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Articolo metodologico

Utilizzo della nicotina in un modello murino esposto alla silice per promuovere la transizione epitelio-mesenchimale polmonare

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DOI:

10.3791/65127

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3 marzo 2023

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1Key Laboratory of Industrial Dust Control and Occupational Health of the Ministry of Education, Anhui University of Science and Technology, 2Key Laboratory of Industrial Dust Deep Reduction and Occupational Health and Safety of Anhui Higher Education Institutes, Anhui University of Science and Technology, 3Anhui Province Engineering Laboratory of Occupational Health and Safety, 4School of Medicine, Department of Medical Frontier Experimental Center, Anhui University of Science and Technology

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Questo studio descrive un modello murino per studiare l'effetto sinergico della nicotina sulla progressione della fibrosi polmonare nei topi sperimentali affetti da silicosi. Il modello murino a doppia esposizione simula la progressione patologica nel polmone dopo l'esposizione simultanea a nicotina e silice. I metodi descritti sono semplici e altamente riproducibili.

Abstract

Il fumo e l'esposizione alla silice sono comuni tra i lavoratori e la silice ha maggiori probabilità di danneggiare i polmoni dei fumatori rispetto ai non fumatori. Il ruolo della nicotina, il principale ingrediente che crea dipendenza nelle sigarette, nello sviluppo della silicosi non è chiaro. Il modello murino impiegato in questo studio era semplice e facilmente controllabile, e simulava efficacemente gli effetti dell'ingestione cronica di nicotina e dell'esposizione ripetuta alla silice sulla fibrosi polmonare attraverso la transizione epiteliale-mesenchimale negli esseri umani. Inoltre, questo modello può aiutare nello studio diretto degli effetti della nicotina sulla silicosi, evitando gli effetti di altri componenti nel fumo di sigaretta.

Dopo l'adattamento ambientale, i topi sono stati iniettati per via sottocutanea con 0,25 mg/kg di soluzione di nicotina nella pelle flaccida sopra il collo ogni mattina e sera a intervalli di 12 ore per 40 giorni. Inoltre, la polvere di silice cristallina (1-5 μm) è stata sospesa in soluzione fisiologica normale, diluita in una sospensione di 20 mg/mL e dispersa uniformemente utilizzando un bagno d'acqua ad ultrasuoni. I topi anestetizzati con isoflurano hanno inalato 50 μL di questa sospensione di polvere di silice attraverso il naso e sono stati svegliati tramite massaggio toracico. L'esposizione alla silice è stata somministrata quotidianamente nei giorni 5-19.

Il modello murino a doppia esposizione è stato esposto alla nicotina e poi alla silice, che corrisponde alla storia di esposizione dei lavoratori esposti a entrambi i fattori nocivi. Inoltre, la nicotina ha promosso la fibrosi polmonare attraverso la trasformazione epiteliale-mesenchimale (EMT) nei topi. Questo modello animale può essere utilizzato per studiare gli effetti di molteplici fattori sullo sviluppo della silicosi.

Introduzione

L'esposizione alla silice nei lavoratori è inevitabile in alcuni ambienti di lavoro e, una volta esposti alla silice, il deterioramento progredisce anche dopo la rimozione dall'ambiente. Inoltre, la maggior parte di questi lavoratori fuma e le sigarette tradizionali contengono migliaia di sostanze chimiche, con il componente chiave che crea dipendenza essendo la nicotina1. Le sigarette elettroniche stanno diventando sempre più popolari nelle fasce di età più giovani2; Queste sigarette elettroniche agiscono come un sistema di somministrazione di nicotina e aumentano l'accesso alla nicotina, aumentando così la suscettibilità polmonare e la polmonite3. Il fumo di sigaretta accelera anche la fibrosi polmonare nei topi esposti alla bleomicina4 e aumenta la tossicità polmonare e la fibrosi nei topi esposti alla silice 5,6. Tuttavia, resta da indagare se la nicotina possa influenzare il processo di fibrosi infiammatoria e polmonare causato dalla silice.

