È necessario un modello animale appropriato per comprendere i meccanismi patologici alla base della stenosi della valvola aortica (AVS) e per valutare l'efficacia degli interventi terapeutici. Il presente protocollo descrive una nuova procedura per lo sviluppo del modello di coniglio AVS tramite una lesione diretta con palloncino in vivo.
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Articolo metodologico
Un modello di stenosi della valvola aortica di coniglio indotta da lesione diretta del palloncino
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In questo articolo
Sommario
Abstract
I modelli animali stanno emergendo come uno strumento importante per comprendere i meccanismi patologici alla base della stenosi della valvola aortica (AVS) a causa della mancanza di accesso a fonti affidabili di valvole aortiche umane malate. Tra i vari modelli animali, i modelli di coniglio AVS sono uno dei più comunemente utilizzati negli studi sugli animali di grandi dimensioni. Tuttavia, i modelli tradizionali di coniglio AVS richiedono un periodo a lungo termine di integrazione alimentare e manipolazione genetica per indurre una stenosi significativa nella valvola aortica, limitandone l'uso negli studi sperimentali. Per affrontare queste limitazioni, viene proposto un nuovo modello di coniglio AVS, in cui la stenosi è indotta da una lesione diretta del palloncino alla valvola aortica. Il presente protocollo descrive una tecnica di successo per l'induzione di AVS nei conigli bianchi neozelandesi (NZW), con procedure passo-passo per la preparazione, la procedura chirurgica e l'assistenza post-operatoria. Questo modello semplice e riproducibile offre un approccio promettente per lo studio dell'inizio e della progressione dell'AVS e fornisce uno strumento prezioso per studiare i meccanismi patologici alla base della malattia.
Introduzione
È sempre più riconosciuto che l'uso di modelli animali appropriati può contribuire a una migliore comprensione dei meccanismi patologici alla base della stenosi della valvola aortica (AVS) a causa della mancanza di accesso a fonti affidabili di valvole aortiche umane malate associate alla progressione della stenosi aortica (SA). Tra i vari modelli animali per lo studio dell'AVS, i conigli sono uno dei modelli AVS di animali di grossa taglia più comunemente usati, e il modello di coniglio AVS è indotto attraverso l'integrazione di colesterolo/vitamina D2 o la manipolazione genetica 1,2,3,4.
Sebbene i modelli di AVS di coniglio abbiano fornito informazioni significative sullo sviluppo e la progressione dell'AVS, rimane ancora difficile indurre l'AVS in modo coerente e riproducibile, come si è visto nei nostri esperimenti preliminari.
Oltre ai modelli animali indotti dalla dieta e geneticamente suscettibili, è stato stabilito un nuovo modello di AVS attraverso lesioni meccaniche dirette nei topi 5,6. Il modello di lesione meccanica induce con successo la stenosi aortica e rappresenta un modello AVS semplice e riproducibile nei topi wild-type. Per quanto ne sappiamo, non ci sono stati studi precedenti che esaminassero gli effetti di una lesione meccanica sulla valvola aortica nei modelli di coniglio. Pertanto, questo studio fornisce una nuova procedura per indurre AVS nei conigli bianchi maschi della Nuova Zelanda attraverso una lesione diretta con palloncino alla valvola aortica, che può imitare accuratamente la condizione di stenosi aortica valvolare. Questo protocollo include descrizioni dettagliate della preparazione, della procedura chirurgica e delle cure post-operatorie, utili per indurre modelli di conigli AVS riproducibili.
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Protocollo
Tutte le procedure di ricerca sugli animali sono state approvate ed eseguite in conformità con la legge sul benessere degli animali da laboratorio, la Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio e le Linee guida e le politiche per gli esperimenti sugli animali fornite dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (IACUC) presso il College of Medicine dell'Università Cattolica della Corea (numero di approvazione: CUMC-2021-0176-05). Il presente studio ha utilizzato conigli bianchi neozelandesi maschi di 3 mesi (NZW) del peso di 3,5-4,0 kg, che sono stati mantenuti in condizioni standard in gabbie individuali. I conigli sono stati alimentati con una dieta normale o con una dieta arricchita di colesterolo allo 0,5% integrata con 50.000 U di vitamina D2 (vedi Tabella dei materiali). Il disegno sperimentale e i metodi di analisi per l'induzione del modello di coniglio AVS sono illustrati nella Figura 1.
1. Preparazione per l'operazione
- Assicurarsi che tutti gli strumenti medici e chirurgici (vedi Tabella dei materiali) siano sterilizzati all'inizio dell'operazione.
