Articolo metodologico

Preparazione di matrici decellularizzate 3D da muscolo scheletrico fetale di topo per coltura cellulare

DOI:

10.3791/65069

⸱

3 marzo 2023

 ,  ,  , 
1Centre for Ecology, Evolution and Environmental Changes and Global Change & Sustainability Institute, Department of Animal Biology, Faculty of Sciences, University of Lisbon

In questo articolo

Sommario

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In questo lavoro, un protocollo di decellularizzazione è stato ottimizzato per ottenere matrici decellularizzate del muscolo scheletrico fetale del topo. I mioblasti C2C12 possono colonizzare queste matrici, proliferare e differenziarsi. Questo modello in vitro può essere utilizzato per studiare il comportamento cellulare nel contesto di malattie del muscolo scheletrico come le distrofie muscolari.

Abstract

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La matrice extracellulare (ECM) svolge un ruolo cruciale nel fornire supporto strutturale per le cellule e trasmettere segnali importanti per vari processi cellulari. I modelli di coltura cellulare bidimensionale (2D) semplificano eccessivamente le complesse interazioni tra cellule e ECM, poiché la mancanza di un supporto tridimensionale completo (3D) può alterare il comportamento cellulare, rendendoli inadeguati per la comprensione dei processi in vivo . Le carenze nella composizione della ECM e nelle interazioni cellula-ECM sono importanti contributori a una varietà di malattie diverse.

Un esempio è la distrofia muscolare congenita LAMA2 (LAMA2-CMD), dove l'assenza o la riduzione della laminina funzionale 211 e 221 può portare a grave ipotonia, rilevabile alla nascita o subito dopo. Lavori precedenti che utilizzano un modello murino della malattia suggeriscono che la sua insorgenza si verifica durante la miogenesi fetale. Il presente studio mirava a sviluppare un modello 3D in vitro che permettesse lo studio delle interazioni tra cellule muscolari e ECM muscolare fetale, imitando il microambiente nativo. Questo protocollo utilizza muscoli profondi della schiena sezionati da feti di topo E18.5, trattati con un tampone ipotonico, un detergente anionico e DNasi. Le matrici decellularizzate risultanti (dECM) hanno mantenuto tutte le proteine ECM testate (laminina α2, laminine totali, fibronectina, collagene I e collagene IV) rispetto al tessuto nativo.

Quando i mioblasti C2C12 sono stati seminati sopra questi dECM, sono penetrati e hanno colonizzato i dECM, che hanno supportato la loro proliferazione e differenziazione. Inoltre, le cellule C2C12 hanno prodotto proteine ECM, contribuendo al rimodellamento della loro nicchia all'interno delle dECM. L'istituzione di questa piattaforma in vitro fornisce un nuovo approccio promettente per svelare i processi coinvolti nell'insorgenza di LAMA2-CMD e ha il potenziale per essere adattato ad altre malattie del muscolo scheletrico in cui le carenze nella comunicazione tra la ECM e le cellule muscolari scheletriche contribuiscono alla progressione della malattia.

Introduzione

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La matrice extracellulare (ECM) è un costituente importante dei tessuti, che rappresenta la loro componente non cellulare. Questa struttura tridimensionale (3D) non solo fornisce supporto fisico per le cellule, ma svolge anche un ruolo cruciale nei processi biochimici coinvolti nello sviluppo degli organismi1. La formazione di una ECM tessuto-specifica avviene durante lo sviluppo, come risultato delle complesse interazioni tra le cellule e le loro nicchie, influenzate da vari stimoli intra ed extracellulari. L'ECM è una struttura altamente dinamica che subisce riarrangiamenti chimici e meccanici in modo temporale-spaziale e influisce direttamente sul destino cellulare2. Una delle caratteristiche più notevoli della MEC è la sua diversità funzionale, poiché ogni ECM tissutale mostra una combinazione unica di molecole che forniscono diverse topologie e proprietà adattate alle cellule che contiene1.

La segnalazione e il supporto della ECM sono cruciali per lo sviluppo e l'omeostasi e, se interrotti, possono portare a molteplici condizioni patologiche 3,4. Un esempio è la distrofia congenita con deficit di LAMA2 (LAMA2-CMD), che è la forma più comune di distrofia muscolare congenita. Il gene LAMA2 codifica per la catena α2 della laminina, che è presente nella laminina 211 e nella laminina 221, e quando mutato può portare a LAMA2-CMD 5. La laminina 211 è l'isoforma principale presente nella membrana basale che circonda le fibre muscolari scheletriche. Quando la laminina 211 è anormale o assente, il legame tra la membrana basale e le cellule muscolari viene interrotto, portando all'insorgenza della malattia6. I pazienti con LAMA2-CMD mostrano un fenotipo da lieve a grave a seconda del tipo di mutazione nel gene LAMA2.

