Articolo metodologico

Metodi per studiare l'ottica, la fisiologia e la biochimica dell'occhio composto dalla mosca

24 marzo 2023

 , 
1Department of Medical Neurobiology, Faculty of Medicine and the Edmond and Lily Safra Center for Brain Sciences (ELSC), Hebrew University

In questo articolo

Abstract

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ARTICOLI DISCUSSI:

Muñoz Arias, M., Douglass, J. K., Wehling M. F., Stavenga, D. G. Mappatura automatizzata dello spazio visivo degli occhi composti di mosche domestiche. Giornale degli esperimenti visualizzati. (181), e63643 (2022).

Wagner, K., Smylla, T. K., Zeger, M., Huber, A. Studio del traffico proteico di membrana nelle cellule fotorecettrici di Drosophila utilizzando proteine marcate con eGFP. Giornale degli esperimenti visualizzati. (179), E63375 (2022).

Gutorov, R., Katz, B., Minke, B. Metodi elettrofisiologici per misurare i livelli di fotopigmento nei fotorecettori di Drosophila. Giornale degli esperimenti visualizzati. (184), e63514 (2022).

Liu, J., Liu, Y., Chen, W., Ding, Y., Lan, X., Liu, W. Purificazione dei canali del potenziale recettore transitorio endogeno della Drosophila. Giornale degli esperimenti visualizzati. (178), E63260 (2021).

Panda, A., Thakur, R., Kumari, A., Raghu, P. Analisi della segnalazione lipidica nei fotorecettori di Drosophila utilizzando la spettrometria di massa. Giornale degli esperimenti visualizzati. (181), E63516 (2022).

Editoriale

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L'occhio composto dalla mosca è un importante sistema modello biologico per chiarire i meccanismi biologici fondamentali. Alcuni dei meccanismi che sono stati studiati utilizzando questo sistema includono quanto segue: visione oculare composta con un campo visivo quasi panoramico1; la biofisica, l'assemblaggio delle proteine e la biogenesi del recettoreaccoppiato alla proteina G sensibile alla luce 2,3,4; il sistema di trasduzione del segnale mediato dalla fosfolipasi Cβ 5,6; attivazione e modulazione del canale TRP nel tessuto nativo 5,6; l'assemblaggio e la funzione del complesso di segnalazione multiproteica 7,8; la struttura molecolare, la biochimica e la funzione del riciclo dell'inositolo-fosfolipide 9,10; e la traslocazione subcellulare mediata dal segnale delle proteine di segnalazione11,12. La struttura anatomica unica e l'ottica dell'occhio composto dalla mosca sono state ampiamente studiate, rivelando meccanismi di sviluppo fondamentali e capacità visive.

