Her beskriver vi en protokoll for å trekke ut endogent tubulin fra pattedyrceller, som kan mangle eller inneholde spesifikke mikrotubuli-modifiserende enzymer, for å oppnå mikrotubuli beriket for en spesifikk modifikasjon. Vi beskriver deretter hvordan de ekstraherte mikrotubuli kan dekoreres med rensede mikrotubulibindende proteiner for å forberede rister for kryo-elektronmikroskopi.
Mikrotubuli er en viktig del av cytoskjelettet og er involvert i intracellulær organisasjon, celledeling og migrasjon. Avhengig av posttranslasjonelle modifikasjoner kan mikrotubuli danne komplekser med forskjellige samvirkende proteiner. Disse mikrotubuli-proteinkompleksene er ofte involvert i menneskelige sykdommer. Å forstå strukturen til slike komplekser er nyttig for å belyse deres virkningsmekanismer og kan studeres ved kryo-elektronmikroskopi (cryo-EM). For å oppnå slike komplekser for strukturelle studier, er det viktig å trekke ut mikrotubuli som inneholder eller mangler spesifikke posttranslasjonelle modifikasjoner. Her beskriver vi en forenklet protokoll for å ekstrahere endogent tubulin fra genmodifiserte pattedyrceller, som involverer mikrotubuli polymerisasjon, etterfulgt av sedimentering ved hjelp av ultrasentrifugering. Det ekstraherte tubulinet kan deretter brukes til å fremstille kryo-elektronmikroskopgitter med mikrotubuli som er bundet til et renset mikrotubulibindende protein av interesse. Som et eksempel demonstrerer vi ekstraksjonen av fullt tyrosinerte mikrotubuli fra cellelinjer konstruert for å mangle de tre kjente tubulin-detyrosinerende enzymene. Disse mikrotubuli brukes deretter til å lage et proteinkompleks med enzymatisk inaktive mikrotubuli-assosierte tubulindetyrosinase på kryo-EM-gitter.
Mikrotubuli er en viktig del av cytoskjelettet; De er involvert i ulike funksjoner som cellemigrasjon og deling, men bidrar også til intracellulær organisasjon. For å tilpasse seg forskjellige funksjonelle skjebner, interagerer mikrotubuli med en rekke mikrotubuli-assosierte proteiner (MAPs), enzymer og andre proteiner, som vi kollektivt vil referere til som “mikrotubuli-interagerende proteiner.” Mikrotubulibindingen av disse proteinene kan styres av forskjellige tubulinmodifikasjoner, ofte referert til som “tubulinkoden”1. Eksempler på denne preferansen er den mitotiske sentromerassosierte kinesin (MCAK)2 og dynein-dynaktinet CAP-Gly-domenet til p1503, som fortrinnsvis assosieres med tyrosinert tubulin, mens kinesinmotorene sentromerassosiert protein E (CENP-E)4 og kinesin-25 foretrekker tubulin som mangler det C-terminale tyrosinet.
Mens en rekke metoder kan brukes til å studere mikrotubuli-protein-interaksjoner, brukes kryo-elektronmikroskopi (kryo-EM) ofte til å studere disse interaksjonene ved nær atomoppløsning 6,7. I de senere år har kryo-EM-strukturer avslørt hvor store motorproteiner som dynein 8,9,10 og kinesin 11, +TIP-proteiner som EB3 12,13 og MCAK14, andre proteiner som Tau15,16, og til og med små molekyler som paklitaksel, pelosid og zampanolid 17 samhandle med mikrotubuli. For å studere mikrotubuli-protein-interaksjoner, blir mikrotubuli vanligvis ekstrahert fra svinehjernen18. Etter dette utføres de fleste in vitro-studier, inkludert kryo-EM-mikrotubulistrukturer, ved bruk av svinehjernetubulin. Resultatene av disse studiene tilslører derfor betydningen av den heterogene naturen til tubulinmodifikasjoner19 mellom vev og celletyper. Dette skaper et spesielt problem når man undersøker et protein som krever eller foretrekker en spesifikk modifikasjon for å binde seg til mikrotubuli. Dette kan illustreres med tyrosinert tubulin, substratet for mikrotubuli detyrosinase MATCAP.
