Stimolazione multimodale automatizzata e registrazione neuronale simultanea da più piccoli organismi

Sommario

Presentiamo un metodo per la stimolazione chimica e multimodale flessibile e la registrazione dell'attività neurale simultanea da molti vermi Caenorhabditis elegans . Questo metodo utilizza microfluidica, hardware e software open source e analisi automatizzata dei dati supervisionata per consentire la misurazione di fenomeni neuronali come l'adattamento, l'inibizione temporale e la diafonia dello stimolo.

Abstract

Gli indicatori di calcio fluorescenti geneticamente codificati hanno contribuito notevolmente alla nostra comprensione delle dinamiche neurali dal livello dei singoli neuroni a interi circuiti cerebrali. Tuttavia, le risposte neurali possono variare a causa dell'esperienza precedente, degli stati interni o dei fattori stocastici, generando così la necessità di metodi in grado di valutare la funzione neurale in molti individui contemporaneamente. Mentre la maggior parte delle tecniche di registrazione esamina un singolo animale alla volta, descriviamo l'uso della microscopia a campo largo per scalare le registrazioni neuronali a dozzine di Caenorhabditis elegans o altri organismi su scala sub-millimetrica contemporaneamente. L'hardware e il software open source consentono una grande flessibilità nella programmazione di esperimenti completamente automatizzati che controllano l'intensità e la tempistica di vari tipi di stimolo, inclusi stimoli chimici, ottici, meccanici, termici ed elettromagnetici. In particolare, i dispositivi di flusso microfluidico forniscono un controllo preciso, ripetibile e quantitativo degli stimoli chemiosensoriali con risoluzione temporale inferiore al secondo. La pipeline di analisi dei dati semi-automatizzata NeuroTracker estrae quindi le risposte neurali individuali e a livello di popolazione per scoprire cambiamenti funzionali nell'eccitabilità e nella dinamica neurale. Questo articolo presenta esempi di misurazione dell'adattamento neuronale, dell'inibizione temporale e della diafonia dello stimolo. Queste tecniche aumentano la precisione e la ripetibilità della stimolazione, consentono l'esplorazione della variabilità della popolazione e sono generalizzabili ad altri segnali fluorescenti dinamici in piccoli biosistemi da cellule e organoidi a interi organismi e piante.

Introduzione

Le tecniche di imaging del calcio hanno permesso la registrazione non invasiva delle dinamiche neurali in vivo in tempo reale utilizzando la microscopia a fluorescenza e indicatori di calcio geneticamente codificati espressi nelle cellule bersaglio ^1,2,3. Questi sensori utilizzano tipicamente una proteina fluorescente verde (GFP), come la famiglia di peptidi GFP-calmodulina-M13 (GCaMP), per aumentare l'intensità della fluorescenza dopo l'attivazione neuronale e livelli elevati di calcio intracellulare. L'imaging del calcio è stato particolarmente potente nel nematode C. elegans per esaminare come funzionano i neuroni e i circuiti neurali negli animali viventi e comportamentali 4,5,6,7,8,9,10^, poiché la loro natura trasparente significa che non è richiesto alcun processo chirurgico per l'accesso ottico e i promotori genici specifici delle cellule indirizzano l'espressione alle cellule di interesse. Queste tecniche fanno spesso uso di dispositivi microfluidici, che forniscono ambienti controllati con precisione per studiare fenomeni biologici, chimici e fisici su piccola scala fisica^11,12. I dispositivi microfluidici abbondano per misurare l'attività neurale, con nuovi progetti continuamente in fase di sviluppo e sono prontamente fabbricati nel laboratorio di ricerca. Tuttavia, molti progetti intrappolano un singolo animale alla volta, limitando il throughput sperimentale ^7,9,13. Le risposte neurali spesso variano sostanzialmente tra gli animali a causa di differenze nell'esperienza precedente, stati interni come stress o fame o fattori stocastici come i livelli di espressione genica. Queste differenze stabiliscono la necessità di metodi in grado di stimolare e osservare simultaneamente molti animali ed estrarre informazioni dagli individui⁴.