Il modello murino di silicosi stabilito dall'inalazione una tantum di un'alta dose di silice nella trachea è traumatico per i topi. Sebbene questo metodo fornisca rapidamente un modello di silicosi, non corrisponde alla realtà di un ambiente in cui i lavoratori sono ripetutamente esposti alla silice. Pertanto, abbiamo stabilito un modello murino esposto alla silice somministrando ripetutamente una bassa dose di sospensioni di silice tramite una flebo nasale; Questa dose può causare infiammazione e fibrosi nei topi.

Per aggirare gli effetti di altri componenti della sigaretta, questo modello murino è stato iniettato per via sottocutanea con nicotina nella pelle flaccida del collo per determinare l'effetto del componente che crea dipendenza, la nicotina, sulla silicosi. Somministrando iniezioni sottocutanee, è possibile ottenere un dosaggio accurato, rendendo così possibile la creazione di modelli di esposizione alla nicotina e l'osservazione delle risposte dose-tossicità, nonché della dipendenza. Un modello di dipendenza da nicotina è stato sviluppato in topi maschi, con una dose iniettata di nicotina di 0,2-0,4 mg/kg 7,8. In quel modello, per soddisfare le esigenze di ricerca di droga dei topi dipendenti, sono state somministrate due iniezioni sottocutanee a intervalli di 12 ore. Questo modello murino di dipendenza da nicotina è utile per simulare le abitudini umane di fumo e l'esposizione alla silice.

I modelli animali a fattore singolo hanno limitazioni negli studi sulle malattie, mentre il metodo qui descritto coinvolge un modello murino a due fattori di co-esposizione a nicotina e silice. Prima dell'esposizione alla silice, i topi sono stati pre-esposti alla nicotina per replicare l'esposizione alla nicotina nelle persone che fumano. Successivamente, l'esposizione alla silice ha avuto luogo dal giorno 5 al giorno 19 per imitare l'esposizione alla silice in un ambiente di lavoro per individui con una storia di fumo.

I macrofagi alveolari sono noti per svolgere un ruolo significativo nella regolazione dell'infiammazione polmonare e della fibrosi. I macrofagi non possono scomporre la silice dopo l'inalazione di silice, portando alla polarizzazione dei macrofagi o all'apoptosi9 e al rilascio di citochine come il fattore di necrosi tumorale-alfa (TNF-α) e il fattore di crescita trasformante beta (TGF-β). I macrofagi M1, che sono identificati dalla presenza del marcatore di superficie CD86, sono i principali istigatori della risposta infiammatoria nella silicosi, mentre i macrofagi M2, che sono marcati da CD206, sono responsabili della fase fibrotica della condizione10. Nei topi a doppia esposizione, la nicotina ha indotto la polarizzazione dei macrofagi verso il fenotipo M2 nei polmoni danneggiati dalla silice, promuovendo così la fibrosi polmonare. Inoltre, il TGF-β1 è fondamentale per l'induzione della fibrosi e dell'EMT11; l'aumento dell'espressione di TGF-β1 ha accelerato la progressione della fibrosi polmonare attraverso l'EMT. Questo modello ha analizzato con successo gli effetti della nicotina sulla silicosi e ha ulteriormente evidenziato l'importanza della cessazione della nicotina.

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Protocollo

Tutte le procedure sono state condotte secondo le linee guida emesse dalla Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio del National Institutes of Health (l'ottava edizione dell'NRC) e sono state approvate dal Comitato etico per gli animali dell'Università di Scienza e Tecnologia di Anhui.

1. Preparazione dell'animale

  1. Ospita 32 topi maschi C57/BL6 di 8 settimane in laboratorio con un ciclo luce/buio di 12 ore. Assicurati che i topi abbiano libero accesso a cibo e acqua.
  2. Dopo 2 settimane di acclimatazione all'ambiente, quando i topi di 10 settimane pesano 23-26 g, utilizzare numeri casuali generati da un computer per raggruppare casualmente gli animali senza partizionamento, ottenendo quattro gruppi di topi: il gruppo di controllo (Con), il gruppo della nicotina (Nic), il gruppo della silice (SiO 2) e la nicotina combinata con il gruppo della silice (Nic + SiO2).

2. Preparazione della nicotina

NOTA: La densità della nicotina è di 1,01 g/mL.

