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Articolo metodologico

Caratterizzazione comportamentale di un modello murino con sindrome di Angelman

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DOI:

10.3791/65182

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20 ottobre 2023

 ,  , 
1Czech Centre for Phenogenomics, Institute of Molecular Genetics of the Czech Academy of Sciences, 2Laboratory of Transgenic Models of Diseases, Institute of Molecular Genetics of the Czech Academy of Sciences

In questo articolo

Sommario

Questo manoscritto presenta una serie di test comportamentali altamente riproducibili per convalidare un modello murino con sindrome di Angelman.

Abstract

Questo manoscritto descrive una batteria di test comportamentali disponibili per caratterizzare i fenotipi simili alla sindrome di Angelman (AS) in un modello murino consolidato di AS. Utilizziamo il paradigma di apprendimento rotarod, l'analisi dettagliata dell'andatura e il test di costruzione del nido per rilevare e caratterizzare le disabilità motorie degli animali. Testiamo l'emotività animale in campo aperto e nei test a labirinto sopraelevati, nonché l'affetto nel test di sospensione della coda. Quando i topi AS vengono testati nel test in campo aperto, i risultati devono essere interpretati con cautela, poiché le disfunzioni motorie influenzano il comportamento del topo nel labirinto e alterano i punteggi di attività.

La riproducibilità e l'efficacia dei test comportamentali presentati è già stata convalidata in diverse linee murine Uba3a indipendenti con diverse varianti di knockout, stabilendo questa serie di test come un eccellente strumento di validazione nella ricerca sulla SA. I modelli con il costrutto e la validità del volto pertinenti giustificheranno ulteriori indagini per chiarire la fisiopatologia della malattia e garantire lo sviluppo di trattamenti causali.

Introduzione

La sindrome di Angelman (AS) è una rara malattia del neurosviluppo. L'origine genetica più comune della SA è una grande delezione della regione 15q11-q13 del cromosoma di origine materna, che si trova in quasi il 74% dei pazienti1. La delezione di questa regione provoca la perdita di UBE3A, il principale gene causativo della SA che codifica per l'ubiquitina ligasi E3. L'allele paterno del gene UBE3A nei neuroni viene silenziato in un processo noto come imprinting. Di conseguenza, l'imprinting paterno del gene consente solo l'espressione materna nel sistema nervoso centrale (SNC)2. Pertanto, la delezione del gene UBE3A dal cromosoma di origine materna porta allo sviluppo dei sintomi della SA. Nell'uomo, la SA si manifesta intorno ai 6 mesi di età, con ritardo dello sviluppo che persiste in tutte le fasi dello sviluppo e provoca gravi sintomi debilitanti nei soggetti affetti 3,4. I sintomi principali del disturbo includono il deficit delle capacità motorie fini e grossolane, tra cui andatura atassica a scatti, grave compromissione del linguaggio e disabilità intellettiva. Circa l'80% dei pazienti con SA soffre anche di disturbi del sonno ed epilessia. Ad oggi, l'unico trattamento disponibile sono i farmaci sintomatici, che riducono le crisi epilettiche e migliorano la qualità del sonno1. Pertanto, lo sviluppo di modelli animali robusti con fenotipi comportamentali riproducibili insieme a una raffinata analisi della fenotipizzazione sarà essenziale per chiarire i meccanismi fisiopatologici del disturbo e scoprire farmaci e trattamenti efficaci.

La complessità del disturbo umano che colpisce il sistema nervoso centrale richiede che gli organismi modello possiedano un genoma, una fisiologia e un comportamento comparabili. I topi sono popolari come organismi modello a causa del loro breve ciclo riproduttivo, delle piccole dimensioni e della relativa facilità di modifica del DNA. Nel 1984, Paul Willner ha proposto tre criteri di base per la validazione del modello di malattia: il costrutto, il volto e la validità predittiva, che vengono utilizzati per determinare il valore del modello5. Semplicemente, la validità del costrutto riflette i meccanismi biologici responsabili dello sviluppo del disturbo, la validità del volto ne ricapitola i sintomi e la validità predittiva descrive la risposta del modello ai farmaci terapeutici.

