Estrazione di microtubuli modificati da cellule di mammifero per studiare complessi microtubulo-proteine mediante microscopia crioelettronica

I microtubuli sono una parte cruciale del citoscheletro; Sono coinvolti in diverse funzioni come la migrazione e la divisione cellulare, ma contribuiscono anche all'organizzazione intracellulare. Per adattarsi a diversi destini funzionali, i microtubuli interagiscono con una varietà di proteine associate ai microtubuli (MAP), enzimi e altre proteine, che chiameremo collettivamente "proteine che interagiscono con i microtubuli". Il legame dei microtubuli di queste proteine può essere guidato da diverse modificazioni della tubulina, comunemente indicate come "codice della tubulina"¹. Esempi di questa preferenza sono la chinasina associata al centromero mitotico (MCAK)2 e il dominio CAP-Gly dineina-dinactina di p150³, che si associano preferibilmente alla tubulina tirosina, mentre la proteina E associata al centromero dei motori della chinesina (CENP-E)⁴ e la kinesina-2⁵ preferiscono la tubulina priva della tirosina C-terminale.

Mentre una varietà di metodi può essere impiegata per studiare le interazioni microtubulo-proteina, la microscopia crioelettronica (crio-EM) è spesso usata per studiare queste interazioni a risoluzione quasi atomica ^6,7. Negli ultimi anni, le strutture crio-EM hanno rivelato come grandi proteine motorie come la dineina ^8,9,10 e la kinesina¹¹, le proteine +TIP come EB3^12,13 e MCAK 14, altre proteine come Tau ^15,16 e persino piccole molecole come paclitaxel^, peloruside e zampanolide ¹⁷ interagire con i microtubuli. Per studiare le interazioni microtubulo-proteina, i microtubuli sono tipicamente estratti dal cervello suino¹⁸. Successivamente, la maggior parte degli studi in vitro, comprese le strutture di microtubuli crio-EM, vengono effettuati utilizzando la tubulina cerebrale suina. I risultati di questi studi, quindi, oscurano l'importanza della natura eterogenea delle modificazioni della tubulina¹⁹ tra tessuti e tipi di cellule. Ciò crea un problema particolare quando si studia una proteina che richiede o preferisce una modifica specifica per legarsi ai microtubuli. Questo può essere illustrato con la tubulina tirosinata, il substrato per la microtubulasi detirosinasi MATCAP.

La detirosinazione è una modificazione della tubulina in cui manca l'amminoacido C-terminale tirosina della α-tubulina, che è associata alla funzione mitotica, cardiaca e neuronale²⁰. Mentre i microtubuli completamente tirosinati sono il substrato ideale per MATCAP, questo è in gran parte assente nei microtubuli disponibili in commercio dal cervello suino a causa della funzione delle vasohibine 21,22 e MATCAP 23 detirosinasi in questo tessuto 22,23,24,25,26. Sebbene la tubulina HeLa disponibile in commercio contenga principalmente microtubuli tirosinati, potrebbe verificarsi detirosinazione e questa fonte di tubulina è, quindi, meno adatta per creare un campione uniforme per l'analisi crio-EM.

Per stimolare il legame di MATCAP ai microtubuli e creare un campione omogeneo per l'analisi strutturale, abbiamo cercato una fonte di microtubuli completamente tirosinata. A tal fine, è stata creata una linea cellulare MATCAP e carente di vasohibina, che è stata utilizzata per estrarre microtubuli completamente tirosinati. La procedura di estrazione si è basata su protocolli consolidati che utilizzano cicli ripetuti di polimerizzazione e depolimerizzazione dei microtubuli per estrarre la tubulina dal tessuto cerebrale o dalle cellule 18,27,28,29,30^, con una sola fase di polimerizzazione e centrifugazione su un cuscino di glicerolo. Utilizzando MATCAP come esempio, dimostriamo quindi come questi microtubuli possono essere utilizzati per studi crio-EM. Per preparare le griglie crio-EM, viene descritto un protocollo di applicazione in due fasi a bassa concentrazione di sale. I metodi in questo articolo descrivono l'estrazione di microtubuli personalizzabili a quantità e purezza sufficienti per eseguire analisi crio-EM e forniscono un protocollo dettagliato su come utilizzare questi microtubuli per creare complessi proteina-microtubuli su griglie crio-EM.

NOTA: Vedere la tabella dei materiali per i dettagli relativi a tutti i materiali e le attrezzature utilizzati in questo protocollo.