Inoltre, alcuni fenomeni neuromodulatori diventano evidenti solo in specifiche condizioni di stimolazione, come l'inibizione temporale¹⁴, che si riferisce alla breve soppressione delle risposte quando la stimolazione avviene in rapida successione. I sistemi elettrofisiologici possono guidare l'attività neurale attraverso un ampio spazio di stimolo per questo scopo, modulando, ad esempio, la corrente dell'impulso elettrico, la tensione, la frequenza, la forma d'onda, il ciclo di lavoro e la temporizzazione dei treni di stimolo periodici. La stimolazione indiretta da parte di stimoli rilevati naturalmente o sistemi optogenetici trarrebbe beneficio da una simile ampiezza di meccanismi di controllo. Attualmente, molti stimoli naturali sono presentati in modo semplice "on-off", come la presentazione e la rimozione degli odori, utilizzando sistemi commerciali che sono stati lenti ad aggiungere flessibilità. Tuttavia, i microcontrollori economici possono ora automatizzare la consegna di diversi tipi di stimoli in modo personalizzabile in base alle esigenze dei ricercatori. In combinazione con la microfluidica, questi sistemi hanno raggiunto l'obiettivo di aumentare la produttività sperimentale e la flessibilità, consentendo di misurare simultaneamente le risposte neurali a una varietà di stimoli precisi in molti animali ^4,6. La stimolazione multimodale può essere utilizzata per interrogare ulteriormente i circuiti neuronali, ad esempio monitorando i cambiamenti nell'eccitabilità neurale quando stimolano costantemente prima, durante e dopo una perturbazione ortogonale come l'esposizione al farmaco⁴. I vantaggi dei sistemi di microscopia aperti ed economici sono chiari per far progredire la ricerca scientifica, ma in pratica, la necessità di approvvigionamento delle parti, costruzione e convalida delle prestazioni può impedire l'adozione di queste tecniche.

Questo protocollo mira ad alleviare alcune di queste sfide tecniche. Mentre i protocolli precedenti si sono concentrati sull'uso di dispositivi microfluidici e sulla stimolazione di base 9,15,17, descriviamo qui la costruzione e l'uso di un sistema di somministrazione di stimoli flessibile^, automatizzato e multimodale per l'imaging neurale in C. elegans o altri piccoli organismi che utilizzano dispositivi microfluidici precedentemente descritti 4. Il sistema open source è programmato tramite semplici file di testo per definire gli esperimenti e il programma di analisi dei dati NeuroTracker estrae semi-automaticamente i dati dell'attività neurale dai video del microscopio. Dimostriamo questo sistema con esempi di valutazione dell'inibizione temporale, della disinibizione e della diafonia dello stimolo usando il neurone chemiosensoriale AWA, che depolarizza in risposta a diversi odori alimentari o in risposta alla luce quando esprime i canali ionici optogenetici sensibili alla luce ^5,6.

Protocollo

1. Apparecchiature di imaging neurale

NOTA: Vedere Lawler e Albrecht¹⁵ per istruzioni dettagliate sulla costruzione del sistema di imaging e stimolazione, che controlla i tempi di illuminazione del microscopio, l'acquisizione delle immagini e l'erogazione dello stimolo (Figura 1). Un economico controller di stimolo Arduino Nano aziona le valvole fluidiche attraverso segnali digitali a un controller della valvola e controlla l'illuminazione optogenetica attraverso segnali di tensione analogici a un controller LED. Altri stimoli, come motori a vibrazione e riscaldatori termici, possono essere controllati utilizzando segnali digitali o analogici. Il controller dello stimolo sincronizza la stimolazione e la registrazione delle immagini tramite i segnali della telecamera, come specificato dal software di controllo del microscopio Micro-Manager open source (μManager)¹⁶. Vedere la tabella dei materiali per i dettagli relativi a tutti i materiali, i reagenti, le attrezzature e gli organismi utilizzati in questo protocollo.

1. Configurare l'apparecchiatura di imaging neurale, tra cui un microscopio a epifluorescenza con ottica GFP, una fotocamera sCMOS con un segnale di uscita di esposizione digitale e un controller di stimolo¹⁵.
2. Collegare il controller di stimolo ai sistemi desiderati tramite segnali digitali o analogici. Per gli esempi presentati di seguito, vengono utilizzati i seguenti sistemi:
   1. Utilizzare un controller della valvola per la stimolazione chimica. Collegare il controller della valvola a elettrovalvole fluidiche o a manicotto (Figura 1)¹⁵.
   2. Utilizzare un LED rosso da 615 nm e un controller per la stimolazione optogenetica, montato sopra lo stadio del microscopio.
3. Configurare il computer con il software di controllo del microscopio, creare un preset di configurazione con le impostazioni dell'apparecchiatura e garantire il corretto funzionamento del controllo dello stimolo¹⁵.

