Concentrazione di particelle virali da campioni di acqua ambientale e acque reflue mediante flocculazione e ultrafiltrazione del latte scremato

Sommario

La concentrazione di virus da campioni di acqua ambientale e acque reflue è un compito impegnativo, svolto principalmente per l'identificazione e la quantificazione dei virus. Mentre diversi metodi di concentrazione del virus sono stati sviluppati e testati, dimostriamo qui l'efficacia dell'ultrafiltrazione e della flocculazione del latte scremato per i virus a RNA con diversi tipi di campioni.

Abstract

L'epidemiologia basata sull'acqua e sulle acque reflue è emersa come metodi alternativi per monitorare e prevedere il corso delle epidemie nelle comunità. Il recupero di frazioni microbiche, inclusi virus, batteri e microeucarioti dalle acque reflue e dai campioni di acqua ambientale è uno dei passaggi impegnativi in questi approcci. In questo studio, ci siamo concentrati sull'efficienza di recupero dell'ultrafiltrazione sequenziale e dei metodi di flocculazione del latte scremato (SMF) utilizzando l'RNA corazzato come virus di prova, che viene anche utilizzato come controllo da alcuni altri studi. La prefiltrazione con filtri a disco a membrana da 0,45 μm e 0,2 μm è stata applicata per eliminare le particelle solide prima dell'ultrafiltrazione per prevenire l'intasamento dei dispositivi di ultrafiltrazione. I campioni di prova, elaborati con il metodo dell'ultrafiltrazione sequenziale, sono stati centrifugati a due diverse velocità. Una maggiore velocità ha comportato minori tassi di recupero e positività dell'RNA corazzato. D'altra parte, SMF ha portato a tassi di recupero e positività relativamente coerenti di RNA corazzato. Ulteriori test condotti con campioni di acqua ambientale hanno dimostrato l'utilità di SMF per concentrare altre frazioni microbiche. Il partizionamento dei virus in particelle solide potrebbe avere un impatto sui tassi di recupero complessivi, considerando la fase di prefiltrazione applicata prima dell'ultrafiltrazione dei campioni di acque reflue. SMF con prefiltrazione ha funzionato meglio quando applicato a campioni di acqua ambientale a causa di concentrazioni solide inferiori nei campioni e quindi tassi di ripartizione inferiori ai solidi. Nel presente studio, l'idea di utilizzare un metodo di ultrafiltrazione sequenziale è nata dalla necessità di ridurre il volume finale dei concentrati virali durante la pandemia di COVID-19, quando la fornitura dei dispositivi di ultrafiltrazione comunemente usati era limitata e vi era la necessità di sviluppare metodi alternativi di concentrazione virale.

Introduzione

Determinare la concentrazione effettiva di microrganismi nei campioni di superficie e di acque reflue per l'analisi della comunità microbica e gli studi epidemiologici è uno dei passi importanti per monitorare e prevedere il decorso delle epidemie nelle comunità ^1,2. La pandemia di COVID-19 ha rivelato l'importanza di migliorare i metodi di concentrazione. COVID-19 è emerso alla fine del 2019 e, a partire da marzo 2023, rappresenta ancora una minaccia per la salute umana, la vita sociale e l'economia. Strategie efficaci di sorveglianza e controllo per alleviare gli impatti delle epidemie di COVID-19 nelle comu....

Protocollo

1. Confronto tra ultrafiltrazione seriale e flocculazione del latte scremato per concentrare virus in campioni di acque reflue

1. Preparazione del campione
   1. Raccogliere 2 L di campioni di acque reflue grezze (influenti) composite proporzionali al flusso di 24 ore. I campioni sono stati raccolti dai tre principali impianti di trattamento delle acque reflue (WWTP) a Winnipeg, in Canada, durante l'estate e l'autunno del 2020 (Tabella 1).
   2. Trasportare i campioni in laboratorio in flaconi a prova di luce in una ghiacciaia e lavorarli entro 24 ore. Raccogliere dati sulle caratteristiche fisico-chimiche e biologiche de....

Risultati

Valutazione dei metodi di concentrazione dell'RNA virale
Tutti e sei i campioni trattati con UF-3k x g sono risultati positivi e hanno determinato un recupero del 13,38% ± dell'8,14% (Figura 1). Solo un campione è risultato positivo quando i campioni sono stati elaborati con UF-7.5k x g. Tutti i campioni trattati con SMF sono risultati positivi e hanno determinato un recupero del 15,27% ± del 2,65% (Figura 1). I tassi medi d.......