Per aderire ai principi di cui sopra, abbiamo scelto l'eziologia genetica più comune, una grande delezione del locus materno 15q11.2-13q che include il gene UBE3A, per creare topi modello AS. Abbiamo usato la tecnica CRISPR/Cas9 per eliminare una regione lunga 76.225 bp che copre l'intero gene UBE3A, comprendendo sia gli elementi codificanti che quelli non codificanti del gene, nei topi provenienti da un background C57BL/6N6. Abbiamo quindi allevato gli animali per ottenere topi eterozigoti UBE3A+/−. Per la validazione facciale del modello, abbiamo utilizzato animali provenienti da incroci di femmine UBE3A+/− e maschi wild-type per ottenere la progenie UBE3A+/- (ceppo denominato C57BL/6NCrl-UBE3A/Ph e successivamente assegnato come UBE3A mGenedel/+) e compagni di cucciolata di controllo. Abbiamo testato le loro capacità motorie fini e grossolane, l'emotività e l'affetto per ricapitolare i sintomi principali dell'AS. In un precedente articolo, abbiamo anche valutato le funzioni cognitive degli animali, poiché i pazienti con AS soffrono anche di disabilità intellettiva6. Tuttavia, non abbiamo riscontrato disturbi cognitivi nei topiUBE3A mGenedel/+, forse a causa della giovane età degli animali al momento del test7. L'esame successivo degli animali più anziani, di circa 18 settimane, ha rivelato un deficit nella flessibilità comportamentale durante l'apprendimento inverso nel paradigma della preferenza di luogo. Tuttavia, la complessità delle apparecchiature impiegate per questa analisi richiede un modulo metodologico separato e non è incluso in questa sede.

I test comportamentali qui presentati appartengono agli strumenti di fenotipizzazione più comuni nella ricerca genetica, grazie al loro elevato valore predittivo e alla sufficiente validità del costrutto 8,9,10. Abbiamo utilizzato questi test per convalidare un modello murino di SA ricapitolando i sintomi principali della malattia umana in modo riproducibile e indipendente dall'età. L'emotività dell'animale è stata valutata nei test di labirinto elevato e campo aperto. Entrambi questi test si basano sul conflitto approccio-evitamento, in cui gli animali esplorano un nuovo ambiente in cerca di cibo, riparo o opportunità di accoppiamento, evitando contemporaneamente i compartimenti ansiogeni11. Inoltre, il test in campo aperto viene utilizzato per testare l'attività locomotoria di un topo8. Il test della sospensione della coda è ampiamente utilizzato nella ricerca sulla depressione per lo screening di nuovi farmaci antidepressivi o fenotipi simili alla depressione in modelli murini knockout12. Questo test valuta la disperazione che gli animali sviluppano nel tempo in una situazione ineluttabile. L'apprendimento motorio e le caratteristiche dettagliate dell'andatura sono state determinate rispettivamente sul rotarod e nel DigiGait. La resistenza dell'animale sull'asta accelerante caratterizza le sue capacità di equilibrio e coordinazione del movimento, mentre l'analisi dettagliata dei modelli di passo di un topo è una valutazione sensibile delle menomazioni neuromuscolari connesse a molti disturbi neurogenerativi del movimento13,14,15. Il test di triturazione del nido fa parte della metodologia standard per rilevare il comportamento impulsivo nei roditori e, poiché utilizza il comportamento naturale della costruzione dei roditori, indica il benessere dell'animale16,17.

La dimensione dei gruppi sperimentali è stata il risultato di un compromesso per soddisfare le esigenze della regola 3R e l'uso efficiente delle prestazioni di allevamento delle colonie. Tuttavia, per ottenere potere statistico, i gruppi avevano non meno di 10 individui, a causa della creazione di un numero sufficiente di coppie nidificanti. Purtroppo, le prestazioni riproduttive non sempre hanno portato a un numero sufficiente di animali.