2. Fabbricazione di dispositivi microfluidici

NOTA: Vedere Lagoy et ^al.17 per informazioni dettagliate su come ottenere o fabbricare gli stampi master e la produzione, l'uso e la pulizia dei dispositivi microfluidici. Questi passaggi sono riepilogati di seguito.

1. Ottenere o fabbricare uno stampo master utilizzando il file di progettazione microfluidica fornito (albrechtlab.github.io/microfluidics)¹⁷. Per i giovani adulti C. elegans, assicurarsi che l'altezza del canale sia 55-70 μm.
2. Combinare la base PDMS e l'agente di polimerizzazione con un rapporto di 10:1 in peso e mescolare accuratamente con pipette di trasferimento.
3. Degasare per 30-60 minuti in un essiccatore sottovuoto fino a quando le bolle scompaiono.
4. Posizionare lo stampo principale in una grande capsula di Petri (150 mm di diametro) e versare il PDMS degassato fino a una profondità di 4-5 mm (~100 g). Ispezionare e rimuovere eventuali polvere o bolle con una pipetta di trasferimento.
5. Cuocere in forno a 65 °C su un piano del forno per 3 ore fino a una notte.
6. Una volta polimerizzato, utilizzare un bisturi per tagliare il PDMS dallo stampo e una lama di rasoio dritta per separare i dispositivi.
7. Perforare i fori di ingresso e di uscita usando un punzone dermico da 1 mm e pulirli con dH 2 O, etanolo e di nuovo condH₂O. Asciugare il dispositivo in un flusso d'aria (vedere Figura 2A).
8. Pulire entrambi i lati del dispositivo PDMS con nastro adesivo, rimuovendo polvere o detriti.
9. Preparare i vetrini per completare il dispositivo microfluidico come descritto¹⁷. Praticare i fori di ingresso nella slitta superiore utilizzando una punta diamantata e rendere idrofoba la slitta inferiore mediante esposizione ai vapori TFOCS o applicando un trattamento con vetro idrorepellente (Figura 2B).
10. Assemblare il sandwich del dispositivo PDMS in vetro in un morsetto (Figura 2C).

3. Preparazione degli animali

1. Ottenere o creare animali con indicatori di calcio geneticamente codificati espressi nei neuroni di interesse.
   NOTA: ad esempio, la linea NZ1091 (kyIs587 [gpa-6p::GCaMP2.2b; unc-122p::d sRed]; kyIs5662 [odr-7p::Chrimson:SL2:mCherry; elt-2p::mCherry]) esprime GCaMP e il canale cationico sensibile alla luce rossa Chrimson nella coppia di neuroni sensoriali AWA⁶. Entrambi i transgeni sono integrati nel genoma per un'espressione stabile in ogni animale.
2. Un giorno prima della sperimentazione, posizionare almeno 20 L4 stadio larvale C. elegans per esperimento su una piastra di agar terreno di crescita nematode (NGM) seminata con un prato OP50 E. coli. Se mantenuto a 20 °C, questo sincronizzerà gli animali selvatici nella fase di giovane adulto il giorno successivo.
   NOTA: Per i transgeni array, scegliere gli animali utilizzando uno stereoscopio a fluorescenza per garantire l'espressione del transgene negli animali scelti.

4. Preparazione della soluzione

1. Preparare 1x tampone basale S (100 mM NaCl e 0,05 M KPO₄, pH 6,0) da una soluzione madre 10x.
2. Preparare tampone tetramisolo 1 mM diluendo 1 M di brodo in 1x S Basal. Usa questo tampone paralitico per preparare tutti gli stimoli. Un esperimento utilizza in genere circa 150 ml.
3. Aggiungere 0,1-1 μg/mL di fluoresceina ai serbatoi tampone di "controllo" per visualizzare il flusso.
4. Creare soluzioni di stimolo mediante diluizione seriale alla concentrazione finale desiderata. Ad esempio, creare una diluizione 10−⁷ di attrattivo diacetile creando prima uno stock 10⁻³ .
   NOTA: Una piccola quantità di fluoresceina (0,1-1 μg/ml) può essere aggiunta allo stimolo o alla soluzione tampone per verificare i tempi dello stimolo, ma la concentrazione dovrebbe essere minima per evitare artefatti nella fluorescenza neurale.