Detyrosinering er en tubulinmodifikasjon der den C-terminale aminosyren tyrosin av α-tubulin mangler, som er assosiert med mitotisk, hjerte- og nevronfunksjon20. Mens fullt tyrosinerte mikrotubuli er det ideelle substratet for MATCAP, er dette stort sett fraværende i kommersielt tilgjengelige mikrotubuli fra svinehjernen på grunn av funksjonen til vasohibinene21,22 og MATCAP 23 detyrosinaser i dette vevet 22,23,24,25,26 . Selv om kommersielt tilgjengelig HeLa tubulin for det meste inneholder tyrosinerte mikrotubuli, kan detyrosinering forekomme, og denne kilden til tubulin er derfor mindre egnet til å lage en jevn prøve for kryo-EM-analyse.
For å stimulere bindingen av MATCAP til mikrotubuli og lage en homogen prøve for strukturanalyse, søkte vi en kilde til mikrotubuli som er fullstendig tyrosinert. Til dette formål ble det opprettet en MATCAP og vasohibin-mangelfull cellelinje, som ble brukt til å trekke ut fullt tyrosinerte mikrotubuli. Ekstraksjonsprosedyren var basert på veletablerte protokoller som bruker gjentatte sykluser av polymerisering og depolymerisering av mikrotubuli for å trekke ut tubulin fra hjernevev eller celler 18,27,28,29,30, med bare et enkelt polymerisasjonstrinn og sentrifugering over en glyserolpute. Ved å bruke MATCAP som et eksempel, demonstrerer vi hvordan disse mikrotubuli kan brukes til kryo-EM-studier. For å forberede kryo-EM-nett beskrives en to-trinns applikasjonsprotokoll ved lav saltkonsentrasjon. Metodene i denne artikkelen beskriver ekstraksjonen av tilpassbare mikrotubuli i tilstrekkelige mengder og renhet for å utføre kryo-EM-analyse og gir en detaljert protokoll for hvordan man bruker disse mikrotubuli til å lage protein-mikrotubulikomplekser på kryo-EM-nett.
Denne metoden beskriver hvordan man raskt kan trekke ut endogent tubulin fra cellelinjer og deretter dekorere disse mikrotubuli på kryo-EM-gitter. Mikrotubuli er temperaturfølsomme. De depolymeriserer i et kaldt miljø og polymeriserer i et varmt miljø31. Det er derfor viktig å utføre sonikering og clearance spinn (trinn 1,1-1,5) ved 4 ° C for å solubilisere tubulin. Hvis noen faktorer stabiliserte mikrotubuli så godt at de ikke ville depolymerisere i dette trinnet, ville disse mikrotubuli og stabiliserende faktorer bli kassert i pelleten etter det første clearance-spinnet. Etter (re)polymerisering av mikrotubuli, er det viktig å holde løsningen som inneholder polymeriserte mikrotubuli varm til enhver tid. Vi ekstraherte mikrotubuli fra HCT116-celler, som er mangelfull i VASH1-, VASH2- og MATCAP-proteinene. Andre cellelinjer, så vel som vev, kan brukes til å trekke ut mikrotubuli29, selv om forurensningene, tubulinisotypene og utbyttet kan være svært forskjellige fra det som er beskrevet her. Overuttrykkende plasmider som inneholder modifiserende enzymer kan også brukes til å introdusere spesifikke tubulinmodifikasjoner.
Andre protokoller 18,27,28,29,30 bruker flere sykluser av polymerisering og depolymerisering av mikrotubuli for å oppnå mikrotubuli uten andre interagerende proteiner. Her har vi forenklet disse protokollene og polymeriserer bare mikrotubuli en gang. Det er mulig at disse mikrotubuli på grunn av denne enkle polymerisasjonen kan samsedimentere med andre mikrotubuli-interagerende proteiner. Vi har imidlertid funnet ut at denne protokollen gir tilstrekkelig rene mikrotubuli for kryo-EM-formål. Hvis en renere prøve er nødvendig for spesifikke analyser, kan ytterligere sykluser av polymerisering og depolymerisering gi en renere prøve, selv om dette kan være på bekostning av mikrotubuliutbyttet. I denne protokollen brukte vi paklitaksel til å polymerisere mikrotubuli. Paklitaksel kan imidlertid forvrenge mikrotubuligitteret mot en viss vridning og stigning, noe som kan forstyrre mikrotubuliaffiniteten til proteinet av interesse. Andre mikrotubulistabiliserende reagenser kan brukes hvis paklitaksel er uegnet. eksempler på disse reagensene er ikke-taksanmolekyler som pelorusid eller ikke-hydrolyserbare GTP-varianter som GMPCPP17,32.