Quando la funzione della proteina α2 della laminina è compromessa, i pazienti possono sperimentare una grave ipotonia muscolare alla nascita e sviluppare infiammazione cronica, fibrosi e atrofia muscolare, portando a una ridotta aspettativa di vita. Ad oggi, non sono stati sviluppati trattamenti mirati e gli approcci terapeutici sono limitati ad alleviare i sintomi della malattia7. Pertanto, la comprensione dei meccanismi molecolari sottostanti coinvolti nell'insorgenza di questa malattia è cruciale per lo sviluppo di strategie terapeutiche appropriate 6,8. Precedenti lavori che utilizzano il topo dyW 9, un modello per LAMA2-CMD, suggeriscono che l'insorgenza della malattia inizia in utero, in particolare durante la miogenesi fetale10. Una migliore comprensione di come emerge il difetto della miogenesi fetale sarebbe un punto di svolta nella generazione di nuovi approcci terapeutici per LAMA2-CMD.

I sistemi in vitro forniscono un ambiente controllato per lo studio delle interazioni cellula-cellula e cellula-ECM, ma i modelli di coltura 2D mancano della complessità dei tessuti nativi. La decellularizzazione dei tessuti produce scaffold ECM acellulari specifici per il tessuto e lo stadio di sviluppo che imitano in modo più accurato il microambiente cellulare naturale rispetto ai modelli 2D e agli scaffold ingegnerizzati / sintetici. Le matrici decellularizzate (dECM) hanno il potenziale di preservare i segnali molecolari e meccanici del tessuto ospite, rendendoli migliori modelli alternativi per la comprensione dei processi in vivo 11.

Esistono varie tecniche, reagenti e condizioni che possono essere utilizzate per la decellularizzazione12,13. In questo studio, un protocollo di decellularizzazione per il cuore fetale di topo, descritto da Silva et al.14,15, è adattato al muscolo scheletrico fetale del topo e si trova a conservare tutti i componenti ECM testati (laminina α2, laminine totali, fibronectina, collagene I e collagene IV). Il protocollo prevede tre fasi: lisi cellulare mediante shock osmotico (tampone ipotonico), dissoluzione della membrana plasmatica e dissociazione proteica (0,05% sodio dodecilsolfato [SDS]) e distruzione enzimatica del DNA (trattamento con DNasi). Per quanto ne sappiamo, questo è il primo protocollo stabilito per decellularizzare il muscolo scheletrico fetale del topo.

Per utilizzare questo sistema 3D in vitro per lo studio di LAMA2-CMD, è fondamentale mantenere la catena α2 della laminina dopo la decellularizzazione. Pertanto, è stato implementato un protocollo di ottimizzazione in cui sono stati testati diversi detergenti (SDS e Triton X-100) e concentrazioni (0,02%, 0,05%, 0,1%, 0,2% e 0,5%) (dati non mostrati). La scelta ottimale per la rimozione cellulare e la conservazione della proteina laminina α2 è risultata essere lo 0,05% di SDS. Le cellule C2C12, una linea cellulare di mioblasti ben consolidata16,17, sono state utilizzate per seminare i dECM. Queste cellule invadono la dECM, proliferano e si differenziano all'interno di questi scaffold, sintetizzando nuove proteine ECM. Il successo della produzione di questo modello 3D in vitro offre un nuovo approccio alla comprensione dei processi molecolari e cellulari coinvolti nella miogenesi fetale, l'insorgenza di LAMA2-CMD e può essere esteso ad altre malattie muscolari in cui la comunicazione tra la ECM e le cellule muscolari scheletriche viene interrotta.

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Protocollo

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Tutte le metodologie descritte sono state approvate dal Comitato per il benessere degli animali (ORBEA) della Facoltà di Scienze dell'Università di Lisbona e dalla Direção Geral de Veterinária (DGAV; rif. 0421/000/000/2022) e sono conformi alla Direttiva Europea 2010/63/UE.

1. Preparazione di tamponi e reagenti di decellularizzazione

NOTA: Tutte le soluzioni utilizzate durante il protocollo di decellularizzazione devono essere sterilizzate in autoclave e conservate per un massimo di 3 mesi, salvo diversa indicazione.