Discussione

Uno dei passaggi critici in questo studio è l'eliminazione delle particelle solide applicando una fase di prefiltrazione con filtri a membrana da 0,2 μm e 0,45 μm. Considerando il partizionamento dei virus in particelle solide, in particolare i virus avvolti, la prefiltrazione può causare una perdita significativa nel recupero virale³⁰. Mentre una fase di prefiltrazione per i metodi di ultrafiltrazione è quasi sempre necessaria per i campioni ambientali e di acque reflue per prevenire l'intasament.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
tampone fosfato di sodio 0,2 M con pH 7,5	Alfa Aesar	J62041AP	Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA
0,2 μ m Filtri a disco a membrana Supor-200 da 47 mm	VWR	66234	Pall Corporation, Ann Arbor, MI
0.45 μ m 47-mm Supor-200 filtri a disco a membrana	VWR	60043	Pall Corporation, Ann Arbor, MI
4X TaqMan Fast Virus 1-Step Master Mix	Thermo Fisher Scientific	4444432	Life Technologies, Carlsbad, CA, USA
Armored RNA Quant IPC-1 Controllo di elaborazione	Asuragen	49650	Asuragen, Austin, TX, USA
Marca A, Jumbosep Dispositivo centrifugo, 30-kDa	Pall	OD030C65	Pall Corporation, Ann Arbor, MI
Marca B, Microsep Advance Centrifugal Device, 30-kDa	Pall	MCP010C46	Pall Corporation, Ann Arbor, MI
Provette da centrifuga (50 ml)	Nalgene	3119-0050PK	Thermo Fisher Scientific
DNAse I	Invitrogen	18047019	Thermo Fisher Scientific Dyna
Mag-2	Invitrogen	12027	Thermo Fisher Scientific
GWV Capsule per il campionamento di acque sotterranee ad alta capacità - 0,45 &; m	Pall	12179	Pall Corporation, Ann Arbor, MI
Acido cloridrico, soluzione standard 1N	Thermo Fisher Scientific	AC124210025	Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA
Kit di isolamento dell'acido ultra nucleico del microbioma MagMAX	Biosystems applicati	A42358	Thermo Fisher Scientific
Acqua priva di nucleasi	Promega	P1197	Promega Corporation, Fitchburg, WI,
Pompa peristaltica	Masterflex, strumento Cole-Parmer	7553-20	Misuratore di pH Thermo Fisher Scientific
	Strumento Denver	RK-59503-25	Cole-Parmer. Questo prodotto è stato interrotto
Fenolo:cloroformio:alcol isoamilico 25:24:1	Invitrogen	15593031	Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA
Primer e set di sonde	IDT		Integrated DNA Technologies, Inc., Coralville, IA, USA
Qiagen Kit per microbioma di potenza DNA/RNA All-prep	Qiagen		Sciences, Inc., Germantown, MD, USA
QuantStudio 5 PCR in tempo reale Sistema	Thermo Fisher Scientific	A34322	Life Technologies, Carlsbad, CA, USA
Kit di test Qubit 1X dsDNA ad alta sensibilità (HS)	Invitrogen	Q33231	Thermo Fisher Scientific
Qubit 4 Fluorimetro, con WiFi	Invitrogen	Q33238	Thermo Fisher Scientific
Qubit RNA ad alta sensibilità (HS)	Invitrogen	Q32855	Thermo Fisher Scientific
RNAse A	Invitrogen	EN0531	Thermo Fisher Scientific
RNeasy PowerMicrobiome Kit	Qiagen	26000-50	Qiagen Sciences, Inc., Germantown, MD, USA
Latte scremato in polvere	Difco (BD Life Sciences)	DF0032173	Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA
Tampone fosfato di sodio	Alfa Aesar		Alfa Aesar, Ottawa, ON, Canada
Acqua di mare sintetica	VWR	RC8363-1	RICCA azienda chimica
DNA sintetico a filamento singolo gBlock	IDT		Integrated DNA Technologies, Inc., Coralville, IA, USA
VacuCap 90 Dispositivi di filtrazione sottovuoto - 0,1 &; m, 90 mm, irradiato con raggi gamma	Pall	4621	Pall Corporation, Ann Arbor, MI
VacuCap 90 Dispositivi di filtrazione sottovuoto - 0,2 µ m, 90 mm, irradiato con raggi gamma	Pall	4622	Pall Corporation, Ann Arbor, MI
β-mercaptoetanolo	Gibco	21985023	Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA

USA Kit di test