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Protocollo

Tutti gli animali e gli esperimenti utilizzati in questo studio sono stati sottoposti a revisione etica e sono stati condotti in conformità con la Direttiva Europea 2010/63/UE. Lo studio è stato approvato dalla Commissione centrale ceca per il benessere degli animali. I topi sono stati alloggiati in gabbie ventilate singolarmente e mantenuti a una temperatura costante di 22 ± 2 °C con un ciclo luce/buio di 12 ore. Ai topi è stato fornito cibo per topi e acqua ad libitum. I topi sono stati alloggiati in gruppi da tre a sei animali per gabbia. Prima del test non è stata eseguita alcuna manipolazione diversa dalla pesatura. Vedere la Tabella dei materiali per i dettagli relativi a tutti i materiali e le attrezzature utilizzate in questo protocollo.

1. Considerazioni generali prima e durante la prova

NOTA: Per motivi di chiarezza e comprensibilità, prima della descrizione delle singole prove vengono presentate osservazioni di carattere generale. Questo vale per ogni prova, con l'ovvia eccezione della prova di triturazione del nido, che viene effettuata in un locale di stabulazione e non richiede l'uso di alcuna attrezzatura sperimentale.

  1. Ospitare gli animali nella struttura di ricerca per almeno 14 giorni prima dei test per ridurre al minimo lo stress derivante dal trasporto e dai cambiamenti ambientali.
  2. Registrare il peso degli animali prima del test, poiché il peso è un fattore di confusione comune nella ricerca comportamentale.
  3. Lasciare gli animali acclimatati nella stanza sperimentale per almeno 1 ora dopo il trasporto dalla sala di stabulazione per ridurre al minimo lo stress da trasporto, ogniqualvolta tale trasporto abbia luogo (vale a dire, tutte le prove descritte di seguito, ad eccezione della triturazione dei nidi, che viene eseguita nella stanza di stabulazione).
  4. Etichettare ogni animale sulla coda con un pennarello non tossico a base d'acqua per consentire una rapida identificazione durante l'esperimento.
  5. Rimuovere tutte le urine e le feci depositate dagli animali nell'apparecchio sperimentale durante le prove dopo ogni prova.
  6. Pulire tutti gli apparecchi sperimentali con alcol al 75% prima e dopo ogni animale testato. La pulitura rimuove le tracce olfattive depositate durante i test e aiuta a mantenere stabili le condizioni sperimentali.
  7. Trasportare gli animali dalla gabbia di casa all'apparato sperimentale con la massima cura possibile, preferibilmente in un piccolo contenitore opaco, e poi rilasciarli liberamente a meno che non siano necessarie altre manipolazioni.
  8. Metti ogni animale in una gabbia temporanea dopo il test per evitare che influenzino gli animali non testati nella gabbia domestica.
  9. Testare maschi e femmine in giorni consecutivi. Alternare l'ordine dei diversi genotipi durante i test per controbilanciare i fattori ambientali imprevedibili tra i gruppi sperimentali.
  10. Rimetti gli animali nella loro gabbia di casa dopo che tutti gli animali sono stati testati e rimettili nella stanza di stabulazione.
  11. In caso di test ripetuti su animali, mantenere un intervallo di almeno 1 giorno tra un test e l'altro.