- Preparare il set di cateteri a palloncino di dilatazione seguendo i passaggi seguenti.
- Collegare il dispositivo di sgonfiaggio riempito con una miscela di soluzione fisiologica e mezzo di contrasto disponibile in commercio (1:1) alla parte luer lock del catetere a palloncino (vedere Tabella dei materiali).
- Riempire il palloncino con la soluzione di gonfiaggio e rimuovere l'aria dal catetere a palloncino.
NOTA: Per il presente studio, la soluzione di gonfiaggio consisteva in iodixanolo al 30% con soluzione salina allo 0,9% (vedi Tabella dei materiali). - Verificare il corretto gonfiaggio del palloncino spurgando il lume del palloncino con la soluzione di gonfiaggio.
2. Procedura chirurgica per la lesione della valvola aortica
- Somministrare un'iniezione intramuscolare di tiletamina e zolazepam (15 mg/kg) e xilazina (5 mg/kg) (vedere la tabella dei materiali) per anestetizzare l'animale.
NOTA: Prima di somministrare l'anestesia, i conigli sono stati pretrattati con un'iniezione sottocutanea di glicopirrolato (0,05 mg/kg) come agente anticolinergico pre-anestetico. Il livello di anestesia adeguato è stato determinato da una combinazione di criteri, tra cui la mancanza di risposta a un pizzicamento del dito del piede e una frequenza respiratoria costante. - Inserire un catetere endovenoso (IV) da 24 G nella vena auricolare marginale e collegare un set di infusione con soluzione fisiologica eparinizzata (100 U/kg di eparina).
- Collegare il coniglio a un monitor veterinario multiparametrico (vedere la tabella dei materiali) per monitorare continuamente i segni vitali, come il segnale di saturazione dell'ossigeno (SpO2 ), la temperatura e la pressione sanguigna.
NOTA: Per il monitoraggio della SpO 2, collegare il sensore SpO2 alla lingua del coniglio. Per il monitoraggio della temperatura, inserire la sonda nel retto del coniglio. Per il monitoraggio della pressione arteriosa, posizionare il bracciale sull'arto anteriore. - Posizionare il coniglio in posizione supina su un tavolo operatorio dotato di fluoroscopia con arco a C (vedere Tabella dei materiali) e rimuovere i peli dalla zona ventrale del collo utilizzando un tagliapeli per animali (Figura 2A).
- Sterilizzare l'area dell'incisione con iodio e coprire il coniglio con asciugamani chirurgici.
- Posiziona il cuore del coniglio al centro dell'immagine dell'arco a C.
NOTA: Tutti i ricercatori devono indossare indumenti protettivi con dosimetri termoluminescenti (TLD) collegati per ridurre l'esposizione alle radiazioni durante l'esecuzione dell'intervento chirurgico guidato dall'arco a C.- Accendere l'arco a C e selezionare la modalità fluoroscopica per l'imaging cardiaco.
- Regolare la posizione del coniglio per assicurarsi che il cuore sia al centro del campo di imaging.
- Fai un'incisione longitudinale di circa 3 cm nella pelle del collo e usa le forbici chirurgiche per tagliare la fascia e il tessuto adiposo.
- Esporre l'arteria carotide comune sinistra (LCCA) separando con cura i muscoli fino a quando non sono esposti circa 3-3,5 cm dell'LCCA (Figura 2B).
- Legare l'LCCA con una sutura di seta 3-0 (vedere la tabella dei materiali) nella parte superiore e all'estremità dell'LCCA esposto per arrestare il flusso sanguigno.
- Inserire un catetere endovenoso da 22 G nell'LCCA e introdurre un filo guida (0,016 pollici, vedere Tabella dei materiali) nel ventricolo sinistro (LV) attraverso il catetere endovenoso, assicurandosi che la punta del catetere sia posizionata correttamente nel campo di imaging dell'arco a C.
NOTA: Quando si inserisce il catetere endovenoso, allentare con cautela la sutura della legatura scendendo verso la valvola aortica per consentire l'avanzamento del catetere. - Estrarre il catetere endovenoso, lasciando il filo guida, e posizionare una guaina 4-F (vedere la tabella dei materiali) sul filo guida nell'LCCA per introdurre il catetere a palloncino (Figura 2C).
NOTA: Dopo aver sostituito il catetere endovenoso con la guaina, l'aria intrappolata deve essere rimossa dal dispositivo della guaina. - Inserire con cautela il catetere a palloncino da 8 mm sopra il filo guida nella valvola aortica sotto guida fluoroscopica con arco a C (Figura 2D).