  1. Preparare 10x soluzione salina tamponata con fosfato (10x PBS) aggiungendo cloruro di sodio (NaCl) a 137 mM, cloruro di potassio (KCl) a 2,68 mM, potassio-diidrogeno fosfato (KH 2 PO 4) a 8,1 mM e disodio-idrogeno-fosfato diidrato (Na 2 HPO4) a 1,47 mM in acqua demineralizzata (dH2O) e regolareil pH a 6,8. Aggiungere 100 ml di 10x PBS a 900 mL di H2O demineralizzato per generare 1x PBS. Autoclave e conservare a temperatura ambiente (RT). Aggiungere la soluzione madre sterile di penicillina/streptomicina (10.000 U/mL di penicillina e 10 mg/mL di streptomicina [penna/streptococco]) ad una concentrazione finale dell'1% prima dell'uso.
  2. Preparare il tampone ipotonico sciogliendo 1,21 g di Tris(idrossimetil)amminometano (Tris base) e 1 g di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) in 1 L di dH2O (10 mM Tris base 0,1% EDTA). Utilizzare un agitatore magnetico fino alla dissoluzione e regolare il pH a 7,8 con NaOH / HCl. Sterilizzare in autoclave e conservare a RT. Aggiungere penna/streptococco ad una concentrazione finale dell'1% prima dell'uso.
  3. Preparare il tampone di lavaggio ipotonico sciogliendo 1,21 g di Tris base in 1 L di dH2O (10 mM Tris base). Utilizzare un agitatore magnetico fino a dissoluzione e regolare il pH a 7,8 con NaOH / HCl. Autoclave e conservare presso RT. Aggiungere penna/streptococco all'1% prima dell'uso.
  4. Preparare il trattamento detergente anionico aggiungendo 0,05 g di sodio dodecilsolfato (SDS) a 100 ml di tampone di lavaggio ipotonico per produrre una soluzione di trattamento SDS allo 0,05%. Filtrare attraverso un filtro a membrana da 0,22 μm. Conservare su RT per un massimo di 1 mese.
    NOTA: la soluzione SDS non deve essere autoclavata, poiché la SDS precipita e si degrada durante l'autoclave.
  5. Preparare la soluzione di trattamento con DNasi sciogliendo 1,21 g di Tris base in 0,5 mL di dH 2 O eaggiungere 1 mL di cloruro di magnesio 1 M (MgCl2). Regolare il pH a 7,8 con NaOH/HCl. Autoclave e conservare a RT. Aggiungere DNasi I prima dell'uso (50 U/mL).

2. Raccolta dei campioni

NOTA: Nello studio sono stati utilizzati topi selvatici C57 / BL6. Tutte le tecniche sono state condotte in una cappa a flusso laminare in condizioni sterili.

  1. Eutanasia di topi femmina adulti gravidi al giorno embrionale (E) 18.5 di gravidanza usando inalazione di isoflurano seguita da lussazione cervicale. Sottoporre i topi alla dissezione terminale per estrarre i feti.
    1. Spruzzare l'addome del topo con etanolo al 70%.
    2. Usando una pinza chirurgica e le forbici, sollevare una piega di pelle nell'addome inferiore e fare un'incisione a forma di U per esporre la cavità addominale18.
    3. Raccogliere le corna uterine contenenti i feti E18.5 tagliando gli ovidotti e la cervice e trasferirli immediatamente in una capsula di Petri con 1x PBS ghiacciato con penna / streptococco18% ghiacciato.
    4. Rimuovere rapidamente i feti dall'utero e dai tessuti extraembrionali e eutanasizzarli per decapitazione usando le forbici18.
  2. Trasferire un feto alla volta in una capsula di Petri con 1x PBS ghiacciato. Usando un microscopio stereo, rimuovere la pelle e tagliare gli arti. Dal lato ventrale, tagliare la gabbia toracica e rimuovere lo sterno e gli organi sottostanti.
  3. Capovolgere il lato dorsale del tronco fetale verso l'alto. Rimuovere la porzione cervicale della colonna vertebrale, i depositi di grasso dorsale e il tessuto connettivo sopra i muscoli profondi della schiena.
  4. Utilizzare una pinza chirurgica per ancorare la gabbia toracica e raschiare e staccare con cura i muscoli profondi della schiena dai tessuti circostanti usando un micro bisturi10. Questa procedura comporta l'isolamento di due pezzi muscolari per feto (sinistro e destro), entrambi composti principalmente da muscoli longissimus e iliocostali , con alcuni dei muscoli trasversospinali e elevatore costarum inclusi.
  5. Conservare i campioni muscolari in 1x PBS con penna/streptococco all'1% a 4 °C per la conservazione a breve termine (<1 settimana) o a -80 °C per periodi più lunghi.
    NOTA: Utilizzare campioni appena raccolti per ottenere i migliori risultati. I campioni congelati per periodi prolungati (>3 mesi) mostrano una minore efficienza di decellularizzazione e una maggiore degradazione delle proteine. Le masse muscolari epaxiali sono state utilizzate per gli esperimenti di decellularizzazione, ma altri muscoli (ad esempio, i muscoli degli arti) possono essere elaborati per la decellularizzazione utilizzando lo stesso protocollo.

3. Decellularizzazione del muscolo scheletrico fetale

NOTA: Tutte le tecniche sono state condotte in una cappa a flusso laminare in condizioni sterili. Per una rappresentazione schematica dettagliata, vedere la Figura 1A. Tutti i passaggi sono stati eseguiti con agitazione in uno scuotitore orbitale con un diametro di 120 mm (165 giri / min) a 25 °C se non diversamente specificato. Aggiungere penna/streptococco all'1% alle soluzioni prima dell'uso. Quando si rimuovono le soluzioni, aspirare con cautela per evitare l'intrappolamento del campione nella pipetta.