  1. Sciogliere la nicotina in etanolo anidro e diluire 20 volte per preparare una soluzione madre di nicotina di 50 mg/mL.
  2. Diluire la soluzione madre di nicotina 1.000 volte con soluzione fisiologica normale sterile per ottenere una soluzione di lavoro a una concentrazione di 0,05 mg/mL.
    NOTA: Conservare la nicotina al riparo dalla luce. La soluzione madre può essere conservata a 4 °C per un massimo di 1 settimana.

3. Preparazione della silice

  1. Sospendere la silice cristallina sterile in soluzione salina per preparare una sospensione di silice da 20 mg/mL e farla oscillare in un bagno d'acqua ad ultrasuoni per 25 minuti.
  2. Agitare la sospensione di silice con un oscillatore a vortice per 3 minuti prima che i topi ricevano il gocciolamento nasale. Miscelare la sospensione di silice pipettando su e giù 2x-3x con una pipetta da 200 μL, quindi prelevare 50 μL per il gocciolamento nasale.
    NOTA: La sospensione di biossido di silicio deve essere miscelata e somministrata tramite flebo nasale il prima possibile.

4. Cattura del topo ed esposizione alla nicotina

  1. Pesare i topi e registrare i pesi ogni giorno prima dell'esposizione.
  2. Nei giorni 1-40, iniettare per via sottocutanea la nicotina due volte al giorno (a distanza di 12 ore) nei topi dei gruppi Nic e Nic+ SiO2 . Utilizzare una dose di nicotina di 0,25 mg/kg; Ad esempio, assicurati che un topo del peso di 25 g riceva 6,25 μg di nicotina. Per questo topo, il volume di iniezione sarebbe il seguente: 6,25/0,05 = 125 μL. Contemporaneamente, iniettare nei topi del gruppo Con un volume uguale di soluzione fisiologica.
  3. Preparare le siringhe da 1 mL necessarie per ciascun gruppo e utilizzarle per aspirare il volume di iniezione di nicotina o soluzione fisiologica. Prima di prelevare la nicotina, aspirare prima 0,1-0,2 mL di aria nella siringa, quindi aspirare 125 μL di nicotina. Picchiettare con cautela la siringa per riempire l'ago e l'estremità anteriore della siringa con la nicotina. Collocare la siringa contenente nicotina in un vassoio al riparo dalla luce.
    NOTA: Al momento dell'iniezione, 0,1-0,2 mL di aria si trovano dietro la nicotina, garantendo che tutto il liquido venga somministrato con successo al topo.
  4. Afferra la coda del topo con la mano destra e, quando l'animale si rilassa, usa il pollice e l'indice sinistro per premere la pelle sulla parte posteriore del collo dalla coda alla testa fino al bordo dell'orecchio, applicando una pressione moderata. Dopodiché, rilascia la mano destra e usa il pollice e l'anulare sinistro per pizzicare la coda e gli arti posteriori, a quel punto il mouse sarà completamente immobilizzato dalla mano sinistra.
    NOTA: Afferrare il mouse con la forza appropriata. Una forza insufficiente rende facile per i topi mordere, mentre una forza eccessiva può provocare l'asfissia dei topi.
  5. Usando la mano destra per iniettare, perforare la pelle sulla parte posteriore del collo vicino al bordo dell'orecchio dei topi in direzione testa-coda con la siringa e iniettare nicotina a una velocità uniforme. Cerca un rigonfiamento cutaneo semicircolare che indichi che l'iniezione è andata a buon fine.
    NOTA: Quando l'ago ha perforato la pelle, ci sarà una sensazione di resistenza; La resistenza scompare dopo l'inserimento dell'ago. A questo punto, l'ago deve essere leggermente ritirato per iniettare lentamente e in modo uniforme.

5. Esposizione alla silice in vivo

  1. Nei giorni 5-19, instillare la sospensione di biossido di silicio nella cavità nasale dei topi nei gruppi SiO 2 e Nic+ SiO2. Anestetizzare rapidamente ogni topo con isoflurano al 2% in una macchina per anestesia alla dose di 3,6 ml/h. Dopo l'anestesia, posizionare il topo sul palmo di una mano ed esporre la cavità nasale del topo. Instillare 50 μL di sospensione di silice nella cavità nasale entro 4-8 s.
  2. Per consentire alla sospensione di silice di entrare nei polmoni il prima possibile, dopo l'instillazione, premere delicatamente il cuore del topo con il dito indice per 3-5 secondi, 3x-5x al secondo, per favorire la sua frequenza respiratoria.
  3. Dopo che la respirazione del topo diventa gradualmente uniforme, metti il topo in una gabbia per osservare per 3 minuti.
  4. Per tutti i topi che ricevono la sospensione di silice, ripetere i passaggi 1-3. Nel gruppo di controllo, instillare 50 μL di soluzione fisiologica sterile nella cavità nasale nei giorni 5-19.