5. Preparazione del dispositivo microfluidico

NOTA: Vedi Reilly et ^al.9 per un protocollo video che mostra la generazione del serbatoio, la configurazione del dispositivo e il carico degli animali. Vedi anche Lagoy et ^al.17 per un protocollo scritto che include molti suggerimenti utili.

1. Preparare tre o più serbatoi di liquido. Per ciascuno, collegare un serbatoio della siringa da 30 ml o 60 ml, una siringa di adescamento da 3 ml e un mozzicone dell'ago a una valvola Luer a tre vie (Figura 2D). Collegare l'ago a un tubo microforo dotato di un tubo metallico all'estremità. Etichettare i serbatoi, montarli su un rack collegato a un supporto ad anello e riempirli con il tampone corrispondente o i fluidi di stimolo (Figura 2E).
2. Degasare il dispositivo microfluidico assemblato in un essiccatore sottovuoto per ~ 1 ora.
3. Riempire e rimuovere le bolle d'aria dal tubo del serbatoio utilizzando la siringa di adescamento. Riempire il tubo di deflusso con buffer.
4. Rimuovere il dispositivo microfluidico dal vuoto, inserire rapidamente il tubo di uscita e iniettare il fluido attraverso il dispositivo fino a quando una goccia emerge da un ingresso.
5. A questo ingresso, utilizzare una connessione "drop-to-drop"¹⁷ per inserire il tubo di ingresso fluidico corrispondente (Figura 2F). Assicurarsi che siano presenti gocce di liquido sia sul tubo di ingresso che sul foro della porta del dispositivo per evitare di introdurre una bolla.
6. Iniettare più fluido dall'uscita, collegare il tubo di ingresso successivo e ripetere fino a riempire tutti gli ingressi. Inserire un perno di bloccaggio solido in corrispondenza di eventuali ingressi non utilizzati e della porta di caricamento della vite senza fine.
7. Avviare il flusso aprendo le valvole Luer di ingresso e uscita. Ispezionare il dispositivo per rilevare perdite negli ingressi e nella base di vetro. Ispezionare il dispositivo per eventuali bolle all'interno dei canali di flusso o degli ingressi utilizzando il software di acquisizione delle immagini del microscopio in modalità live.
   NOTA: se sono presenti bolle, attendere che vengano assorbite nel materiale PDMS.

6. Carico degli animali

NOTA: Vedi Lagoy et ^al.17.

1. Trasferire i giovani animali adulti su una piastra di agar NGM non seminata usando un "piccone" con punta metallica.
2. Inondare la piastra con circa 5 ml di tampone basale 1x S in modo che gli animali nuotino.
3. Aspirare i vermi in una siringa di caricamento (siringa da 1 mL o 3 mL con tubo collegato preriempito con 1x S Basal).
   1. Utilizzando uno stereoscopio, spostare l'estremità del tubo sotto la superficie liquida con una mano per ciascun animale desiderato e disegnarlo nel tubo usando la siringa tenuta nell'altra mano.
   2. Aspirare i vermi solo nel tubo, non nella siringa.
      NOTA: il tubo contiene in genere solo circa 100 μL. Gli animali possono essere espulsi in un'area locale e poi attirati di nuovo nel tubo con un piccolo volume.
4. Chiudere la linea di uscita, rimuovere il perno di caricamento del worm e collegare la siringa caricatrice a vite senza fine al dispositivo utilizzando una connessione drop-to-drop.
5. Far fluire delicatamente gli animali nell'arena, stabilire un flusso tampone e consentire fino a 1 ora per l'immobilizzazione da parte del tetramisolo.
   NOTA: Durante il periodo di immobilizzazione, assicurarsi che solo il fluido tampone entri nell'arena. I serbatoi di stimolo e controllo possono essere spenti durante questo periodo, ma aprirli e verificare il flusso corretto prima di eseguire le prove di stimolazione.