  1. Giorno 1 - Preparare circa 2 mm x 1 mm x 1 mm (~3,5 mg) frammenti di tessuto dalle masse muscolari epaxiali. Aggiungere 3 ml di tampone ipotonico con penna/streptococco all'1% a ciascun pozzetto di una piastra a 12 pozzetti e aggiungere un intero frammento di tessuto muscolare per pozzetto.
    1. Incubare i frammenti di tessuto in tampone ipotonico agitando per 18 ore (durante la notte) (O/N).
  2. Giorno 2 - Aspirare il tampone ipotonico con una pipetta a punta fine e lavare i campioni 3 x 1 h con 3 ml di 1x PBS ogni volta agitando.
    1. Incubare i campioni per 24 ore con 3 ml di soluzione detergente SDS allo 0,05% agitando.
      NOTA: (PUNTO DI CONTROLLO) Dopo l'incubazione SDS, i campioni dovrebbero avere un aspetto trasparente. I campioni mostrano una consistenza simile alla gelatina e sono, quindi, più inclini ad aderire alla pipetta quando si rimuovono i liquidi.
  3. Giorno 3 - Rimuovere la soluzione detergente SDS con una pipetta a punta fine e lavare i frammenti di tessuto 3 x 20 minuti con 3 ml di tampone ipotonico ogni volta agitando.
    NOTA: (PUNTO DI PAUSA) I campioni possono essere conservati in tampone di lavaggio ipotonico a 4 °C per 18 ore (O/N). Assicurarsi che la SDS sia ben rimossa durante le fasi di lavaggio, poiché la SDS residua può essere citotossica.
    1. Incubare i frammenti di tessuto per 3 ore con 2 mL di soluzione di DNasi agitando a 37 °C.
    2. Rimuovere la soluzione di DNasi utilizzando una pipetta a punta fine e lavare i frammenti di tessuto 3 x 20 minuti con 3 ml di 1x PBS ogni volta agitando. Infine, lavare O/N agitando (60 rpm).
      NOTA: Dopo il trattamento con DNasi, i dECM diventano appiccicosi a causa della presenza di residui di DNA. Pertanto, è necessario un lavaggio accurato.
    3. Conservare i dECM in 1x PBS con penna/streptococco all'1% a 4 °C fino alla ricellularizzazione (<1 settimana). Per altri usi, conservare a -80 °C.

4. Valutazione della qualità della decellularizzazione

NOTA: La quantificazione del DNA, la colorazione DAPI/verde metile e la colorazione con falloidina sono state eseguite per valutare la presenza di contenuti cellulari residui dopo la decellularizzazione. Sono state condotte analisi immunoistochimiche e western blot per valutare la ritenzione delle proteine chiave della ECM dopo la decellularizzazione.