6. Acquisizione di tessuti polmonari freschi e fissati

  1. Il giorno 41, utilizzare 50 mg/kg di pentobarbital di sodio per anestetizzare i topi per via intraperitoneale alla dose di 0,1 ml/20 g in base al loro peso corporeo. Fissare gli arti su una piastra di prova in schiuma e spruzzare la pelliccia con alcol al 75%.
  2. Eseguire la perfusione cardiaca per ottenere tessuto polmonare fresco, tagliare la linea mediana dell'addome per esporre la cavità toracica e praticare una piccola apertura all'apice del cuore destro. Quindi, iniettare 20 ml di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) preraffreddata lentamente e uniformemente dall'apice del cuore sinistro, facendo defluire il sangue dall'apertura creata all'apice del cuore destro. Estrarre l'intero lobo polmonare, metterlo in una provetta da centrifuga da 1,5 mL preraffreddata e trasferirlo a -80 °C per la conservazione in attesa dell'estrazione delle proteine.
  3. Perfondere altri topi con 20 mL di PBS pre-raffreddato seguiti da 10 mL di paraformaldeide al 4% nella stessa posizione per fissare i polmoni interi; conservare ogni polmone in 30 mL di PFA al 4%.
  4. Dopo 72 ore, incorporare i tessuti polmonari fissati in paraffina.
    1. Immergere il tessuto polmonare nel fissativo preparato in un bagno d'acqua ad ultrasuoni a 40 °C per 30 minuti, seguito da un processo di disidratazione in etanolo al 75%, etanolo al 95% ed etanolo anidro per 50 minuti ciascuno.
    2. Lavare 2 volte con xilene per 50 minuti ciascuna.
    3. Porre il tessuto in cera di paraffina fusa a 55-60 °C per 2-3 ore in modo che lo xilene nel tessuto polmonare venga gradualmente sostituito dalla cera di paraffina.
    4. Fissare il tessuto polmonare nel telaio di inclusione con paraffina e attendere che il blocco di cera si indurisca. Dopo che il blocco di cera si è indurito, utilizzare la macchina per il sezionamento della paraffina per affettare il polmone a 4-5 μm.
  5. Immergere le sezioni polmonari in acqua ultrapura a 45 °C. Una volta che la paraffina si è sciolta, caricare la sezione polmonare su un vetrino da microscopio aderente.

7. Colorazione con ematossilina ed eosina (HE)

  1. Cuocere i vetrini a 60 °C per 2 ore e metterli in xilene a decerare per 2 x 30 minuti. Successivamente, posizionare i vetrini in etanolo anidro, etanolo al 95%, etanolo all'85% ed etanolo al 75% per 5 minuti ciascuno. Infine, lavali per 3 x 5 minuti con acqua ultrapura.
  2. Far cadere 50 μL di soluzione colorante con ematossilina sul tessuto polmonare con una pistola a pipetta e colorare per 5 minuti; Quindi, lavate le fette con acqua corrente per 5 minuti.
  3. Aggiungere 50 μL di acido cloridrico al 2% in etanolo sulla sezione e risciacquare con acqua distillata per 30 secondi. Quindi, aggiungere 50 μL di soluzione colorante con eosina sul tessuto polmonare da colorare per 1 minuto.
  4. Disidratare, rendere trasparenti e sigillare le sezioni di paraffina.
    1. Aggiungere 100-150 ml di etanolo al 75%, etanolo all'85%, etanolo al 95%, etanolo anidro e xilene in un serbatoio di tintura di plastica combinato. Mettere i vetrini in etanolo anidro al 75%, 85%, 95% ed etanolo anidro per 5 minuti ciascuno per disidratare.
    2. Quindi, posizionare i vetrini in xilene per 5 minuti per renderli trasparenti.
    3. Infine, far cadere 20 μL di gomma neutra sulla sezione polmonare e posizionare un vetrino coprioggetto sul vetrino per sigillarlo.
      NOTA: I passaggi precedenti vengono eseguiti a temperatura ambiente.