- Posizionare la punta del catetere a palloncino a circa 1-2 cm distale dalla valvola aortica e gonfiare il palloncino spurgando la soluzione di gonfiaggio con un gonfiatore a pressione a 6 atm.
- Far avanzare il palloncino nell'apice LV e tirarlo indietro nell'uscita LV. Ripetere questa procedura cinque volte, quindi sgonfiare il palloncino (Figura 2E, F).
- Ripetere i passaggi 2.8-2.9 tre volte per garantire un'adeguata lesione della valvola.
- Estrarre il catetere a palloncino e il filo guida. Rimuovere lentamente la guaina dall'LCCA e legare immediatamente l'LCCA con la sutura durante la discesa verso la valvola aortica.
- Pulire l'area dell'incisione con soluzione fisiologica per rimuovere i coaguli di sangue e ispezionare il sito perforato per il sanguinamento arterioso.
- Chiudere il muscolo e la pelle con una sutura 3-0 non assorbibile e sterilizzare tutti i lati della ferita con iodio.
3. Cure post-operatorie
- Rimuovere i cerotti e le clip di monitoraggio e tenere il coniglio in un'incubatrice per terapia intensiva.
NOTA: Dopo l'intervento chirurgico, i conigli sono stati osservati attentamente per 1 giorno in un'incubatrice di terapia intensiva e poi spostati in una gabbia domestica. - Gestire il dolore post-operatorio con 5 mg/kg di tramadolo e 3 mg/kg di ketoprofene e somministrare antibiotici (4 mg/kg di gentamicina) due volte al giorno per 3 giorni tramite iniezione sottocutanea (vedere Tabella dei materiali).
NOTA: La gestione del dolore post-operatorio deve aderire alle linee guida veterinarie e IACUC (ad es. oppioidi, FANS, anestetico locale o combinazione). - Somministrare una dieta arricchita di colesterolo allo 0,5% con 50.000 U di vitamina D2 (HC + VitD2) per 8 settimane.
4. Ecocardiografia
- Dopo 8 settimane di lesione da palloncino, anestetizzare il coniglio utilizzando la stessa procedura descritta al punto 2.1.
- Visualizza le valvole aortiche utilizzando viste transtoraciche bidimensionali e registra immagini in modalità M nelle viste dell'asse corto e dell'asse lungo.
- Metti il coniglio in posizione supina su un tavolo eco.
- Radere la zona del torace con tagliacapelli e crema depilatoria.
- Applicare il gel del trasduttore ad ultrasuoni (vedi Tabella dei materiali) sul torace.
- Regolare il trasduttore per ottenere la vista parasternale sull'asse lungo e la vista parasternale sull'asse corto della valvola aortica.
- Utilizza l'imaging in modalità M per registrare le immagini della valvola aortica sia nell'asse lungo che nell'asse corto e salva le immagini per un'analisi successiva.
5. Analisi istologica
- Dopo l'ecocardiografia, sopprimere il coniglio somministrando un'iniezione endovenosa di cloruro di potassio (KCl, 3 g/20 mL, 1 mL).
- Aprire la cavità toracica, prelevare il cuore con l'aortaascendente 7 e posizionarlo su ghiaccio in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS).
- Immergere immediatamente il cuore in una soluzione di paraformaldeide (PFA) al 4% e incorporarlo in un blocco di paraffina (vedere Tabella dei materiali).
- Tagliare il blocco cardiaco incluso in paraffina in sezioni spesse 4 μm utilizzando un microtomo e colorare le sezioni con tricromica di Masson (MT), rosso di alizarina e von Kossa (vedi tabella dei materiali) per valutare rispettivamente la deposizione di collagene e la calcificazione della valvola 8,9.
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Risultati
Modello di AVS di coniglio indotto da lesione della valvola aortica
Per indurre il modello AVS del conio, per questo studio sono stati utilizzati conigli maschi NZW del peso di 3,5-4,0 kg. Secondo le procedure chirurgiche descritte nella fase 2 (Figura 2), il modello AVS è stato stabilito da una lesione della valvola aortica, che ha provocato la degenerazione meccanica della valvola aortica e la calcificazione. Il gruppo di controllo comprendeva conigli alimentati con una...
