Questo studio descrive un protocollo ottimizzato per stabilire fibroblasti primari da tessuti cheloidi in grado di fornire in modo efficace e costante fibroblasti puri e vitali.
Articolo metodologico
Questo studio descrive un protocollo ottimizzato per stabilire fibroblasti primari da tessuti cheloidi in grado di fornire in modo efficace e costante fibroblasti puri e vitali.
I fibroblasti, il principale tipo di cellula nel tessuto cheloide, svolgono un ruolo essenziale nella formazione e nello sviluppo dei cheloidi. L'isolamento e la coltura di fibroblasti primari derivati dal tessuto cheloide sono la base per ulteriori studi sulla funzione biologica e sui meccanismi molecolari dei cheloidi, nonché nuove strategie terapeutiche per il loro trattamento. Il metodo tradizionale per ottenere fibroblasti primari ha dei limiti, come il cattivo stato cellulare, la miscelazione con altri tipi di cellule e la suscettibilità alla contaminazione. Questo documento descrive un protocollo ottimizzato e facilmente riproducibile che potrebbe ridurre l'insorgenza di possibili problemi quando si ottengono fibroblasti. In questo protocollo, i fibroblasti possono essere osservati 5 giorni dopo l'isolamento e raggiungere quasi l'80% di confluenza dopo 10 giorni di coltura. Quindi, i fibroblasti vengono fatti passare e verificati utilizzando anticorpi PDGFRα e vimentina per saggi di immunofluorescenza e anticorpi CD90 per citometria a flusso. In conclusione, i fibroblasti dal tessuto cheloide possono essere facilmente acquisiti attraverso questo protocollo, che può fornire una fonte abbondante e stabile di cellule in laboratorio per la ricerca sui cheloidi.
Il cheloide, una malattia fibroproliferativa, si manifesta come la crescita continua di placche che spesso invadono la pelle normale circostante senza autolimitazione e causano vari gradi di prurito, dolore e oneri estetici e psicologici per i pazienti1. I fibroblasti, le cellule primarie coinvolte nei cheloidi, svolgono un ruolo essenziale nella formazione e nello sviluppo di questa malattia attraverso un'eccessiva proliferazione, la produzione ridondante di matrice extracellulare e collageni disorganizzati 2,3. Tuttavia, la patogenesi sottostante rimane poco chiara e manca ancora un m....
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Questo studio è stato approvato dal comitato di revisione istituzionale del Dermatology Hospital, Southern Medical University (2020081). Il consenso informato del paziente è stato ottenuto prima che i tessuti fossero raccolti dagli individui.
1. Preparazione
NOTA: Le seguenti procedure devono essere eseguite in ambiente sterile sotto un armadio di sicurezza biologica.
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La sequenza temporale del protocollo è riassunta nella Figura 1A. Alcune immagini rappresentative del processo di isolamento sono mostrate nella Figura 2; l'epidermide e gli strati adiposi sono stati accuratamente rimossi e lo strato del derma è stato separato in piccoli frammenti di 3-4 mm2, che sono stati inoculati nelle piastre di Petri.
Come mostrato nella Figura 3A, diverse escrescenze.......
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Ottenere fibroblasti primari dai tessuti cheloidi è una base fondamentale per ulteriori ricerche. Fino ad ora, ci sono stati due metodi per acquisire fibroblasti primari: digestione enzimatica e coltura di espianti11,12,13,14. Tuttavia, entrambi i metodi tradizionali hanno limiti, come la suscettibilità alla contaminazione, la miscelazione con altri tipi di cellule, un lungo periodo di coltura .......
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Non ci sono conflitti di interesse da dichiarare.
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni della National Natural Science Foundation of China (numero di sovvenzioni 81903189 e 82073418) e della Science and Technology Foundation di Guangzhou (numero di sovvenzione 202102020025).
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| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Provetta da centrifuga sterile da 1,5 mL | JETBIOFIL | CFT002015 | |
| Provetta da centrifuga sterile da 15 mL | JETBIOFIL | 8076 | |
| 4% di poliformaldeide | Beyotime Biotechnology | P0099 | Fissazione cellulare |
| 50 mL provetta da centrifuga sterile | JETBIOFIL | 8081 | Metti tessuto cheloide |
| Alexa Fluor-555 capra anti-coniglio IgG | Abcam | Alexa Fluor 555 | Secondo anticorpo per il saggio di colorazione in immunofluorescenza |
| Anti umano CD90 | BioLegend | B301002 | Identifica la purezza dei fibroblasti |
| Diluente anticorpale | Beyotime Biotechnology | P0262 | |
| Armadio di sicurezza biologica | Thermo Scientific | 1300 serie A2 | Cellule di isolamento e coltura |
| Albumina sierica bovina | aladdina | B265993 | Blocco per il test di colorazione in immunofluorescenza |
| Incubatore ad anidride carbonica | ESCO | CCL-170B-8 | Utilizzo per la coltura di cellule |
| Criotubi cellulari | Corning | 43513 | Conservare le cellule in |
| una macchina centrifuga | Thermo Fisher | ST 16R | Scartare il surnatante |
| DAPI | Beyotime Biotechnology | C1006 | Colorare il nucleo cellulare |
| DMSO | MP Biomedicals | 196055 | Utilizzo per la conservazione delle cellule |
| Terreno di aquila modificato di Dulbco | Gibco | C11995500BT | Soluzione di terreno di coltura |
| Siero fetale bovino | BI | 04-001-1A | |
| Citometro a flusso | BD | BD FACSCelesta | Osservazione l'identità delle cellule |
| congelate scatola | Thermo Scientific | 5100-0050 | |
| Microscopio invertito | Nikon | ECLIPSE Ts2 | |
| Microscopio confocale laser | Nikon | AIR-HD25 | Osservazione del saggio di colorazione in immunofluorescenza |
| PDGFR-&alfa; anticorpo | CST | 3174T | Primo anticorpo per il saggio di colorazione in immunofluorescenza |
| Soluzione di penicillina-streptomicina-Am | Solarbio | P1410 | Aggiungere la soluzione del terreno di coltura per evitare la contaminazione |
| Piastra di Petri | JETBIOFIL | 7556 | Fibroblasti di coltura |
| Soluzione salina tamponata con fosfato | Gibco | C10010500BT | Soluzione del terreno di coltura |
| Coniglio (DAIE) mAB IgG XR (R) Controllo dell'isotuge (PE) | Tecnologia di segnalazione cellulare | 5742S | Come controllo per la citometria a flusso |
| Vetrino coprioggetto rotondo | Biosharp | 801007 | Coltura cellulare |
| Triton X 100 | Solarbio | T8200 | Fori nella membrana cellulare |
| Tripsina-EDTA | Gibco | 25200072 | Utilizzato per il passaggio delle cellule |
| Anticorpo Vimentina | Abcam | ab8978 | Primo anticorpo per il saggio di colorazione in immunofluorescenza |
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