For å strukturelt undersøke proteiner som binder seg til mikrotubuli på kryo-EM-gitter, må man binde en tilstrekkelig mengde protein av interesse for mikrotubuli. Et vanlig forekommende problem er at proteinkomplekser som er stabile i løsning faller fra hverandre på rutenettet. For å danne proteinkomplekset på rutenettet var det avgjørende å først legge mikrotubuli i lag og deretter påføre det mikrotubulibindende proteinet med lav saltkonsentrasjon på det mikrotubulibelagte rutenettet, og dermed samle proteinkomplekset direkte på rutenettet. Andre har på samme måte rapportert en33,34-protokoll med lite salt og en to-trinns applikasjon34,35,36-protokoll for vellykket mikrotubuli-dekorasjon. Det er sannsynlig at en lavere saltkonsentrasjon forstyrrer proteinkomplekset mot en mer stabil interaksjon på grunn av de reduserte elektrostatiske ladningene. På grunn av den lave saltkonsentrasjonen er imidlertid proteinet av interesse i fare for utfelling. Derfor anbefales det sterkt å holde proteinet på eller rundt fysiologisk relevante saltkonsentrasjoner til kort tid før vitrifisering av ristene. Denne to-trinns applikasjonsprotokollen forhindrer sannsynligvis at proteinkomplekset faller fra hverandre under blotting eller stupfrysing. I denne protokollen brukte vi Vitrobot. Imidlertid kan raskere vitrifikasjonsmetoder (VitroJet) eller bruk av blottfrie rutenett (Puffalot) eller enheter som har begge egenskapene (kameleon) potensielt overvinne to-trinns applikasjonen, men disse er for øyeblikket ikke allment tilgjengelige for testing.
Den endelige oppløsningen av den rekonstruerte kryo-EM-tettheten kan påvirkes av en rekke faktorer, inkludert bevegelsen av det mikrotubulibindende proteinet i forhold til mikrotubuli og dekorasjonsnivået som kan oppnås. Høyere mikrotubuli dekorasjon er sannsynligvis gunstig for den endelige oppløsningen oppnådd i 3D-tetthetsrekonstruksjonen. Dette kan begrenses av noen få faktorer, for eksempel den høyeste proteinkonsentrasjonen som oppnås under rensingen av det mikrotubulibindende proteinet, den laveste saltkonsentrasjonen som det mikrotubuli-interagerende proteinet tåler uten aggregering, og bindingsmodusen til det mikrotubuli-interagerende proteinet (f.eks. Proteinet kan spenne over mer enn en tubulindimer, og dermed hindre et bindingsforhold på 1: 1). Selv om oppløsningen av kryo-EM-rekonstruksjonen kan bli kompromittert av tynt dekorerte mikrotubuli, kan beregningsanalyse omgå mange problemer, som eksemplifisert ved en nylig rapportert mikrotubuli-proteinkompleksstruktur som var ekstremt sparsomt dekorert8.
Protokollen vi beskriver her presenterer en rask, rimelig metode for å oppnå mikrotubuli egnet for kryo-EM-formål. I motsetning til kommersielt tilgjengelig svinehjernetubulin, er mikrotubuli avledet fra MATCAP-mangelfulle og vasohibinfattige HCT116-celler fullstendig tyrosinert (figur 4). Kommersielt HeLa tubulin, et dyrt reagens, er i prinsippet relativt jevnt tyrosinert og inneholder lite andre modifikasjoner4 som glutamylering, men partiene kan variere, og modifikasjon kan bare oppnås in vitro. En fordel med å ekstrahere mikrotubuli fra skreddersydde cellelinjer er fleksibiliteten man har til å overuttrykke eller slette tubulinmodifiserende enzymer, slik som tubulin detyrosinaser, for å skape en mer homogen pool av mikrotubuli. Dette kan være til fordel for dekorasjonen og ensartetheten til kryo-EM-prøven og vil til slutt være til nytte for enkelheten og kvaliteten på kryo-EM-tetthetskartene og molekylære strukturer avledet fra denne prøven.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker alle medlemmene av Sixma-, Brummelkamp- og Perrakis-gruppene for deres fruktbare vitenskapelige diskusjoner og for å gi et hyggelig arbeidsmiljø, og spesielt takker vi Jan Sakoltchik (“person 2”) for å hjelpe til med å bestemme proteinkonsentrasjonen som er avbildet i figur 3C. Vi vil også takke NKI kryo-EM-anlegget og Nederland Centre for Electron Nanoscopy (NeCEN) ved Leiden University for deres støtte. Dette arbeidet ble støttet av NWO Vici-stipend 016.Vici.170.033 tildelt T.R.B.. AP og TRB er Oncode-etterforskere og mottar finansiering fra NWO ENW (OCENW. M20.324). L.L. mottok finansiering fra det østerrikske vitenskapsfondet (FWF JB4448-B). Denne forskningen ble støttet av et institusjonelt tilskudd fra den nederlandske kreftforeningen og det nederlandske departementet for helse, velferd og sport.