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Discussione
I modelli animali di AVS sono comunemente usati per studiare gli aspetti patologici dell'AVS, tra cui l'inizio e la progressione dell'AVS. Questo protocollo introduce un nuovo modello di AVS di coniglio indotto da una lesione diretta da palloncino alla valvola aortica. In questo studio, il modello di lesione della valvola aortica ha mostrato un significativo ispessimento e calcificazione dei lembini. Rispetto al modello AVS lieve indotto dall'integrazione alimentare, la valvola aortica nel modello di lesione diretta con ...
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare con questo lavoro.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione della National Research Foundation of Korea (NRF) finanziata dal governo coreano (MSIT) (n. 2020R1A4A3079570), dal Ministero dell'Istruzione (n. 2021R1I1A1A01051425) e dal Programma di sviluppo tecnologico strategico industriale (n. 20014873) finanziato dal Ministero del Commercio, dell'Industria e dell'Energia, Repubblica di Corea.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Sutura di seta 3-0 | AILEE | SK312 | |
| 4% paraformaldeide (PFA) | Intron | IBS-BP031-2 | |
| Soluzione rosso alizarina | Millpore | TMS-008-C | |
| ASAHI SION BLUE | Filo guida | ASAHI | |
| Copritavolo posteriore | Yuhan kimberly | 80101-30 | |
| Dispositivo di sgonfiaggio con palloncino | Demax Medical | DID30s | |
| Bionet Monitor veterinario | BIONET | BM3 VET | |
| C-Arm | SIEMENS Healthcare GmbH | Cios alpha | |
| Dieta certificata per conigli | Purina | 5322 | 4,7% di olio di cocco idrogenato, 0,5% di colesterolo e 1% Molasse |
| Curadle Smart Incubator | Autoelex | CS-CV206 | Unità di Terapia Intensiva (ICU) |
| Ergocalciferol | Sigma-aldrich | E5750 | Vitamina D2 |
| Fechtner pinza congiuntiva titanio | WORLD PRECISSION Strumento | WP1820 | |
| Pinze | HEBU | HB203 | |
| Gentamicina | Shin Poong | ||
| Glicopirrolato | SamChunDang | ||
| Greenflex NS | DAI HAN PHARM | Soluzione salina normale 500 ml | |
| ematossilina | Sigma-aldrich | HT1079-1 SET | |
| Heparin | JW farmaceutico | 25.000 U | |
| Set per infusione monouso | SWOON MEDICAL | ||
| Iodio | Verde farmaceutico | ||
| Iodixanol | GE Healthcare | Visipaque | Soluzione di gonfiaggio (agente di contrasto) |
| Catetere IV 22 G | BD | ||
| Catetere 382423 IV 24 G | BD | 382412 | |
| Ketoprofene | SamChunDang | ||
| Siringa Luer-Lok 10 mL | Becton Dickinson Medical | ||
| Luer-Lok 3 mL | Microscopio medico | ||
| OLYMPUS | SZ61 | ||
| Microtomo | ThermoFisher Scientific | HM 325 | |
| MT | Sigma-aldrich | HT15-1kt | |
| Needel holder | Solco | 009-1304 | |
| Portaaghi con blocco e sutura | JEUNGDO BIO & PLANT | H-1222-18 | |
| Paraffina | LK LABKOREA | H06-660-107 | |
| PBS | Gibco | 10010-023 | |
| Cloruro di potassio 40 | Daihan Pharm | KCl | |
| Prelude Guaina idrofila ideale | MERIT MEDICAL | Guaina PID4F11018SS 4F | |
| PTA Catetere per dilatazione a palloncino | Boston Scientific | H749-3903280208-0 | Catetere a palloncino 8,0 mm |
| Rompun | Elanco | Xylaxine | |
| garza sterile | DAE HAN Medical | 10 cm x 20 cm | |
| Guanti chirurgici | Ansell | Camice chirurgico Ansell | |
| Yuhan kimberly | 90002-02 | ||
| Forbici chirurgiche | Nopa, Germania | AC020/16 | |
| Nastro chirurgico | 3M micopore | 1530-1 | |
| Siringa 1 mL Siringa | medica | ||
| 10 mL | Shin Chang Medical | ||
| Cassetta tissutale | Scilav korea | Cas3003 | |
| Trasduttore in gel | SUNGHEUNG | SH102 | |
| Tridol | Yuhan Corp. | Ultrasuoni Tramadol HCl | |
| Philps | Affiniti 50 | ||
| Kit colorante Von Kossa | Abcam | ab105689 | |
| Zoletil 50 | Virbac korea | Tiletamine & zolazepam |
Riferimenti
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Ristampe e permessi