  1. Quantificazione del DNA presente nella dECM
    NOTA: I dECM devono essere confrontati con il tessuto nativo per rilevare la presenza di DNA.
    1. Prima della decellularizzazione, pesare una provetta da microcentrifuga da 1,5 ml su una bilancia digitale ad alta precisione. Prima di trasferire il campione muscolare al tubo, rimuovere tutto il restante 1x PBS usando un tovagliolo di carta. Pesare il tubo con il campione. Calcolare il peso umido dei campioni utilizzando l'equazione (1):
      Peso umido del campione = tubo di pesocon campioni - pesotubo vuoto (1)
    2. Decellularizzare i campioni seguendo il protocollo descritto nella sezione 3.
    3. Posizionare i campioni in provette da microcentrifuga da 2 ml.
      NOTA: I campioni possono essere conservati a -20 °C fino all'estrazione e alla quantificazione del DNA.
    4. Eseguire l'estrazione del DNA dei dECM e dei campioni di tessuto nativo utilizzando un kit basato su colonna di spin. Aggiungere il tampone di digestione secondo le istruzioni del produttore.
    5. Omogeneizzare i campioni in un mulino a perline due volte per 2,5 minuti ogni volta (capovolgendo i supporti) utilizzando un cordone di carburo di tungsteno per tubo (utilizzare supporti per tubi refrigerati).
    6. Aggiungere la proteinasi K e incubare O/N agitando lentamente a 56 °C.
    7. Procedere con il protocollo come descritto nelle istruzioni del produttore.
    8. Eluire con il tampone fornito dal produttore e centrifugare 2 x 1 min a ≥6.000 x g, ogni volta a 4 °C per aumentare la resa del DNA.
      NOTA: il DNA può essere conservato a -20 °C fino alla quantificazione.
    9. Quantificare il DNA presente nei campioni utilizzando un kit di rilevamento dsDNA fluorescente seguendo le istruzioni del produttore.
    10. Normalizzare il contenuto di DNA come nanogrammi di DNA per milligrammo di peso umido originale del campione.
    11. Analizzare i dati utilizzando un test t di Student a due code ed esprimere come media ± errore standard della media (SEM).
  2. Immunoistochimica
    NOTA: le soluzioni 1, 2 e 3 e la soluzione fissativa devono essere preparate prima dell'uso e possono essere conservate congelate per un massimo di 6 mesi. Tutti gli anticorpi e i coloranti utilizzati e le rispettive diluizioni sono elencati in Tabella 1.
    1. Preparazione delle soluzioni
      1. Preparare la soluzione fissativa aggiungendo 2 g di paraformaldeide (PFA), 8 g di saccarosio e 24 μL di 1 M CaCl 2 a 77 ml di 0,2 M Na 2 HPO 4 e 23 ml di 0,2 M NaH2 PO 4, ad un volume finale di 200 mL aggiungendo dH2 O. Regolare ilpH a7,4.
      2. Preparare un tampone fosfato 0,12 M aggiungendo 13,5 g di Na 2 HPO 4 e 3,2 g di NaH 2 PO 4 a 1 L didH2O. Regolare il pH a7,4.
      3. Preparare la soluzione 1 aggiungendo 4 g di saccarosio a 100 ml di tampone fosfato 0,12 M.
      4. Preparare la soluzione 2 aggiungendo 15 g di saccarosio a 100 ml di tampone fosfato 0,12 M.
      5. Preparare la soluzione 3 aggiungendo 15 g di saccarosio e 7,5 g di gelatina a 100 ml di tampone fosfato 0,12 M. Riscaldare a 37 °C fino a quando la gelatina non si scioglie.
      6. Preparare la soluzione madre verde metile (polvere verde metile al 2% disciolta in dH2O)19.
    2. Immunorilevazione
      1. Fissare i campioni con la soluzione fissativa per almeno 4 ore a 4 °C.
      2. Lavare i campioni 2x per 10 minuti con 1x PBS.
      3. Conservare O/N, o più di 1 giorno, in soluzione 1 a 4 °C.
      4. Lavare e conservare O/N o più di 1 giorno in soluzione 2 a 4 °C. Lasciare riscaldare i campioni a RT.
      5. Incubare per 3 ore in soluzione 3 a 37 °C. Conservare la soluzione supplementare 3 a 37 °C da utilizzare in seguito.
      6. Stampo piccoli (2 cm x 1 cm x 1 cm) contenitori in foglio di alluminio. Posizionare un sottile strato di soluzione 3 nel contenitore stampato e lasciarlo fissare. Posizionare i campioni sulla soluzione solidificata 3 e coprire con la soluzione calda 3. Orientare i campioni e lasciarli solidificare. Contrassegnare la posizione sulla soluzione solidificata 3 con una penna colorata.
      7. Congelare posizionando i contenitori sulla superficie dell'isopentano secco refrigerato con ghiaccio o azoto liquido.
      8. Utilizzando il composto O.C.T. con temperatura di taglio ottimale, fissare i cubetti di gelatina congelati contenenti i campioni al supporto del criostato.
      9. Sezionare i cubetti di gelatina congelati e trasferire le sezioni di tessuto sui vetrini. Lasciateli asciugare per 60 min.
      10. Utilizzare un marcatore idrofobo per tracciare una linea attorno alle sezioni.
      11. Lavare i vetrini 3 x 10 minuti in 1x PBS.
      12. Coprire le sezioni con albumina sierica bovina (BSA) all'1%, siero di capra all'1% e Triton X-100 allo 0,05% diluito in 1x PBS (soluzione bloccante) per 30 minuti (fase di blocco).
      13. Diluire gli anticorpi primari nella soluzione bloccante e coprire le sezioni. Incubare O/N a 4 °C in una scatola chiusa, con carta umida, per evitare che le sezioni si secchino.
      14. Lavare i vetrini 3 x 10 minuti con 1x PBS.
      15. Diluire gli anticorpi secondari in soluzione bloccante e coprire le sezioni. Incubare per 1,5 ore a RT al buio.
        NOTA: Evitare l'esposizione alla luce per prevenire la degradazione dei fluorofori.
      16. Lavare i vetrini 3 x 10 minuti con 4x PBS.
        NOTA: una maggiore concentrazione di PBS può essere utilizzata quando è presente uno sfondo forte.
      17. Immergere i vetrini in soluzione DAPI (5 μg/mL 1,4-diazabiciclo-2,2,2-ottano in 0,1% Triton X-100/1x PBS) per 30 s ciascuno.