Material | |||
0.05% trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | Cell culture |
10 cm plate | Falcon | 353003 | Cell culture |
15 cm plate | Thermo FisherScientific | 168381 | Cell culture |
50 mL tubes | Sarstedt | 62.547255 | Cell culture |
300 mesh quantifoil holey carbon copper grid R1.2/1.3 | Quantifoil Micro Tools | N1-C14nCu30-01 | Cryo-EM grid preparation |
Cell scrapers | Falcon | 353085 | Cell culture |
DMEM | Gibco | 41966-029 | Cell culture |
EDTA | Merck | 108418 | Cell culture |
EGTA | Sigma Aldrich | E3899 | Microtubule extraction |
Ethane gas | Cryo-EM grid preparation | ||
FCS | Serana | s-FBS-EU-015 | Cell culture |
Glycerol | VWR | 24.397.296 | Microtubule extraction |
GTP | Fisher Scientific | G8877-1G | Microtubule extraction |
HCT116 VASH1 VASH2 MATCAP KO cells | self made | Wild type HCT116 cells RRID: CVCL_0291 | Cell culture |
KOH | Merck | 1.05033 | Microtubule extraction |
MgCl2 | Merck | 105833 | Microtubule extraction |
Microtubule binding protein | self made | Cryo-EM grid preparation | |
Needle | BD microlance | 300600 | Microtubule extraction |
Paclitaxel | Santa Cruz Biotechnology | sc-212517 | caution toxic, microtubule extraction |
PBS | Fisher Scientific | BP399 | Cell culture |
Penicillin and streptomycin | Sigma Aldrich | P0781-100mL | Cell culture |
PIPES | Merck | P8203 | Microtubule extraction |
PMSF (in EtOH) | Roche | 16837091001 | Microtubule extraction |
SDS sample buffer | self made | Quality assessment | |
Syringe | BD plastipak | 309658 | Microtubule extraction |
Ultra protease tables mini | Fisher Scientific | NC0975224 | Microtubule extraction |
Whatman blotting paper | Whatman | 47000-100 | Cryo-EM grid preparation |
Equipment | |||
Flow hood | cell culture | ||
GloQube | Quorum | Cryo-EM grid preparation | |
Grid storage box | SWISSCI | 41018 | Cryo-EM grid storage |
Heating block, electric or metal | to warm the buffers | ||
Incubator, cell culture | NUAIR | cell culture | |
LN2 dewar | Cryo-EM grid storage | ||
Plunge-tweezers | Electron Microscopy Sciences | 0508-L5-PS | Cryo-EM grid preparation, hole drilled in top to fit the vitrobot |
Polystyrene box | to keep the buffers warm | ||
Sonicator | Qsonica | Q700 | Microtubule extraction |
Standard light microscope | Olympus | CKX 41 | Quality assessment |
TLA 100.3 rotor | Beckman Coulter | Microtubule extraction | |
TLA 120.2 rotor | Beckman Coulter | Microtubule extraction | |
Tubes for TLA 100.3 rotor | Beckman Coulter | 326819 | Microtubule extraction |
Tubes for TLA 120.2 rotor | Beckman Coulter | 347356 | Microtubule extraction |
Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima MAX-XP | Microtubule extraction |
Vitrobot | FEI, ThermoFischer Scientific | mark IV | Cryo-EM grid preparation |
Vitrobot polystyrene container assembly with metal ethane cup | ThermoFisher Scientific | 200703 | Cryo-EM grid preparation |
Water bath | cell culture |