Questa raccolta di metodi comprende il lavoro di eminenti scienziati che hanno sviluppato e perfezionato metodi per studiare alcuni dei meccanismi di cui sopra nell'occhio composto da mosca. Muñoz et al. descrivono un metodo per analizzare quantitativamente la disposizione ottica dell'occhio di mosca che fornisce una rappresentazione accurata dell'occhio composto e della sua organizzazione spaziale13. Questo metodo è essenziale per studiare in dettaglio l'elaborazione neuronale delle informazioni visive. È importante sottolineare che ci sono stati molti tentativi di produrre occhi artificiali bio-ispirati, e questi si sono basati su studi quantitativi di occhi composti esistenti. Wagner et al. utilizzano la pseudopupilla profonda, un fenomeno ottico unico dell'occhio composto, e la microscopia ad alta amplificazione con la neutralizzazione ottica della cornea per localizzare le proteine marcate con eGFP all'interno delle cellule fotorecettrici di Drosophila 14. Questo metodo consente di rilevare difetti strutturali nei rabdomeri dovuti alla degenerazione dei fotorecettori e alla localizzazione cellulare e al traffico di importanti proteine di segnalazione. Gutorov et al. utilizzano misurazioni elettrofisiologiche dall'intero occhio o da singole cellule fotorecettrici per misurare il livello degli stati fotopigmentari in vivo e le loro modulazioni da mutazioni specifiche nelle proteine di segnalazione15. Questo metodo sfrutta gli spostamenti di carica all'interno di uno stato visivo del pigmento (R) indotti dall'assorbimento di fotoni, che si traduce nella formazione di un secondo stato del pigmento stabile al buio (M). Un ulteriore metodo utilizza la depolarizzazione prolungata dopo lo spegnimento della luce (PDA) che sfrutta le proprietà bistabili scure del pigmento visivo e le differenze negli spettri di assorbimento degli stati R e M del moscerino. Poiché il PDA dipende dalla conversione di una grande quantità di fotopigmento, anche il minimo difetto nella biogenesi del fotopigmento può portare a un PDA anomalo facilmente rilevabile. Infatti, i mutanti di Drosophila che mostrano PDA anormali hanno portato alla scoperta di nuove proteine di segnalazione. Un esempio eccezionale di ciò è la scoperta del nuovo complesso proteico composto dalla proteina dell'impalcatura inattivazione ma senza postpotenziale D (INAD), dalla proteina chinasi C specifica dell'occhio (eyePKC), dalla fosfolipasi Cβ (PLCβ) e dal canale del potenziale recettoriale transitorio (TRP). Per la prima volta, Liu et al. presentano una tecnica per purificare il canale16 TRP di Drosophila. Questo metodo di purificazione dell'affinità modificata utilizza una strategia di competizione basata sul meccanismo di assemblaggio del complesso di segnalazione INAD. Questa strategia consente la purificazione del canale TRP endogeno. Secondo questo metodo, prima un frammento di PLCβ legato a microsfere di Ni viene marcato con istidina e utilizzato per abbattere il complesso proteico endogeno INAD ottenuto da omogeneizzati di testa di Drosophila. Successivamente, i frammenti di TRP che sono marcati con glutatione S-transferasi (GST) eccessivamente purificata vengono aggiunti alle perle di Ni per competere con il canale TRP endogeno legato all'INAD. Infine, la cromatografia ad esclusione dimensionale viene utilizzata per separare i frammenti del canale TRP marcati nel surnatante dal canale TRP endogeno. Panda et al. riportano una tecnica sensibile per identificare e quantificare diverse classi di lipidi nelle cellule fotorecettrici di Drosophila utilizzando la spettrometria di massa17. L'attivazione di PLCβ è fondamentale per la fototrasduzione, in quanto porta all'idrolisi del fosfatidilinositolo 4,5 bisfosfato (PI(4,5)P2) nella membrana superficiale. Questa reazione porta infine all'attivazione del canale TRP. Inoltre, l'attività della PLCβ provoca la generazione di molte specie lipidiche. E' stato proposto che molte di queste specie lipidiche possano prendere parte all'attivazione della TRP e svolgere un ruolo chiave nell'organizzazione funzionale dei fotorecettori per l'ottimizzazione della trasduzione sensoriale. Nello studio di Panda et al.17, questi risultati sono stati valutati isolando mutanti di Drosophila che ospitano enzimi difettosi che controllano i livelli di lipidi specifici.

L'occhio composto dalla mosca è un utile sistema sperimentale per chiarire i meccanismi fondamentali della biologia. La potente metodologia genetica sviluppata in Drosophila può essere utilizzata per analizzare e scoprire le proteine di segnalazione coinvolte nella fototrasduzione della mosca. Questa raccolta di metodi delinea in dettaglio le principali tecniche per studiare i meccanismi fondamentali della visione del moscerino, tra cui l'analisi anatomica e ottica dell'occhio composto e dei componenti molecolari e delle reazioni biochimiche delle cellule fotorecettrici. Gli articoli video includono anche importanti consigli sulle difficoltà intrinseche di queste metodologie. Questa raccolta di metodi dovrebbe essere vantaggiosa anche per gli scienziati al di fuori di questo campo di ricerca, in quanto queste tecniche potrebbero essere adattate ad altri preparati biologici.