      18. Risciacquare in 1x PBS.
      19. Montare le sezioni in mezzo anti-sbiadimento (50 mg/mL di n-propil-gallato in 1x PBS:glicerolo [1:9]) e sigillare con un vetrino. Conservare a 4 °C fino all'osservazione e all'acquisizione dell'immagine in un microscopio a fluorescenza20.
        NOTA: Per gli esperimenti di immunoistochimica in toto, è stato utilizzato lo stesso protocollo (vedere i punti 4.2.2.12-4.2.2.18), tranne che i campioni sono stati precedentemente fissati in PFA al 4% diluito in 1x PBS per 3 ore a RT. La colorazione del DNA è stata eseguita aggiungendo verde metile alla soluzione anticorpale secondaria. Tutti gli anticorpi e i coloranti utilizzati, e le rispettive diluizioni, sono elencati nella Tabella 1. I campioni sono stati quindi montati in mezzo anti-sbiadimento tra due vetrini separati da anelli di acciaio, incollati insieme con cera d'api, e sono state acquisite pile di immagini da 100 μm utilizzando un microscopio confocale21.
  3. Analisi Western blot
    NOTA: Tutti gli anticorpi utilizzati e le rispettive diluizioni sono elencati in Tabella 1.
    1. Preparazione delle soluzioni
      1. Preparare il tampone di carico 2x SDS-PAGE aggiungendo 20 ml di glicerolo, 4 g di SDS e 0,2 ml di blu di bromofenolo a 80 ml di soluzione base Tris da 100 mM. Regolare il pH a 6,8. Aggiungere ditiotreitolo fresco (DTT) prima dell'uso.
      2. Preparare il tampone di lavaggio salino tamponato Tris con soluzione Tween 20 (TBST) aggiungendo 2,4 g di base Tris, 8,8 g di NaCl e 1 ml di Tween-20 a dH2O a un volume finale di 1 L. Regolare il pH a 7,4-7,6 utilizzando HCl.
      3. Preparare il tampone di corsa 10x (RB) aggiungendo 30,2 g di Tris base, 144,2 g di glicina e 10 g di SDS a 1 L di dH2O. Prima dell'uso, aggiungere 100 mL di 10x RB a 900 mL di dH2O per preparare 1x RB (soluzione di lavoro).
        NOTA: mentre 10x RB può essere memorizzato in RT per diversi mesi, 1x RB può essere riutilizzato su diverse esecuzioni.
      4. Preparare il tampone di trasferimento (TB) aggiungendo 5,82 g di Tris base, 2,93 g di glicina e 0,5 g di SDS a 800 mL di dH2O. Dopo aver sciolto i componenti, aggiungere 200 ml di metanolo. Raffreddare a 4 °C.
        NOTA: La tubercolosi deve essere preparata al momento prima di ogni utilizzo.
    2. Estrazione di proteine
      1. Raccogliere i muscoli epaxiali dai topi E18.5 e posizionarli immediatamente in una provetta di microcentrifuga (2 ml) contenente 2 tampone di carico SDS-PAGE con DTT appena aggiunto (100 mM DTT). Elabora E18.5 dECM allo stesso modo.
      2. Aggiungere un cordone in carburo di tungsteno per tubo. Omogeneizzare 2 volte in un mulino per perline per 2,5 minuti ogni volta (capovolgere i supporti).
      3. Sonicare i campioni per 5 minuti in un bagno ad ultrasuoni.
      4. Riscaldare i campioni per 10 minuti a 50 °C.
      5. Centrifugare i campioni a 12.000 × g per 15 minuti a 4 °C.
      6. Trasferire il surnatante in una nuova provetta da microcentrifuga da 1,5 ml.
      7. Quantificare la proteina utilizzando uno spettrofotometro a microvolume.
      8. Conservare a -20 °C fino a ulteriore utilizzo.
    3. Elettroforesi su gel di poliacrilammide
      1. Utilizzare gel prefabbricato con gradiente acrilammidico (4% -20%)
      2. Montare il gel nel serbatoio di elettroforesi. Rimuovere accuratamente il pettine. Aggiungere 1x RB fino alla linea visualizzata nel serbatoio di elettroforesi. Assicurati che i pozzi siano pieni di RB.
      3. Caricare 100 μg di proteine per campione nei pozzetti. Carico 12 μL di proteine standard ad alto peso molecolare.
      4. Funzionamento per un totale di 100 minuti con tensione costante (10 min a 150 V e 90 min a 185 V).
    4. Trasferimento
      1. Immergere i tamponi filtranti e le spugne con TB refrigerata (4 °C) mentre il gel è in funzione.
      2. Tagliare le membrane di difluoruro di polivinilidene alla dimensione del gel. Attivarli con metanolo e lavare con dH2O. Immergere nella tubercolosi.
      3. Montare la cassetta di trasferimento con le spugne, i cuscinetti filtranti, i gel e le membrane attivate secondo le istruzioni del produttore.
      4. Posizionare la cassetta nel serbatoio di elettroforesi contenente la TB refrigerata (su un letto di ghiaccio). Aggiungere l'unità di raffreddamento. Correre per 90 minuti a 100 V.
      5. Dopo il trasferimento, colorare con un sostituto blu Coomassie per valutare la qualità del trasferimento.
    5. Immunorilevazione
      1. Preparare la soluzione bloccante (TBST con latte magro al 5%). Incubare le membrane con agitazione per 1 ora a RT.
      2. Risciacquare 3 x 5 s con TBST.
      3. Incubare le membrane O/N con gli anticorpi primari diluiti in TBST con 2% BSA e 0,02% di azoturo di sodio (3 mL per membrana) in una camera fredda (4 °C) agitando.
      4. Il giorno successivo, lavare 3 x 5 minuti con TBST.
      5. Incubare le membrane con anticorpi secondari coniugati con perossidasi di rafano (HRP) diluiti in TBST con latte magro al 5% (5 ml per ogni membrana) per 1 ora a RT.
      6. Lavare le membrane con TBST 3 x 5 min. Conservare in TBST fino alla fase di rilevamento.
      7. Visualizza la proteina utilizzando un kit di sviluppo disponibile in commercio. Aggiungere i reagenti di rilevamento secondo le istruzioni del produttore. Acquisisci immagini delle band.
      8. Per testare più di un anticorpo per membrana, dopo la fase di rilevazione, rimuovere gli anticorpi precedenti con tre lavaggi (5 minuti ciascuno) utilizzando TBST e ripetere i passaggi 4.3.5.2-4.3.5.7.

