica di plastica o un guanto riempito con acqua riscaldata a 37 °C. Rimuovere le zanzare femmine, che sono attratte dalla fonte di calore, utilizzando un aspiratore per insetti e trasferirle in una gabbia separata e più piccola per l'infezione.
    NOTA: Le zanzare maschi possono essere distinte dalle zanzare femmine per le loro dimensioni corporee leggermente ridotte e le antenne piumose.
  3. Iniettare ai topi infetti un anestetico generale (ad es. tribromoetanolo al 2%/avertina). Garantire un'anestesia completa pizzicando saldamente il cuscinetto del piede di ciascun mouse. Se non reagiscono, sono sufficientemente sedati e pronti a trasferire l'infezione nelle zanzare.
  4. Posizionare i topi anestetizzati sopra le zanzare femmine in gabbia (dal punto 5.2) sotto il decubito sternale. Allargare manualmente le zampe anteriori e posteriori per fornire la massima superficie per l'alimentazione delle zanzare. Lasciare i topi infetti sopra ogni gabbia per un totale di 15 minuti, controllando ogni 5 minuti per assicurarsi che i topi non siano svegli. Una volta completata l'alimentazione, sopprimere i topi utilizzando la lussazione cervicale, o secondo il protocollo istituzionale per l'uso degli animali, e smaltirli in modo sicuro.

6. Raccolta di sporozoiti

  1. Controllare l'intestino medio della zanzara per le oocisti a circa 10 d.p.i. per verificare l'avvenuta infezione e lo sviluppo di Plasmodium all'interno delle zanzare. Isolare l'intestino medio della zanzara dall'addome rimuovendo il segmento addominale terminale utilizzando una pinza. Visualizzare l'intestino medio sotto la luce polarizzata per la presenza di oocisti22.
  2. Si prevede che gli sporozoiti selvatici siano presenti nelle ghiandole salivari delle zanzare 18-21 giorni dopo essersi nutriti di topi infetti. Al 18° giorno, sezionare 5-10 zanzare per valutare il numero di sporozoiti.
    NOTA: Le zanzare vengono lavate e uccise nell'etanolo. Successivamente, le zanzare morte vengono lavate due volte con PBS per rimuovere i detriti prima della dissezione.
  3. Per isolare e contare gli sporozoiti, rimuovere con cautela la testa della zanzara esercitando una pressione sul torace della zanzara utilizzando una pinza o un ago da dissezione fine. Le ghiandole salivari rimangono attaccate alla testa rimossa (Figura 2).
  4. Rimuovere eventuali ulteriori detriti di zanzare dalle ghiandole salivari e metterli in una provetta per microcentrifuga contenente 400 μL di terreno di dissezione delle zanzare (terreno Ealge modificato di Dulbecco [DMEM] con l'1% di siero di topo, 100 U/mL di penicillina e 100 μg/mL di streptomicina; vedere la tabella dei materiali).
  5. Distruggere le ghiandole salivari isolate passando attraverso una siringa con ago da 30 G 15-20 volte. Mettere 10 μL delle ghiandole salivari interrotte nei terreni di dissezione delle zanzare in un emocitometro e contare. Risospendere nella concentrazione desiderata di terreno di dissezione delle zanzare o PBS per l'iniezione nei topi, l'inoculazione in colture cellulari o la crioconservazione a lungo termine23,24.

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Risultati

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Determinare la frequenza e lo sviluppo degli schizonti è fondamentale per garantire che un numero sufficiente di parassiti vitali si trovi nella fase ottimale per la trasfezione. Gli schizonti immaturi possono essere differenziati dagli schizonti completamente maturi per la presenza di un minor numero di merozoiti che non riempiono l'intero spazio intracellulare dei globuli rossi (Figura 1B). È importante notare che quando si eseguono strisci di sangue da sangue coltivato, i globuli rossi in...

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Discussione

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Abbiamo utilizzato il protocollo di cui sopra nel nostro laboratorio per creare diverse linee di parassiti transgenici P. berghei. Sebbene ottimizzato per P. berghei, abbiamo anche utilizzato con successo questo protocollo per generare sporozoiti transgenici di P. yoelii. Dopo aver iniettato gli schizonti trasfettati nei topi, i parassiti sono rilevabili in genere non più tardi di 3 d.p.i. in tutti i gruppi, compreso il controllo senza plasmidi. La selezione viene avviata solo una volta che la ...

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Dichiarazioni

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Gli autori dichiarano di non avere alcun conflitto di interessi.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è stato sostenuto dalla sovvenzione del National Institutes of Health AI168307 a SPK.  Ringraziamo il nucleo di citometria a flusso UGA CTEGD e il nucleo di microscopia UGA CTEGD. Riconosciamo anche i contributi di Ash Pathak, Anne Elliot e dello staff di UGA Sporocore nell'ottimizzazione del protocollo. Vogliamo ringraziare il Dr. Daichi Kamiyama per le preziose intuizioni, la discussione e i plasmidi genitori contenenti GFP11 e GFP 1-10. Vorremmo anche ringraziare i membri del laboratorio Kurup per il loro costante supporto, pazienza e incoraggiamento.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
30 G x 1/2" Ago per siringaExel international26437
Soluzione di AlseverSigma-AldritchA3551-500ML
Amaxa Basic Parasite Nucleofector Kit 2LonzaVMI-1021
Avertin (2,2,2-Tribromoetanolo)TCI AmericaT1420
Provette per la raccolta del sangueBDbioscience 365967per prelievo di siero
Ematocitometro monouso C-ChipINCYTODHC-N01-5
CellVeiw Piatto per colture cellulariGreiner Bio-One627860
Centrifuga 5425Eppendorf5405000107
Centrifuga 5910REppendorf5910RPer centrifugazione in gradiente
Delta Vision II - Sistema di microscopio invertitoOlympusIX-71
Dimetil solfossido SigmaD5879-500ml
Siero fetale bovinoGenClone25-525
GFP11 plasmideKurup LabpSKspGFP11Generato da PL0017
plasmide Giemsa StainSigma-Aldritch48900-1L-F
Hepa GFP1-10 celluleKurup LabHepa GFP1-10Generato da cellule Hepa 1-6 (ATCC Cat# CRL-1830)
di topoutilizzato per terreni di dissezione delle zanzare
NaClMillipore-SigmaSX0420-51,5 M e 0,15 M per soluzione di percoll
Nucleofector IIAmaxa Biosystems (Lonza)Programma U-033 utilizzato per l'elettroporazione dei globuli rossi
Pipetta PasteurVWR14673-043
Penicillina/StreptomicinaSigma-AldritchP0781-100ML
Percoll (Gradiente di densità)Cytivia17-0891-02Dettagli nel protocollo
PL0017 PlasmideBEI ResourcesMRA-786
Pirimetamina (per somministrazione orale)Sigma46706Dettagli di preparazione: Aggiungere 17,5 mg di pirimetamina a 2,5 mL di DMSO. Vortice, se necessario per sciogliersi completamente; Regolare il pH di 225 mL di dH2O a 4 utilizzando HCL. Aggiungere la pirimetamina in DMSO all'acqua e portare a 250 ml. Aggiungere 10 g di zucchero per incoraggiare il consumo regolare di acqua drogata. La pirimetamina è sensibile alla luce. Usa una bottiglia scura o una bottiglia ricoperta di foglio di alluminio quando tratti i topi.
RPMI 1640Corning15-040-CV
Software per microscopia SoftWoRxPrecisione applicatav6.1.3
Siero

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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