1. Coltura cellulare

NOTA: Tutte le colture cellulari devono essere eseguite in una cappa a flusso laminare sterile.

1. Per seguire questo protocollo, prima scongelare una fiala di cellule congelate in un bagno d'acqua a 37 °C. Qui, usiamo una linea cellulare HCT116 geneticamente modificata che manca dei tre enzimi detirosinanti noti, VASH1, VASH2 e MATCAP, per creare tubulina tirosinata.
2. Preparare una piastra Ø 10 cm contenente 10 ml del terreno di coltura cellulare appropriato.
   NOTA: In questo protocollo, DMEM (terreno Eagle modificato di Dulbecco) integrato con FCS (siero fetale di vitello del 10%) e antibiotico penicillina/streptomicina (terreno di coltura) è stato utilizzato per la linea cellulare HCT116 geneticamente modificata.
3. Contare le cellule e seminare ~ 2,5 × 10⁶ cellule vitali (~ 20% di confluenza) nella piastra preparata da 10 cm. Agitare delicatamente la piastra per distribuire uniformemente le celle. Incubare il piatto in un incubatore di coltura cellulare a 37 °C gassato con 5% (v/v) di CO₂ fino a quando le cellule raggiungono l'80%-90% di confluenza.
   NOTA: In genere, questo richiede 3 giorni per le cellule HCT116, ma il tempo potrebbe dipendere dalla densità di semina specifica e dalla linea cellulare utilizzata.
4. Scartare il terreno di coltura cellulare utilizzando una pipetta o un aspiratore sottovuoto e lavare il piatto 2 x 5 ml di PBS.
   NOTA: Fare attenzione a non erogare il PBS con troppa forza sul monostrato cellulare in quanto ciò potrebbe staccare le cellule dalla piastra.
5. Aggiungere 1-2 ml di tripsina e incubare le cellule nell'incubatore per 2-5 minuti per staccare le cellule.
6. Aggiungere 2 ml del terreno di coltura alla piastra per estinguere la tripsina.
7. Dividere la sospensione cellulare in tre o cinque parti uguali e riseminarle per espandere le cellule in terreno di coltura fino ad ottenere 6-12 piastre confluenti da 15 cm.

2. Raccolta

1. Lavare delicatamente le cellule con 10 ml di PBS (1x) per rimuovere qualsiasi terreno di coltura cellulare.
2. Staccare le cellule dalle piastre incubando le cellule per 5 minuti a temperatura ambiente con 3 ml di PBS ghiacciato integrato con 5 mM EDTA (sterile/filtrato) e, successivamente, utilizzando un raschietto cellulare.
3. Raccogliere le cellule in una provetta da 50 ml su ghiaccio e centrifugare verso il basso (10 min, 250 × g).
   1. Notare il volume delle cellule raccolte con la scala volumetrica sul tubo da 50 ml.
      NOTA: il volume previsto può essere compreso tra ~ 0,5 ml e 4 ml. FASE DI PAUSA: congelare il pellet cellulare in LN2 e conservare a -20 °C fino all'uso. Si noti che il pellet cellulare può essere conservato solo per alcune settimane o mesi. Se il pellet viene conservato più a lungo, potrebbe comportare una diminuzione della resa o l'assenza di microtubuli.

3. Estrazione dei microtubuli

NOTA: Tenere tutto per i passaggi 3.1-3.5 sul ghiaccio; tutto dal punto 3.6 in poi deve essere tenuto al caldo (30-37 °C).