Tabella 1: Anticorpi e coloranti utilizzati nell'immunoistochimica e nell'analisi western blot e nelle rispettive diluizioni. Clicca qui per scaricare questa tabella.10,22

5. Coltura cellulare in matrici decellularizzate

NOTA: Tutte le tecniche sono state eseguite in condizioni sterili in una cappa a flusso laminare. Tutte le incubazioni sono state eseguite a 37 °C e con il 5% di CO2.

  1. Preparare il terreno di coltura cellulare, Modified Eagle Medium ad alto contenuto di glucosio Dulbecco con glutammina stabile e con piruvato di sodio (DMEM), integrato con il 10% di siero bovino fetale (FBS) e l'1% di penna/streptococco (terreno di coltura completo).
  2. Posizionare i dECM in una capsula di Petri in 1x PBS con penna/streptococco all'1% in una cappa a flusso laminare e separarli in pezzi di circa 500 μm x 500 μm x 250 μm, usando un microbisturi e una pinzetta.
    NOTA: i dECM hanno una consistenza morbida, e quindi è spesso più facile usare una pinzetta per separarli in pezzi approssimativamente delle stesse dimensioni invece di tagliarli con il micro bisturi.
  3. Trasferire i frammenti in una piastra da 96 pozzetti (tre o quattro pezzi per pozzetto) con 200 μL di terreno di coltura completo, precedentemente riscaldato a 37 °C. Incubare per 2 ore nell'incubatore.
  4. Aggiungere 500 μL di tripsina a un matraccio T25 seminato con cellule C2C12 subconfluenti (~70%). Risospendere in 1 mL di terreno completo.
  5. Aggiungere 10 μL della risospensione a 10 μL di colorante blu Trypan e caricare in un emocitometro. Contare e calcolare il numero di celle e confermare la vitalità della cella.
  6. Aspirare il terreno dalla piastra a 96 pozzetti contenente i dECM e aggiungere 200 μL di terreno di coltura completo contenente 50.000 cellule vitali C2C12.
  7. Incubare per 2 giorni e poi, utilizzando una pinzetta, trasferire i dECM (con le cellule) su una piastra da 48 pozzetti con 400 μL di terreno di coltura completo. Ogni 2 giorni, aspirare con cura il terreno con una micropipetta per evitare che i dECM si stacchino dal fondo del pozzetto e aggiungere terreno fresco fino al giorno 8.
    NOTA: Le matrici vengono conservate per 2 giorni in piastre a 96 pozzetti per promuovere l'adesione delle cellule C2C12 ai dECM e vengono quindi trasferite su una piastra a 48 pozzetti per consentire l'accesso a un volume maggiore di terreno con sostanze nutritive. I dECM dovrebbero aderire al fondo dei pozzi.
  8. Per l'esperimento di differenziazione, sostituire il terreno di coltura completo con terreno di differenziazione (DMEM integrato con siero di cavallo al 2% e penna/streptococco all'1%, seguito dall'incubazione nel terreno di differenziazione per 4 giorni fino al giorno 12.

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Risultati

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L'obiettivo del protocollo di decellularizzazione è quello di produrre dECM che assomiglino molto alla composizione del tessuto nativo. Per determinare l'efficacia del processo di decellularizzazione, sono stati impiegati vari metodi, tra cui l'esame della morfologia dei tessuti, la misurazione dei livelli di DNA, la colorazione per F-actina e l'analisi dei componenti chiave della ECM utilizzando l'immunoistochimica e le tecniche di western blotting. In particolare, sono stati analizzati cinque principali componenti ECM ...

