Il presente protocollo descrive l'intera procedura di analisi per il trasporto assonale. In particolare, qui vengono mostrati il calcolo della velocità di trasporto, esclusa la pausa, e il metodo di visualizzazione utilizzando il software ad accesso aperto "KYMOMAKER".
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Articolo metodologico
Misurazione del trasporto di merci assonale nei neuroni corticali primari di topo
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le cellule neuronali sono cellule altamente polarizzate che ospitano stereotipicamente diversi dendriti e un assone. La lunghezza di un assone richiede un efficiente trasporto bidirezionale da parte delle proteine motorie. Vari studi hanno suggerito che i difetti nel trasporto assonale sono associati a malattie neurodegenerative. Inoltre, il meccanismo di coordinazione di più proteine motrici è stato un argomento interessante. Poiché l'assone ha microtubuli unidirezionali, è più facile determinare quali proteine motorie sono coinvolte nel movimento. Pertanto, la comprensione dei meccanismi alla base del trasporto del carico assonale è fondamentale per scoprire il meccanismo molecolare delle malattie neurodegenerative e la regolazione delle proteine motorie. Qui, introduciamo l'intero processo dell'analisi del trasporto assonale, compresa la coltura di neuroni corticali primari di topo, la trasfezione di plasmidi che codificano proteine cargo e le analisi direzionali e di velocità senza l'effetto di pause. Inoltre, viene introdotto il software ad accesso aperto "KYMOMAKER", che consente la generazione di un chimografo per evidenziare le tracce di trasporto in base alla loro direzione e consentire una più facile visualizzazione del trasporto assonale.
Introduzione
I membri della famiglia delle chinesine e la dineina citoplasmatica sono proteine motrici che si muovono lungo i microtubuli nelle cellule per trasportare il loro carico1. La maggior parte delle chinesine si muove verso l'estremità positiva, mentre la dineina si muove verso l'estremità negativa di un microtubulo. Le funzioni e i meccanismi del trasporto di merci nell'assone neuronale sono stati ampiamente studiati. A causa della loro lunghezza, gli assoni richiedono un trasporto stabile a lunga distanza per mantenere la salute dei neuroni. Difetti nel trasporto di mitocondri, autofagosomi e vescicole contenenti....
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Protocollo
Gli esperimenti sono stati approvati dal Comitato per gli Studi Animali dell'Università di Hokkaido, seguendo le linee guida ARRIVE (Animal Research: Reporting of In Vivo Experiments). Per il presente studio sono stati utilizzati topi femmina C57BL/6J (incinta, 15,5 giorni).
1. Preparazione di neuroni corticali primari di topo in coltura
- Aggiungere 0,1 mg/mL di poli-L-lisina in 0,1 M Tris (tris(idrossimetil)amminometano)-HCl (pH 8,5) in una camera con fondo di vetro a 8 pozzetti (n. 1,0) (vedere la Tabella dei materiali). Incubare la camera in un'incubatrice a 3....
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Risultati
I neuroni primari coltivati dalla corteccia di topo E15.5 sono stati coltivati in un piatto con fondo di vetro come descritto. Ad esempio, APP-EGFP, Alcα-EGFP o Alcβ-EGFP erano espressi nei neuroni corticali primari. È noto che APP e Alcα vengono trasportati nell'assone dalla chinesina-1 2,17. APP si associa con la chinesina-1 tramite la proteina adattatore JIP1 (proteina 1 che interagisce con JNK), mentre Alcα si lega direttamente tramite i suo.......
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Discussione
Viene descritto un metodo di analisi per il trasporto assonale, che include il calcolo della velocità segmentata e la generazione di chimografi. Un passaggio critico durante la fase di trasfezione è il mantenimento della salute dei neuroni in coltura. Il metodo di trasfezione descritto da Jiang e Chen29 è stato seguito con piccole modifiche. La miscelazione delicata della soluzione di DNA/CaCl2 e 2x HBS ha aumentato l'efficienza della trasfezione riduce.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto da KAKENHI (22K15270, Grant-in-Aid for Young Scientists) e dalla Akiyama Life Science Foundation for YS. Vorremmo esprimere la nostra gratitudine al Dr. Masataka Kinjo e al Dr. Akira Kitamura, Laboratorio di Dinamica Cellulare Molecolare, Facoltà di Scienze della Vita Avanzate, Università di Hokkaido per aver fornito input e competenze critiche che hanno notevolmente aiutato la ricerca. L'osservazione con microscopia TIRF è stata eseguita utilizzando lo strumento installato presso il Laboratorio di Dinamica Cellulare Molecolare, Facoltà di Scienze della Vita Avanzate, Università di Hokkaido. Lo strument....
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 5-Fluoro-2-deossiuridina | Sigma-Aldrich | F0503 | |
| Apo TIRF 100x/1.49 OLIO | Nikon | ||
| B-27 Integratore (50x), senza siero | Thermo fischer scientific | 17504044 | |
| Albumina sierica bovina | Wako | 013-25773 | |
| CalPhos Kit di trasfezione dei mammiferi | Takara | 631312 | |
| Filtro cellulare 40 & micro; m Nylon | Falcon | 352340 | |
| CoolSNAP HQ | Fotometria | ||
| desossiribonucleasi I | Sigma-Aldrich | DN-25 | |
| D-glucosio | Wako | 041-00595 | |
| DMEM/Ham' s F-12 | Wako | 042-30555 | |
| Dumont n. 7 pinze | Dumont | No.7 | |
| Lama chirurgica in piuma | Feather | No.11 | |
| Manico della lama chirurgica della piuma | Feather | No. 3 | |
| Gentamicin | Wako | 079-02973 | |
| Gentamicin Sulfate | Wako | 075-04913 | |
| GlutaMAX Integratore | Thermo fischer scientific | 35050061 | |
| HEPES | DOJINDO | 342-01375 | |
| Siero di cavallo, inattivato a caldo | Thermo fischer scientific | 26050088 | |
| KCl | Wako | 163-03545 | |
| KH2PO4 | Wako | 169-04245 | |
| KYMOMAKER | http://www.pharm.hokudai.ac.jp/shinkei/Kymomaker.html | ||
| L-15 Medium (Leibovitz) | Sigma-Aldrich | L5520 | |
| MetaMorph versione 6.2r1 | Metamorph | ||
| Na2HPO4 | Wako | 197-02865 | |
| NaCl | Wako | 197-01667 | |
| NaHCO3 | Wako | 191-01305 | |
| Neurobasal Medium | Thermo fischer scientific | 21103049 | |
| Nikon ECLIPSE TE 2000-E | Nikon | ||
| Nunc Lab-Tek 8 pozzetti Coverglass a camera | Thermo fischer scientific | 155411 | |
| Papaina | Worthington | LS003126 | |
| Penicillina-Streptomicina (10.000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Idrobromuro di poli-L-lisina | Sigma-Aldrich | P2636-500MG | |
| Trizma base | Merck | T1194-10PAK | risolto con acqua per ottenere 0,1 M Tris-HCl (pH.8,5) |
Riferimenti
- Hirokawa, N., Noda, Y., Tanaka, Y., Niwa, S. Kinesin superfamily motor proteins and intracellular transport. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (10), 682-696 (2009).
- Stokin, G. B., et al. Axonopathy and transport deficits early in the....
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Ristampe e permessi