1. Preparare 10 mL di tampone di lisi ghiacciato contenente 100 mM PIPES/KOH (PH 6,9), 2 mM EGTA/KOH, 1 mM MgCl₂, 1 mM PMSF e una compressa di inibitore della proteasi (mini).
2. Risospendere il pellet cellulare raccolto in tampone di lisi 1:1 v/v (in caso di dubbio sul volume esatto, prendere meno tampone di lisi piuttosto che di più).
3. Lisare le cellule mediante sonicazione: 15 s on, 45 s off, amp 30, quattro cicli (determinare le condizioni sperimentalmente e cambiare secondo il sonicatore).
   1. Dopo la sonicazione, raccogliere un campione per l'analisi SDS-PAGE: 2 μL di lisato + 18 μL di acqua + 5 μL di 5x tampone campione SDS.
      NOTA: Controllare al microscopio ottico standard se le cellule sono state effettivamente completamente lisate.
4. Pipettare le celle lisate in un tubo centrifugo. Centrifugare per 1 ora a 100.000 × g a 4 °C in un rotore ultracentrifugo per eliminare il lisato.
   NOTA: Assicurarsi che tutte le tasche del rotore siano asciutte e pulite per garantire il corretto bilanciamento della centrifuga.
5. Usi una siringa per estrarre il lisato eliminato. Fare attenzione a non disturbare il pellet e lo strato galleggiante sulla parte superiore.
   1. Raccogliere un campione del lisato eliminato: 2 μL di lisato + 18 μL di acqua + 5 μL di 5x tampone campione SDS.
   2. Risciacquare accuratamente il pellet e raccogliere un po 'di pellet facendo roteare una punta di pipetta P10 attraverso il pellet; aggiungere 200 μL di acqua e 50 μL di tampone SDS.
6. Integrare il surnatante della fase precedente con 1 mM GTP e 20 μM di paclitaxel per polimerizzare i microtubuli; per un volume di 1 mL, aggiungere 10 μL di 2 mM di paclitaxel e 10 μL di 100 mM GTP.
   ATTENZIONE: Paclitaxel può causare irritazione cutanea, gravi danni agli occhi, irritazione respiratoria, difetti genetici, danni al feto e danni agli organi. L'esposizione prolungata o ripetuta provoca danni agli organi. Non respirare, spruzzare o spolverare la sostanza in alcun modo. Indossare guanti di gomma in nitrile per evitare il contatto con la pelle.
7. Incubare il surnatante integrato con GTP/paclitaxel per 30 minuti a 37 °C per consentire l'assemblaggio dei microtubuli.
8. Durante questa fase di incubazione, lasciare che il rotore e l'ultracentrifuga si riscaldino fino a 30 °C.
9. Preparare il tampone cuscino: aggiungere 0,6 ml di glicerolo a 0,4 ml di tampone di lisi e integrare la miscela con 20 μM di paclitaxel. Preriscaldare il cuscino a 37 °C.
10. Aggiungere 800 μL di tampone a cuscino in un tubo di ultracentrifuga. Pipettare con cautela il lisato con GTP/paclitaxel sopra il tampone del cuscino.
    NOTA: Evitare la miscelazione del cuscino e del lisato pipettando molto delicatamente.
11. Centrifugare per 30 minuti a 100.000 × g a 30 °C in un rotore ultracentrifugo. Segnare il bordo rivolto verso l'esterno del tubo di centrifugazione per riconoscere facilmente dove dovrebbe formarsi il pellet di microtubuli.
12. Rimuovere con cautela il cuscino con cautela utilizzando una pipetta, facendo attenzione a non disturbare il pellet di microtubuli.
    1. Raccogliere un campione del tampone cuscino: 2 μL + 18 μL di acqua + 5 μL di 5x tampone campione SDS.
13. Lavare accuratamente il pellet 3 volte con tampone di lisi caldo per rimuovere il glicerolo. Erogare delicatamente il tampone caldo accanto al pellet (senza sciacquare il liquido direttamente sul pellet), ruotare il tubo alcune volte per rimuovere quanto più glicerolo possibile dal pellet e dalle pareti del tubo, quindi aspirare e ripetere.
    NOTA: Se il glicerolo non viene lavato via correttamente, la griglia si scioglierà molto rapidamente sotto l'illuminazione elettronica. Ciò potrebbe essere evidenziato da un elevato movimento delle particelle, creando immagini sfocate.
14. Preparare il tampone di risospensione con i seguenti ingredienti: 100 mM PIPES/KOH (pH 6,9), 2 mM EGTA/KOH e 1 mM MgCl₂ e riscaldare il tampone a 37 °C.
15. Risospendere delicatamente il pellet lavato con una punta tagliata in ~50 μL di tampone di risospensione preriscaldato e mantenere il tubo a 37 °C.
    1. Raccogliere un campione della frazione di pellet risospesa: 2 μL + 18 μL di acqua + 5 μL di 5x tampone campione SDS.
       SUGGERIMENTO: La punta tagliata impedisce la rottura dei microtubuli. Preparare un blocco riscaldante metallico a 37 °C e conservarlo in una scatola di polistirolo in modo che le provette possano essere trasportate facilmente senza raffreddarle a temperatura ambiente.