2. Test comportamentali

  1. Labirinto sopraelevato e (EPM)
    NOTA: Entrambi i sessi dei ceppi di topi C57BL/6NCrl e UBE3AmGenedel/+ sono stati testati per questo studio a 9-12 settimane di età. Il peso degli animali variava da 22 a 36 g per i maschi e da 18 a 28 g per le femmine al momento del test.
    1. Posiziona il labirinto a forma di più sulla piattaforma di test appena sotto la telecamera. Utilizzando il potenziometro a parete, imposta l'intensità della luce a 70 lux al suo centro con l'aiuto di un luxometro, con il suo sensore posizionato al centro del labirinto durante la regolazione.
    2. Aprire il software facendo doppio clic sull'icona del software Viewer e caricare la configurazione per il test EPM facendo clic sull'icona nella parte superiore sinistra della scheda Configurazione . Caricare il plug-in EPM dal menu File . Compila le informazioni sull'animale utilizzando la tastiera del computer - ID animale, genotipo, sesso e informazioni sull'esperimento (data, intensità della luce) - nei campi corrispondenti della scheda Esperimento . Controllare se la posizione della zona, le braccia aperte e le braccia chiuse sono configurate correttamente. Con l'aiuto di un controllo visivo e del mouse del computer, assicurarsi che le zone con contorno virtuale corrispondano alle zone EPM corrispondenti nell'anteprima video.
    3. L'EPM è un test utilizzato per valutare l'ansia generale di un animale, che si basa sul conflitto tra approccio ed evitamento. I roditori tendono naturalmente ad evitare le zone non protette ben illuminate (braccia aperte), a favore di quelle più sicure (braccia chiuse). Poiché questo test completamente automatizzato si basa su un sistema di tracciamento video, lascia che il software calcoli automaticamente il tempo trascorso in ogni zona e il numero di ingressi.
    4. Durante i test, registrare gli animali in video tramite una telecamera industriale sensibile alla luce infrarossa. Consenti al software di rilevare la posizione dell'animale in tempo reale durante la registrazione. Successivamente, lascia che il software valuti automaticamente le tracce dell'animale per calcolare tutti i parametri che descrivono il comportamento dell'animale nel labirinto. Usa il tempo trascorso nelle braccia aperte ansiogene e la percentuale di visite a braccia aperte per valutare il livello di comportamento ansioso negli animali.
      NOTA: Il labirinto su misura è realizzato in materiale permeabile alla luce infrarossa ed è posizionato su una piattaforma di sorgenti luminose a infrarossi a diodo emettitore di luce (LED).
    5. Posizionare il cursore del mouse sull'icona a forma di freccia in alto a sinistra della scheda Acquisizione . Rimuovere manualmente un animale dalla gabbia domestica e posizionarlo delicatamente al centro dell'EPM. Avvia il protocollo facendo clic con il pulsante sinistro del mouse del computer e lascia immediatamente la stanza sperimentale.
    6. Una volta terminato il protocollo di registrazione dopo 5 minuti di esplorazione libera del labirinto, salvare i dati registrati facendo clic su OK nella finestra che appare dopo la terminazione del protocollo, assegnare un nome appropriato al file e fare clic su Salva. Esportare i risultati in un file .csv per ogni animale testato per l'analisi off-line facendo clic sull'icona nel pannello verticale sinistro della scheda Analisi dati .
    7. Rimuovi l'animale dal labirinto a mano e mettilo nella gabbia di contenimento temporanea. Procedere con i test su tutti gli animali allo stesso modo. Copia i risultati di tutti gli animali testati in un file Blocco note per l'analisi offline facendo clic sull'icona Copia risultati nella scheda dei risultati del plug-in del labirinto Elevated Plus .
      NOTA: Il software e l'hardware possono differire ed è necessario seguire i relativi manuali. Inoltre, la configurazione sperimentale, come l'illuminazione o il posizionamento del computer, può variare a seconda della struttura della struttura per animali.
  2. Test in campo aperto (OF)
    NOTA: Il test in campo aperto valuta il movimento complessivo di un animale, che è innescato dal comportamento esplorativo in un nuovo ambiente. Inoltre, è comunemente usato come strumento di screening per rilevare l'ansia generale in uno spazio non protetto e ben illuminato. Si tratta di un test completamente automatizzato che utilizza un sistema di tracciamento video, utilizzato anche nel test precedente.