7. Stimolazione automatica e registrazione neuronale

1. Creare un file di testo per la definizione dello stimolo denominato "Impostazioni di acquisizione definite dall'utente.txt" con un editor di testo (ad esempio, Blocco note) contenente le impostazioni di stimolazione per l'acquisizione automatica delle immagini (vedere esempi in Figura 3). Le impostazioni sono divise in due sezioni:
   1. Impostazioni di acquisizione del microscopio: Definire il tipo di esperimento (Single-Stimulus o Multi-Pattern), i tempi di esposizione ed eccitazione, la durata e gli intervalli della prova e salvare la directory.
   2. Impostazioni di stimolazione: Definire i parametri di controllo dello stimolo. Un "comando di stimolazione" specifica le azioni che si verificano in determinati fotogrammi video con la sintassi , dove i codici lettera sono A = valvola1, B = valvola2, C = valvola3, L = luce LED; Inoltre, maiuscole = On e minuscole = Off. L'intensità del LED è impostata con il codice lettera "i" e un valore da 0 (off) a 255 (luminosità massima).
      NOTA: il valore di intensità del LED da 0 a 255 imposta la tensione analogica di uscita da 0 V a 5 V. Il controller di corrente utilizzato qui ha una scala di intensità lineare e altri dovrebbero essere calibrati con un misuratore di potenza della luce.
      1. Per un esperimento a stimolo singolo con un solo comando di stimolazione ripetuto, utilizzare il formato illustrato nella Figura 3A.
      2. Per un esperimento Multi-Pattern con più comandi di stimolazione, utilizzare il formato illustrato nella Figura 3B. Includi una "sequenza di pattern" di cifre che rappresenti l'ordine dei modelli di stimolo. Per ogni modello, inserisci un comando di stimolazione su una riga separata.
         NOTA: Una sequenza pseudocasuale o una sequenza m può essere utile per indagare la dipendenza dalla storia dello stimolo.
2. Eseguire il software di controllo del microscopio. Verificare che tutte le prese fluidiche siano aperte, che il flusso sia come desiderato all'interno dell'arena (vedi Figura 2H) e che i neuroni di interesse siano a fuoco all'interno della finestra live.
3. Chiudere la finestra live ed eseguire lo script "MultiPattern_RunScript.bsh" all'interno del software.
   NOTA: È utile eseguire un esperimento di prova senza animali per verificare il corretto flusso e stimolazione. La sostituzione di una diversa concentrazione di fluoresceina per ciascun fluido di stimolo può aiutare a visualizzare e documentare nuovi modelli di stimolo.
4. Dopo la sperimentazione, smontare il dispositivo microfluidico e sciacquare tutte le superfici, i tubi e i serbatoi con acqua.
   NOTA: Tutti i componenti possono essere riutilizzati decine di volte se tenuti puliti. Assicurarsi che i serbatoi, i tubi e i dispositivi microfluidici siano mantenuti umidi o completamente asciutti in un flusso d'aria per evitare la cristallizzazione del sale, che può ostruirsi ed è difficile da rimuovere. I dispositivi possono essere conservati in etanolo per sterilizzare, ma devono essere completamente asciugati prima del riutilizzo (>1 h a 65 °C)¹⁷.

8. Analisi dei dati utilizzando NeuroTracker

NOTA: NeuroTracker 4,18,19 è un plugin software ImageJ/FIJI²⁰ per tracciare l'intensità della fluorescenza di più neuroni e animali^, anche mentre si muovono durante le prove. Questo plugin salva i dati come file di testo con la posizione di ciascun neurone e l'intensità di fluorescenza (F) corretta dallo sfondo. I dati di fluorescenza sono normalizzati alla fluorescenza basale (F 0), ad esempio, la media di diversi secondi prima della stimolazione, come Δ F / F 0 = (F -F 0) / F ₀, che può essere mediata tra le popolazioni.