8. Colorazione di Masson

  1. Decerare, idratare e lavare le sezioni di paraffina come descritto al punto 7.1.
  2. Colorare le sezioni con 50 μL di soluzione di colorazione con ematossilina Weigert configurata per 7 minuti, quindi con 50 μL di soluzione acida di frazionamento dell'etanolo per 10 secondi e lavare con acqua corrente per far diventare blu i nuclei.
  3. Colorare le sezioni con 50 μL di soluzione tricromica Masson per 4 minuti e lavare con acqua.
  4. Sciacquare le sezioni con acqua distillata per 1 minuto, quindi colorare con Lichun rosso acido magenta per 7 minuti.
  5. Lavare le sezioni con una soluzione di lavoro acida debole (acido cloridrico al 30%) per 1-2 minuti, una soluzione di acido fosfomolibdico per 1-2 minuti e una soluzione di lavoro acida debole per 1-2 minuti.
  6. Colorare le sezioni con una soluzione colorante blu anilina per 2 minuti, quindi lavare con una soluzione di lavoro acida debole per 1 minuto.
  7. Disidratare le sezioni con etanolo al 95% seguito da etanolo anidro per 1 s, trasparente con xilene per 1 s e infine sigillare con resina neutra come descritto al punto 7.4.

9. Immunoistochimica

  1. Infornare le fette a 60 °C per 6 ore. Decerare, idratare e lavare le sezioni di paraffina come descritto al punto 7.1.
  2. Recupero dell'antigene: mettere le fette in una scatola di plastica resistente al calore contenente una soluzione di recupero dell'antigene citrato sufficiente per immergere le fette e far bollire per 20-30 minuti.
  3. Raffreddare a temperatura ambiente, rimuovere le sezioni e risciacquare con acqua deionizzata. Successivamente, immergere per 2 x 5 minuti in PBS contenente lo 0,5% di Tween-20 (PBST).
  4. Disegna un anello vicino alla sezione polmonare sul vetrino con una penna idrofobica per formare un cerchio idrofobico.
  5. Aggiungere 50 μL di soluzione di perossido di idrogeno al 3% (3%H 2 O2 ) goccia a goccia sulle fette e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente al riparo dalla luce per l'inattivazione della perossidasi endogena.
  6. Immergere le fette nel PBST per 3 x 5 min.
  7. Aggiungere 50 μL di proteine sieriche bovine al 5% (BSA)-PBST goccia a goccia sulle fette e bloccare per 1 ora a temperatura ambiente.
  8. Scartare la soluzione bloccante, aggiungere 50 μL degli anticorpi primari diluiti CD206 (diluizione: 1:1.500), TGF-β1 (diluizione: 1:200) e vimentina (diluizione: 1:2.000) goccia a goccia sulle fette e incubare per una notte a 4 °C.
    NOTA: In questo lavoro, tutti gli anticorpi sono stati diluiti in BSA al 5%.
  9. Il giorno dopo, rimettere le fette a temperatura ambiente (40 min). Lavare le fette come descritto al punto 9.6.
  10. Diluire l'anticorpo secondario in BSA al 5%. Aggiungere 50 μL di anticorpo secondario marcato con perossidasi di rafano (diluizione: 1:500) goccia a goccia e incubare per 1 ora a temperatura ambiente. Lavare le fette come descritto al punto 9.6.
  11. Versare 50 μL di soluzione di 3,3'-diaminobenzidina (DAB) corrispondente all'anticorpo secondario marcato con enzima sul tessuto polmonare e incubare per 5-10 minuti in una scatola umida immunoistochimica nera. Osservare al microscopio fino a quando il colore non si sviluppa in un marrone intenso. Sciacquare le fette con acqua distillata per terminare la reazione.
    NOTA: La colorazione marrone è considerata una colorazione positiva.
  12. Colorare con 50 μL di colorante di ematossilina per 30 secondi e lavare con acqua corrente. Quindi, immergere le fette al 75%, 85%, 95% ed etanolo anidro per 3 minuti ciascuna e poi nello xilene per 2 x 10 minuti. Sigillare i vetrini come descritto al punto 7.4.