    1. Posiziona le quattro caselle di test OF sulla piattaforma di test appena sotto la telecamera. Utilizzando il potenziometro a parete, impostare l'intensità luminosa a 200 lux al centro di ogni test OF con l'aiuto di un luxometro, con il suo sensore posto al centro di ogni scatola durante la regolazione.
    2. Aprire il software facendo doppio clic sull'icona del software Viewer e caricare la configurazione per il test OF facendo clic sull'icona nella parte in alto a sinistra della scheda Configurazione . Compila le informazioni sull'animale utilizzando la tastiera del computer - ID animale, genotipo, sesso e informazioni sull'esperimento (data, intensità della luce) - nei campi corrispondenti della scheda Esperimento . Controllare se la posizione della zona (centro e periferia) corrisponde alle caselle di test OF e regolarle se necessario. Con l'aiuto di un controllo visivo e del mouse del computer, assicurarsi che le zone centrali e periferiche con contorno virtuale corrispondano alle corrispondenti zone di test OF nell'anteprima video.
    3. Durante il test, registrare gli animali in video tramite una telecamera industriale sensibile alla luce infrarossa. Consenti al software di rilevare la posizione dell'animale in tempo reale durante la registrazione e valutare automaticamente le tracce dell'animale per calcolare tutti i parametri che descrivono il comportamento dell'animale nella scatola di prova OF. La distanza percorsa, la velocità media e il tempo di riposo sono parametri utilizzati per valutare l'attività degli animali in un nuovo ambiente, mentre il numero di ingressi al centro e la durata nel centro descrivono un comportamento simile all'ansia negli animali.
      NOTA: Il labirinto su misura è realizzato in materiale permeabile alla luce infrarossa ed è posizionato su una piattaforma di sorgente luminosa a infrarossi a LED.
    4. Posizionare il cursore del mouse sull'icona a forma di freccia in alto a sinistra della scheda Acquisizione . Rimuovere a mano quattro animali dalla gabbia domestica e posizionarli delicatamente nell'angolo di ciascuna scatola di prova OF. Avvia il protocollo facendo clic con il pulsante sinistro del mouse di un computer e lascia immediatamente la stanza sperimentale.
    5. Al termine del protocollo dopo 10 minuti di esplorazione libera del labirinto, salvare i dati facendo clic su OK nella finestra visualizzata dopo la terminazione del protocollo, assegnare un nome appropriato al file e fare clic su Salva. Esportare i risultati in un file .csv per ogni animale testato per l'analisi off-line facendo clic sull'icona nel pannello verticale sinistro della scheda Analisi dati .
    6. Rimuovi gli animali dal labirinto a mano e mettili nella gabbia di contenimento temporanea. Procedere con i test su tutti gli animali allo stesso modo. Analizzare i dati esportati.
      NOTA: Il software e l'hardware possono differire ed è necessario seguire i relativi manuali. Inoltre, la configurazione sperimentale, come l'illuminazione, il numero di labirinti o il posizionamento del computer, può variare a seconda della costruzione della struttura per animali.
  3. Test di sospensione della coda (TST)
    NOTA: Tre topi vengono testati contemporaneamente con l'apparato di sospensione automatica della coda.
    1. Mantenere l'intensità luminosa della stanza a 100-120 lux.
    2. Collegare il sistema TST al computer tramite un cavo USB. Inserire il dongle USB nel computer e avviare il software facendo doppio clic sull'icona del software BIO-TST . Nella scheda Impostazioni in Globale, regolare la durata dell'acquisizione a 360 s. Nella scheda Esperimento , seleziona Nuovo elenco di soggetti e crea un nuovo file dell'esperimento e un nuovo elenco di soggetti testati seguendo le istruzioni nella scheda aperta.
    3. Avviare l'esecuzione facendo clic su Avvia esecuzione | continua nella scheda Acquisizione . Preparare gli animali al test avvolgendo del nastro monoadesivo, come il nastro medico transporato, intorno ai 3/4 della coda dell'animale, partendo dalla base.
    4. Passare il gancio di sospensione attraverso il nastro e appendere l'animale su di esso. Iniziare ad acquisire i dati per ogni animale individualmente subito dopo averlo appeso al gancio facendo clic sull'icona Avvia sotto la posizione visualizzata per ogni animale e osservare gli animali continuamente durante il test.