4. Preparazione della griglia Cryo-EM

1. Preparare il dispositivo di congelamento a tuffo installando la carta assorbente. Riscaldare il congelatore fino a 30 °C e impostare l'umidificazione al 100%. Lasciare ~ 30 minuti per equilibrare la temperatura e l'umidità.
2. Preparare le impostazioni del congelatore a immersione per due applicazioni ed eseguire l'intero programma una volta per assicurarsi che le impostazioni siano impostate correttamente. Assicurarsi che la prima applicazione abbia una forza di 10, 2 s tempo di macchia e 0 s di attesa e che la seconda applicazione abbia una forza di 10, 6,5 s tempo di blot e 10 s di attesa.
3. Scaricare a bagliore le griglie crio-EM a 30 mA per 60 s.
4. Raffreddare il gruppo contenitore in polistirolo con LN2 e preparare l'etano liquido in una tazza di metallo condensando il gas etano in una tazza di metallo freddo.
5. Preparare un tampone di diluizione con i seguenti componenti: 100 mM PIPES/KOH (PH 6,9), 2 mM EGTA/KOH e 1 mM MgCl₂ e riscaldarlo a 37 °C.
6. Diluire la proteina che interagisce con i microtubuli 1:1 v/v con tampone di diluizione appena prima di applicarla alle griglie per garantire che la concentrazione di sale sia ridotta (abbiamo usato una concentrazione salina finale di 50 mM NaCl). Conservare la miscela a 37 °C.
7. Prendi una griglia a scarica luminosa con pinzette a tuffo e fai clic su di esse nel congelatore.
8. Posizionare il contenitore di polistirolo con etano liquido nel congelatore a tuffo e seguire il programma preparato: prima applicare 3,5 μL di soluzione di microtubuli alla griglia, lasciare che il congelatore a tuffo asciughi la griglia, quindi applicare immediatamente 3,5 μL di proteine appena diluite e, infine, lasciare che lo stantuffo tamponi e congeli la griglia in etano liquido.
9. Trasferire le griglie in una scatola di stoccaggio della griglia e conservarle in un dewar LN2 fino all'imaging.

Abbiamo studiato la tubulina detirosinasi MATCAP legata ai microtubuli tirosinati mediante crio-EM. Per fare ciò, abbiamo estratto microtubuli completamente tirosinati da una linea cellulare HCT116 geneticamente modificata priva di tutti e tre gli enzimi detirosinanti noti, VASH1/2 e MATCAP. Abbiamo usato 6-12 piatti confluenti da 15 cm per estrarre i microtubuli da circa 0,5-4 ml di pellet cellulare (Figura 1). Dopo la seconda fase di centrifugazione (fase 3.11), si ottiene un pellet visibile ma piccolo e trasparente (Figura 1I). La resa dei microtubuli è tipicamente ~ 75 μg. Se il pellet non è visibile, ciò potrebbe indicare un problema in uno dei passaggi precedenti, come una temperatura di polimerizzazione dei microtubuli errata, problemi con la qualità del GTP o del paclitaxel utilizzati o l'aggiunta di troppo tampone di lisi, con conseguente concentrazione di tubulina troppo bassa per la polimerizzazione. Per valutare la qualità e la concentrazione dei microtubuli estratti, abbiamo analizzato campioni su un gel SDS colorato con Coomassie (Figura 2A). Queste analisi hanno indicato che i microtubuli estratti erano relativamente puri. La concentrazione di microtubuli interpolata derivata dalla quantificazione BSA era ~ 1,4 mg / ml. Questo concorda bene con il numero misurato con uno spettrofotometro (Figura 2B,C).

I microtubuli appena estratti possono essere utilizzati direttamente per realizzare campioni per la crio-EM. I microtubuli dovrebbero apparire intatti e abbondanti sulle micrografie. Per ulteriori analisi crio-EM, è fondamentale avere una bassa densità di microtubuli per micrografia per evitare che i microtubuli si incrocino l'uno sull'altro (Figura 3A). I microtubuli rotti o quelli che non sono visibili potrebbero indicare che i microtubuli si sono depolimerizzati (ad esempio, a causa di una bassa temperatura o dell'idrolisi GTP) o che i parametri di congelamento a tamponamento e immersione non sono stati impostati correttamente. Lo sfondo intorno ai microtubuli è denso, presumibilmente con tubulina non polimerizzata.