10. Analisi Western blot

  1. Estrarre il tessuto polmonare dal congelatore e pesarlo. Successivamente, aggiungere 150 μL di tampone di lisi RIPA contenente PMSF per 20 mg di tessuto polmonare. Lisare i polmoni di topo su ghiaccio per 3-5 minuti utilizzando un omogeneizzatore portatile, agitare delicatamente per 2 ore a 4 °C per consentire un'adeguata lisi del tessuto polmonare, centrifugare a 4 °C e 14.800 × g per 15 minuti e raccogliere il surnatante.
    NOTA: Aggiungere 100 mM di fenilmetansolfonilfluoruro (PMSF) alcuni minuti prima di utilizzare il tampone di lisi RIPA. La concentrazione finale di PMSF è di 1 mM (ad esempio, 10 μL di PMSF + 990 μL di RIPA).
  2. Utilizzare un kit di concentrazione proteica BCA per determinare la concentrazione proteica del campione seguendo le istruzioni del produttore. Dopo la determinazione, utilizzando la più piccola concentrazione di lisato proteico come base, diluire lo stesso lotto di lisato proteico con RIPA alla concentrazione più piccola per ottenere la stessa massa e volume.
    NOTA: La quantità totale di carico di tessuto polmonare è di 30 μg.
  3. Aggiungere 40 μL di tampone di caricamento 5x a 160 μL di lisato proteico e riscaldarlo a 100 °C per 10 min.
  4. Assemblare il gel preparato per elettroforesi su gel di poliacrilammide di sodio dodecilsolfato al 10% (SDS-PAGE) nel sistema di elettroforesi western blotting, aggiungere il tampone per elettroforesi SDS-PAGE, estrarre delicatamente il pettine per elettroforesi e aggiungere 20 μL di campione proteico per pozzetto lentamente e uniformemente. Accendere l'alimentazione e avviare l'elettroforesi a 80 V per 30 min. Dopo che le proteine hanno raggiunto lo strato inferiore del gel, passare a 100 V e continuare l'elettroforesi per 60-70 minuti.
    NOTA: L'elettroforesi necessita di un nuovo tampone per elettroforesi.
  5. Trasferire le proteine su una membrana in PVDF mediante trasferimento a umido. Attivare preventivamente (5-30 s) la membrana in PVDF con metanolo. Estrarre la piastra in gel per elettroforesi, aprirla con cautela, posizionare il gel separatore nel tampone di trasferimento a umido, preparare il sandwich di trasferimento elettrico e assemblare il sistema di trasferimento a umido. Riempire il serbatoio di elettroforesi con il tampone di trasferimento e trasferire a 400 mA per 90 min.
    NOTA: Il tampone di trasferimento viene raffreddato in anticipo per evitare gli effetti delle alte temperature durante il trasferimento a umido.
  6. Lavare la membrana in PVDF con soluzione salina tamponata Tris con Tween-20 allo 0,5% (TBST) per 3 x 5 minuti. Bloccare la membrana in PVDF con latte scremato al 5% diluito in TBST e incubare su agitatore a temperatura ambiente per 60 min; quindi, lavare con TBST per 2 min. Dopo il lavaggio, incubare la membrana per una notte a 4 °C con l'anticorpo primario vimentina (1:5.000) e GAPDH (1:10.000) diluiti in BSA al 5%.
  7. Posizionare la membrana a temperatura ambiente per 30 minuti e lavare con TBST per 5 x 5 minuti. Dopo il lavaggio, incubare la membrana con l'anticorpo secondario (1:10.000) diluito in latte scremato al 5% per 60 minuti a temperatura ambiente.
  8. Posizionare la membrana, con il lato proteico rivolto verso l'alto, far cadere la soluzione di lavoro ECL preparata, incubare per 1-2 minuti e osservare i risultati con un gel imager. Utilizzare i valori della scala di grigi misurati dal software nell'imager su gel per valutare i livelli di espressione proteica.
    NOTA: In questo caso, GAPDH è servito come riferimento interno.