1. Installare gli script di NeuroTracker come indicato (github.com/albrechtLab/Neurotracker).
2. Esegui NeuroTracker cliccando su Plugin | Monitoraggio | NeuroTracker.
3. Selezionare la cartella contenente . File video TIF da tracciare e selezionare le impostazioni desiderate.
   NOTA: se è necessario tenere traccia solo di un sottoinsieme dei file video, selezionare l'intervallo numerico dei file da analizzare al prompt. Le impostazioni di tracciamento predefinite sono appropriate per gli animali non mobili con una risoluzione di 250 pix/mm. Regolare i parametri proporzionalmente per le altre risoluzioni. Vedere la Guida dell'utente¹⁹ per ulteriori informazioni sulle impostazioni.
4. Impostare la soglia di intensità in modo tale che i neuroni siano visibili per la selezione (Figura 4).
5. Aprire le finestre di controllo Luminosità/Contrasto (B/C) e Soglia utilizzando le finestre di controllo Immagine | Menu di regolazione .
6. Nella finestra B/C , regolare i cursori Minimo e Massimo fino a quando i neuroni sono chiaramente distinguibili (Figura 4A).
7. Nella finestra Soglia , seleziona Sfondo scuro e Non ripristinare l'intervallo.
8. Fai scorrere il cursore del fotogramma per osservare il movimento dei neuroni e i cambiamenti di intensità, notando eventuali animali da escludere dal monitoraggio, ad esempio a causa della sovrapposizione con altri animali.
9. Identificare i neuroni per il monitoraggio.
10. Per ogni animale, regolare il livello di soglia in modo tale che l'area di soglia rossa sopra il neurone sia visibile in ogni fotogramma prima, durante e dopo la stimolazione.
11. Fare clic sul neurone per registrare la sua posizione e il livello di soglia.
12. Ripetere la regolazione della soglia e la selezione per ogni animale e neurone da tracciare. Vedere la Figura 4C per un buon esempio di livello di soglia e la Figura 4D,E per esempi di soglia eccessiva e inferiore alla soglia. I neuroni precedentemente selezionati sono indicati da una piccola scatola.
13. Quando tutti i neuroni sono selezionati, premere la barra spaziatrice per iniziare il monitoraggio.
    NOTA: Per ulteriori esempi di NeuroTracker, vedere i riferimenti precedenti ^4,19.
14. Monitorare il processo di tracciamento per ogni animale e apportare le correzioni necessarie.
15. Se NeuroTracker si ferma, ha perso il neurone. Fare nuovamente clic sul neurone, regolando il livello di soglia in base alle esigenze.
16. Se la casella di integrazione salta a un altro animale vicino o a una struttura non neuronale, premere la barra spaziatrice per mettere in pausa, spostare nuovamente il cursore sul primo fotogramma errato e fare nuovamente clic sulla posizione corretta del neurone.

9. Esplorazione e visualizzazione dei dati

NOTA: Lo script di analisi MATLAB viene utilizzato per l'elaborazione e la visualizzazione dei dati e per generare PDF di riepilogo per ogni analisi.

1. Eseguire il file "NeuroTrackerSummary_pdf.m" in MATLAB e selezionare la cartella contenente i file di testo dei dati NeuroTracker.
2. Attendere la produzione di un PDF riepilogativo che consenta la verifica del processo di tracciamento (Figura 5). Gli animali sono identificati da un numero (Figura 5A) e le risposte neurali di ciascun animale e sperimentazione possono essere visualizzate per valutare la variabilità della popolazione (Figura 5B).
3. Utilizzare la funzione "databrowse.m" per esplorare i dati neurali, ad esempio, raggruppando per numero di prova (Figura 5C), per numero di animali (Figura 5D), per modello di stimolazione o per un'altra categoria.

Risultati

Presentiamo diversi esempi di modelli di stimolo che valutano diversi fenomeni neurali, tra cui l'inibizione temporale, l'adattamento e la disinibizione. L'inibizione temporale è la soppressione momentanea di una risposta neurale a una seconda presentazione di stimolo che si verifica poco dopo la presentazione iniziale¹⁴. Per testare questo fenomeno, in un esperimento ad impulsi accoppiati, sono stati presentati otto modelli costituiti da due impulsi odoranti 1 s separati da un in...