Il peso molecolare di MATCAP è di 53 kDa, e ha un dominio catalitico globulare appena al di sotto delle dimensioni di un monomero di tubulina. La decorazione di MATCAP sul microtubulo potrebbe, quindi, essere rilevata visivamente. I microtubuli che non legavano MATCAP mostravano bordi "lisci", mentre i microtubuli che legavano MATCAP avevano bordi "ruvidi", caratterizzati da punti densi di elettroni sulla superficie del microtubulo (Figura 3B). I microtubuli legati a MATCAP e MATCAP-non legati potrebbero anche essere distinti nelle classi 2D calcolate, anche se a causa della forma e delle dimensioni, questo potrebbe differire per altre proteine che interagiscono con i microtubuli (Figura 3C). Per confermare che la densità appartiene effettivamente alla proteina di interesse, si possono sfruttare strutture determinate o previste sperimentalmente. Suggeriamo anche di creare una griglia di controllo che contenga microtubuli solo per il confronto. Ciò indica se i microtubuli sono stati polimerizzati ed estratti intatti ad una concentrazione sufficientemente elevata e che il processo di congelamento a tuffo è stato eseguito correttamente. Abbiamo notato che l'abbondanza di microtubuli è diminuita nelle griglie con una seconda applicazione MATCAP.

Figura 1: Guida visiva delle fasi sperimentali. (A) pellet cellulare prima della lisi; b) celle sonicate in una provetta da ultracentrifuga prima della centrifugazione; C) celle sonicate in una provetta ultracentrifuga dopo centrifugazione; D) siringa con il surnatante eliminato; E) pellet residuo dopo l'eliminazione del surnatante compreso uno "strato galleggiante bianco"; (F) punta P10 con un pellet di detriti cellulari per il gel SDS Coomassie; G) surnatante integrato con GTP/paclitaxel prima dell'incubazione; H) surnatante incubato con GTP/paclitaxel sopra un cuscino di glicerolo in una provetta da ultracentrifuga; I) pulire i pellet di microtubuli dopo la seconda fase di centrifugazione. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 2: Purezza dei microtubuli e determinazione della concentrazione . (A) Gel di pagina SDS colorato con Coomassie che mostra i campioni prelevati durante il protocollo di estrazione e un confronto della concentrazione di BSA. S1 e P1 corrispondono rispettivamente al surnatante e al pellet dopo la prima fase di centrifugazione. S2 e P2 corrispondono similmente alla seconda fase di centrifugazione. (B) Una retta di regressione non lineare delle quantità BSA relative derivate da A. L'interpolazione della banda dei microtubuli intorno a 50 kDa nella corsia P2 (microtubuli) indica una concentrazione finale di 1,42 mg/ml. (C) L'analisi spettrofotometrica dei microtubuli risospesi (P2) misurata da due persone e corretta per il coefficiente di estinzione combinato di TUBA1A e TUBB3 (0,971) indica una concentrazione media e di deviazione standard di 1,46 mg/mL ± 0,14 mg/ml. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 3: Micrografie di esempio. (A) Micrografie di esempio che mostrano microtubuli legati a MATCAP. I microtubuli indicati da una scatola verde sono intatti, decorati e possono essere utilizzati per l'analisi crio-EM. Il microtubulo indicato dalla scatola arancione è un microtubulo integro e decorato ma è posizionato vicino ai microtubuli rimasti di esso; pertanto, è meno adatto da includere nell'analisi crio-EM. I microtubuli nella scatola rossa si incrociano e si rompono. Questi dovrebbero essere esclusi dall'analisi crio-EM. (B) Una vista ingrandita del microtubulo verde circondato del pannello di sinistra. Le punte delle frecce rosse indicano i punti neri che apparivano solo sui microtubuli nelle micrografie che avevano un'applicazione di MATCAP e, quindi, probabilmente corrispondono a MATCAP legato al microtubulo. (C) Esempio di classi 2D di particelle di microtubuli prelevate da A che mostravano una decorazione alta e bassa e una classe 2D da un diverso set di dati per il quale non abbiamo osservato alcuna decorazione da parte di MATCAP (pannello più a destra). Barre della scala = (A) 50 nm, (B) 25 nm, (C) 10 nm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 4: Analisi immunoblot di microtubuli derivati da cellule HCT116 con deficit di MATCAP e VASH1/2 carenti di triplo knockout (TKO), cervello suino commerciale e tubulina HeLa. Abbreviazioni: TKO = triplo knockout; mAb = anticorpo monoclonale; pAb = anticorpo policlonale. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.