Dichiarazioni

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L'autore non ha nulla da rivelare.

Ringraziamenti

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L'autore non ha riconoscimenti.

Riferimenti

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  1. Douglass, J. K., Wehling, M. F. Rapid mapping of compound eye visual sampling parameters with FACETS, a highly automated wide-field goniometer. Journal of Comparative Physiology A: Neuroethology, Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 202 (12), 839-851 (2016).
  2. Xiong, L., et al. ER complex proteins are required for rhodopsin biosynthesis and photoreceptor survival in Drosophila and mice. Cell Death and Differentiation. 27 (2), 646-661 (2020).
  3. Rosenbaum, E. E., et al. XPORT-dependent transport of TRP and rhodopsin. Neuron. 72 (4), 602-615 (2011).
  4. Vought, B. W., et al. Characterization of the primary photointermediates of Drosophila rhodopsin. Biochemistry. 39 (46), 14128-14137 (2000).
  5. Randall, A. S., et al. Speed and sensitivity of phototransduction in Drosophila depend on degree of saturation of membrane phospholipids. The Journal of Neuroscience. 35 (6), 2731-2746 (2015).
  6. Minke, B., Pak, W. L. The light-activated TRP channel: The founding member of the TRP channel superfamily. Journal of Neurogenetics. 36 (2-3), 55-64 (2022).
  7. Huber, A., et al. The transient receptor potential protein (Trp), a putative store-operated Ca 2+ channel essential for phosphoinositide-mediated photoreception, forms a signaling complex with NorpA, InaC and InaD. The EMBO Journal. 15 (24), 7036-7045 (1996).
  8. Tsunoda, S., et al. A multivalent PDZ-domain protein assembles signalling complexes in a G-protein-coupled cascade. Nature. 388 (6639), 243-249 (1997).
  9. Raghu, P., Basak, B., Krishnan, H. Emerging perspectives on multidomain phosphatidylinositol transfer proteins. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular and Cell Biology of Lipids. 1866 (9), 158984(2021).
  10. Raghu, P., Yadav, S., Mallampati, N. B. Lipid signaling in Drosophila photoreceptors. Biochimica et Biophysica Acta. 1821 (8), 1154-1165 (2012).
  11. Bahner, M., et al. Light-regulated subcellular translocation of Drosophila TRPL channels induces long-term adaptation and modifies the light-induced current. Neuron. 34 (1), 83-93 (2002).
  12. Schopf, K., Huber, A. Membrane protein trafficking in Drosophila photoreceptor cells. European Journal of Cell Biology. 96 (5), 391-401 (2017).
  13. Muñoz Arias, M., Douglass, J. K., Wehling, M. F., Stavenga, D. G. Automated charting of the visual space of housefly compound eyes. Journal of Visualized Experiments. (181), e63643(2022).
  14. Wagner, K., Smylla, T. K., Zeger, M., Huber, A. Studying membrane protein trafficking in Drosophila photoreceptor cells using eGFP-tagged proteins. Journal of Visualized Experiments. (179), e63375(2022).
  15. Gutorov, R., Katz, B., Minke, B. Electrophysiological methods for measuring photopigment levels in Drosophila photoreceptors. Journal of Visualized Experiments. (184), e63514(2022).
  16. Liu, J., Liu, Y., Chen, W., Ding, Y., Lan, X., Liu, W. Purification of endogenous Drosophila Transient Receptor Potential channels. Journal of Visualized Experiments. (178), e63260(2021).
  17. Panda, A., Thakur, R., Kumari, A., Raghu, P. Analysis of lipid signaling in Drosophila photoreceptors using mass spectrometry. Journal of Visualized Experiments. (181), e63516(2022).

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DrosophilaPhotoreceptor CellsMembrane Protein TraffickingPhotopigment LevelsElectrophysiological MethodsEndogenous ChannelsLipid SignalingMass SpectrometryVisualized Experiments

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