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Risultati

È stato stabilito un modello murino per studiare la nicotina combinata con l'esposizione alla silice per studiare il potenziale ruolo della nicotina nella progressione della silicosi nei topi. La Figura 1 illustra la procedura sperimentale per l'utilizzo di un modello murino a doppia esposizione, che ha abbinato un'iniezione di nicotina con l'instillazione nasale di una sospensione di silice. I cambiamenti patologici dei topi in ciascun gruppo sono stati osservati utilizzando la colorazione ...

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Discussione

Un modello animale a doppia esposizione è necessario per studiare il ruolo e i potenziali meccanismi dell'esposizione concomitante alla nicotina e al biossido di silicio cristallino. Questo modello è stato realizzato in questo lavoro attraverso l'iniezione sottocutanea di nicotina e il gocciolamento nasale di silice. Per garantire il successo dell'iniezione di nicotina, l'operatore deve acquisire familiarità con la presa dei topi, poiché afferrare la pelle nella parte posteriore del collo potrebbe essere doloroso per lor...

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Dichiarazioni

Tutti gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.

Ringraziamenti

Questo studio è stato sostenuto dal programma di innovazione della sinergia universitaria della provincia di Anhui (GXXT-2021-077) e dal Fondo per l'innovazione dei laureati dell'Università di scienza e tecnologia dell'Anhui (2021CX2120).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
10% fissativo neutro in formalinaNanchang Yulu Experimental Equipment Co.
disinfettante a base di alcolXintai Kanyuan Disinfection Products Co.
BSA, frazione VBeyotime BiotechnologyST023-200g
CD206 anticorpo monoclonaleProteintech60143-1-IG
citrato soluzione di recupero dell'antigenebiosharp life scienceBL619A
dimetil benzeneAsia Chemical Technology (Shandong) Co
Enhanced BCA Protein Assay KitBeyotime BiotechnologyP0009
GAPDH Anticorpo policlonaleProteintech10494-1-AP
Ematossilina ed eosina (H& E)Beyotime BiotechnologyC0105S
Substrato HRPMillipore CorporationP90720
HRP-coniugato Capra Affinipure Anti-Topo IgG(H+L)ProteintechSA00001-1
HRP-coniugato Capra Anti-coniglio IgG(H+L)ProteintechSA00001-2
ImmPACT[R] DAB EqV Perossidasi (HRP)Substrato VettoriSK-4103-100
Kit per macchie tricromatiche di MassonSolarbioG1340
MetanoloMacklin
NicotinaSigmaN-3876
soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) BiosharpBL601A
Soluzione fisiologica Il primo ospedale del popolo della città
PMSFBeyotime BiotechnologicalST505
Microscopio a fluorescenza positivoOlympusCorporationBX53 + DP74
Peso molecolare della proteina del colore prestato  Marker, o scala delle proteine del colore prestainedBeyotime BiotechnologyP0071
Membrane PVDFMillipore3010040001
tampone di lisi RIPABeyotime BiotechnologyP0013B
Kit di preparazione del gel SDS-PAGEBeyotime BiotechnologyP0012A
Biossido di silicioSigma#BCBV6865
TGF- βBiossbs-0086R
Vimentin Anticorpo policlonaleProteintech10366-1-AP
strong>Nome del materialeAziendaNumero
Tubo da 0,5 mLBiosharpBS-05-M
Bagno termostatico oscillatorio in metalloAbson
Macchinaper l'inclusione di paraffinaPrecisione (Changzhou) Medical Equipment Co.PBM-A
Affettatrice a paraffinaJinhua Kratai Instruments Co.
PipetteEppendorf
Microscopio a luce polarizzataOlympusBX51
Bilancia di precisioneAcculabALC-110.4
RODI IOT sistema di purificazione dell'acqua multifunzionale intelligenteRSJRODI-220BN
Scilogex SK-D1807-E Agitatore 3DScilogex
Small macchina per anestesia animaleAnhui Yaokun Biotech Co., Ltd.ZL-04A
Puntali per pipette universaliKIRGENKG1011
Puntali per pipette universaliKIRGENKG1212
Puntali per pipette universaliKIRGENKG1313
Vortex  Miscelatori VWR
Nome del materiale/ Attrezzatura
Adobe Illustrator
ImageJ
Photoshop
Prism7.0
West di Huainan<di catalogo

Riferimenti

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