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Discussione

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La ECM è una complessa rete di macromolecole che è presente in tutti i tessuti e svolge un ruolo cruciale nella regolazione del comportamento e della funzione cellulare2. L'ECM agisce come un'impalcatura fisica a cui le cellule possono attaccarsi e fornisce segnali che modulano attivamente i processi cellulari come proliferazione, motilità, differenziazione e apoptosi. Pertanto, una corretta formazione e mantenimento della ECM è essenziale sia per lo sviluppo che per l'omeostasi1...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è stato finanziato dall'Association Française contre les Myopathies (AFM-Téléthon; contratto n. 23049), dal progetto MATRIHEALTH e dal finanziamento dell'unità cE3c UIDB/00329/2020. Vorremmo ringraziare il nostro donatore Henrique Meirelles che ha scelto di sostenere il progetto MATRIHEALTH. Questo lavoro ha beneficiato delle infrastrutture della Facoltà di Scienze Microscopy Facility, un nodo della piattaforma portoghese di BioImaging (riferimento PPBI-POCI-01-0145-FEDER-022122), e ringraziamo Luís Marques per la sua assistenza con l'acquisizione e l'elaborazione delle immagini. Infine, ringraziamo Marta Palma per il supporto tecnico e il nostro team di ricerca per il loro generoso contributo.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Piastra per coltura cellulare a 12 pozzetti, piatta, TC, sterileAbdos LabwareP21021
4′,6-diamidino-2-fenilindolo dicloridratoMerckD8417
4– 20% Mini-PROTEAN TGX Gel prefabbricatoBio-Rad4561093
Piastra per coltura cellulare a 48 pozzetti, piatta, TC, sterileAbdos LabwareP21023
Piastra per coltura cellulare a 96 pozzetti, piatta, TC, sterileAbdos LabwareP21024
Albumina sierica bovina, frazione VNZYtech
BX60 microscopio a fluorescenzaOlympus
Cryostat CM1860 UVLeica
DitiotreitoloThermoFisherR0862
DMEM alto glucosio con glutammina stabile con piruvato di sodioBiowestL0103-500
DNase IPanReac AppliChemA3778
DNeasy Blood & Kit di tessuti Qiagen69506
Acido etilendiamminotetraacetico (EDTA)Merck108418
Siero fetale bovinoBiowestS1560-500
Pipetta per trasferimento di puntali finiThermoFisher15387823
Siero di capraBiowestS2000-100
Hera Guard Flow CabinetHeraeus
Heracell 150 CO2 IncubatoreThermo Scientific
HiMark Proteina precolorata StandardInvitrogen
Siero di cavallo, origine neozelandeseGibco16050122
HRP-α- IgG di coniglioabcam ab205718
HRP-α- IgG di rattoabcamab205720
HRP-α- Topo IgGabcamab205719
ImageJ v. 1.53t
Verde metileSigma-Aldrich67060
MM400 Lissore tissutaleRetsch
NanoDrop ND-1000 Spettrofotometro ThermoFisher
Paraformaldeide, 16% p/v aq. soln., senza metanoloAlfa Aesar043368-9M
Penicillina-Streptomicina (100x) GRiSPGTC05.0100
Falloidina Alexa 488 Thermo Fisher Sci.A12379
Piastra Petri in polistirene 60x15mm con prese d'aria (sterile)Greiner Bio-One628161
Qubit dsDNA HS kitThermo ScientificQ32851
Qubit™ 3 FluorimetroInvitrogen15387293
S6E Zoom StereomicroscopioLeica
Sodium Dodecyl SulfateMerck11667289001
SuperFrost Vetrini di adesione PlusThermo Scientific631-9483
SuperSignal West Pico PLUS Substrato chemiluminescenteThermo Scientific15626144
TCS SPE microscopio confocaleLeica
Tris-(hidroximetil) aminometano (Tris base) ≥ 99%VWR Chemicals28811.295
Triton X-100Sigma-AldrichX100-100ML
Trypan Blue Solution, 0,4%Gibco15250061
Tripsina-EDTA (0,05%) in DPBS (1X)GRiSPGTC02.0100
TWEEN 20 (50% Solution)ThermoFisher3005
WesternBright PVDF-CL membrane roll (0,22µ m)AdvanstaL-08024-001
α-Collagene Iabcamab21286
α-Collagene IVMilliporeAB756P
α-Collagene IVSanta Cruz Biotechnologysc-398655
α-FibronectinaSigmaF-3648
α-Laminin α 2 SigmaL-0663
&alfa;-MHCD.S.H.B.MF20
α-Mouse Alexa 488Sonde molecolariA11017
α-Mouse Alexa 568Sonde molecolariA11019
α-pan-LamininSigmaL- 9393
α-fosfo-istone 3Merk Millipore06-570
α-Rabbit Alexa 568SondemolecolariA21069
α-SondemolecolariA11070
α-Rat Alexa 488Sonde molecolariA11006
MB04601 Rabbit Alexa 488

Riferimenti

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