Discussione

In questo protocollo, descriviamo un sistema di microscopia ad accesso aperto per la valutazione dei fenomeni di attività neurale utilizzando la consegna temporalmente precisa di diversi modelli di stimolo. La piattaforma microfluidica fornisce stimoli ripetibili mantenendo decine di animali nel campo visivo del microscopio. Pochi pacchetti software di microscopia commerciale consentono la facile programmazione di vari modelli di temporizzazione dello stimolo e quelli che spesso richiedono l'inserimento manuale di ciascu...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
ceppi batterici
E. coli (OP50)	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)	Cat# OP50
Modelli sperimentali: Organismi/ceppi
C.  ceppi elegans che esprimono GCaMP (e facoltativamente, Chrimson) nei neuroni desiderati	Caenorhabditis Genetics Center (CGC) o autori corrispondenti del lavoro pubblicato	NZ1091, ad esempio
Chemicals, Treatments, and Worm Preparation Supplies
2,3-Butanedione	Sigma-Aldrich	Cat# B85307	diacetile, esempio chimico stimolo
Cloruro di calcio, CaCl2	Sigma-Aldrich	Cat# C3881
Fluoresceina, sale sodico	Sigma-Aldrich	Cat# F6377
Idrorepellente per vetro	Rain-X	Cat #800002250	trattamento idrofobico per vetro (monouso)
Cloruro di magnesio, MgCl2	Sigma-Aldrich	Cat# M2393
Terreno di crescita dei nematodi (NGM) agar	Genesee	Cat #: 20-273NGM
piastre di Petri (60  mm)	Tritech	Cat #T3305
Poli(dimetilsilossano) (PDMS): Sylgard 184	Dow Chemical Cat	# 1673921
Fosfato di potassio monobasico	Sigma-Aldrich	Cat# P5655
Fosfato di potassio bibasico	Sigma-Aldrich	Cat# P8281
Cloruro di sodio, NaCl	Sigma-Aldrich	Cat# S7653
(tridecafluoro-1,1,2,2-tetraidroottil)triclorosilano (TFOCS)	Gelest	CAS# 78560-45-9	trattamento idrofobico in vetro (durevole)
Software e algoritmi
Arduino IDE	Arduino	https://www.arduino.cc/en/software
ImageJ	NIH	https://imagej.nih.gov/ij/
MATLAB	MathWorks	https://www.mathworks.com/products/matlab.html
Micro-manager Software	https://micro-manager.org/
microscopio	Micro-manager Albrecht Lab	https://github.com/albrechtLab/MicroscopeControl
Software di analisi dati Neurotracker	Albrecht Lab	https://github.com/albrechtLab/Neurotracker
Microscopio automatizzato e sistema di stimolazione
Axio Observer.Microscopio invertito A1 predisposto per l'epifluorescenza (cubi filtranti GFP, obiettivo 5> o similare)	Zeiss	Cat #491237-0012-000
Excelitas X-cite XYLIS Illuminatore LED	Excelitas	Cat #XYLIS
Orca Flash 4.0 Fotocamera digitale sCMOS	Hamamatsu	Cat #C11440-22CU
Arduino nano	Arduino	Cat #A000005
Valvola di isolamento diacrammica miniaturizzata a 3 vie (LQX12)	Parker	Cat #LQX12-3W24FF48-000	Valvola 1: Valvola
manicotto normalmente chiusa (NC)	Valvola Bio-Chem Inc	Cat #075P2-S432	Valvola 2: Valvola
manicotto a 3 vie	NResearch	Cat #161P091	Valvola 3: Stimolo selezione
LED e controller di stimolazione optogenetica (615 nm)	Mightex	Cat #PLS-0625-030-S e #SLA-1200-2
ValveLink 8.2 controllore di valvole digitale/manuale	AutoMate Scientific	Cat #01-18
Fili e connettori	vari	Vedere la Fig. 2 del protocollo Cell STARS (Lawler, 2021)
Microfluidic Device Preparation
Fresa rotante a velocità variabile Dremel 4000	Dremel	Cat #F0134000AB	Imposta la velocità a 5k RPM per il taglio del vetro
Dremel trapano a colonna multifunzione stazione di lavoro	Dremel	Cat #220-01
Punta diamantata	Dremel	Cat #7134
Vetrino, 1  mm di spessore	VWR	Cat #75799-268
Graffio in vetro (Diamond scriber)	Ted Pella	Cat #54468
Luer Rubinetto a 3 vie	Cole-Parmer	Cat #EW-30600-07
Luer 23 G ago smussato	VWR	Cat #89134-100
Dispositivo microfluidico	Corrispondente all'autore o alla fabbricazione da file CAD associati a questo articolo	N/A
Morsetto per dispositivi microfluidici	Warner Instruments (o officina meccanica)	P-2
, 0.02″ ID	Cole-Parmer	Cat #EW-06419-01
tubo 19 g, 0,5″	Tubo piccolo del New England	Cat #NE-1027-12