    5. Dopo aver completato l'acquisizione per il primo gruppo di animali, fare clic su Avvia la corsa successiva, rimuovere gli animali dal gancio, staccare il nastro adesivo dalla coda, tagliando con cura il nastro con le forbici lungo la coda e mettere gli animali nella gabbia di detenzione temporanea.
    6. Pulire l'apparecchio con alcool al 75% e fazzoletti di carta e procedere con il resto degli animali come descritto sopra. Nella scheda Analisi, selezionare gli ultimi 4 minuti dell'acquisizione per l'analisi, quindi selezionare tutte le esecuzioni valide nel periodo di analisi, fare clic su Analizza soggetti selezionati, scegliere il formato di dati desiderato e fare clic su Esporta dati selezionati per esportare i dati raccolti per ulteriori analisi.
      NOTA: Il test dura 6 min. Durante i primi 2 minuti, gli animali lotteranno vigorosamente, ma poiché la reazione di disperazione diventa prevalente durante i restanti 4 minuti, il tempo di immobilità durante questo periodo viene preso per l'analisi. Il software e l'hardware possono differire ed è necessario seguire i relativi manuali. Inoltre, l'apparecchiatura stessa può variare (ad esempio, il numero di posizioni di test).
  4. Analisi dell'andatura
    1. Accendere il tapis roulant e impostare manualmente la velocità del nastro su 20 cm/s sul pannello dell'attrezzatura facendo clic sul simbolo + o - situato accanto all'indicatore di velocità. Accendere la luce dell'apparecchio ruotando la manopola in senso orario. Avviare il software DigiGait Imager facendo doppio clic sull'icona del software e impostare la velocità dell'otturatore su 100 per i mouse albini o su 130 per i mouse neri/scuri sul campo per la velocità dell'otturatore.
    2. Rimuovere manualmente il primo animale dalla gabbia domestica e posizionarlo delicatamente sul nastro del tapis roulant. Chiudere la porta dello scomparto animali. Ispezionare visivamente per assicurarsi che la coda dell'animale non sia incastrata tra la porta e il telaio.
    3. Consentire al mouse di esplorare il nastro del tapis roulant prima della registrazione. Accertarsi che l'animale sia in grado di eseguire il test impostando il tapis roulant su una velocità di camminata lenta per ~3 s e poi fermandolo, osservando continuamente l'animale.
    4. Avviare la cinghia premendo il pulsante Start sul pannello dell'apparecchiatura e registrare per circa 10 s. Assicurarsi che sia osservabile una locomozione chiara e fluida di almeno 10-15 passi. Arrestare la cinghia premendo il pulsante Stop sul pannello dell'apparecchiatura e riportare manualmente il mouse nella gabbia di attesa temporanea.
    5. Eseguire lo screening della registrazione per una sequenza di immagini con passi fluidi facendo clic su PLAY e rivedendo la registrazione con il controllo visivo in modalità EDIT. Scegli 10-15 movimenti fluenti scrivendo manualmente i loro numeri di fotogramma iniziale e finale nei campi pertinenti (Dal fotogramma# per il primo fotogramma e A per l'ultimo fotogramma). Compila le informazioni dell'animale - ID dell'animale, data di nascita, sesso, peso, velocità e angolo della cintura - e commenta quando necessario nei campi pertinenti. Salvare il file per un'ulteriore analisi facendo clic su Salva.
    6. Pulisci la cintura con acqua e procedi con il resto degli animali allo stesso modo. Scegli FOTOCAMERA per procedere con la registrazione del prossimo animale che cammina. Una volta acquisite le registrazioni di tutti gli animali, procedere all'analisi.
      NOTA: Gli animali che non sono in grado di camminare a una velocità impostata del nastro sono esclusi dal test. Sulla base della nostra esperienza, osserviamo che gli animali più anziani (oltre le 50 settimane) hanno più difficoltà a camminare sul tapis roulant, con una frequenza variabile tra il 2% e il 50% a seconda del genotipo. I rifiuti animali vengono raccolti in vassoi sulla parte anteriore o posteriore del tapis roulant. I vassoi vengono svuotati dopo ogni studio e lavati con acqua tiepida e sapone. La cintura viene pulita con adamp stoffa.
    7. Esegui l'analisi dell'andatura sulla base di un'analisi completamente automatizzata delle registrazioni video delle impronte degli animali. Regola i dati nel software di analisi DigiGait .
      NOTA: L'analisi dell'andatura fornisce non solo una misura della coordinazione motoria, ma anche una descrizione cinematica dettagliata basata sull'analisi del segnale dinamico dell'andatura, che rappresenta la storia temporale del posizionamento della zampa attraverso passi sequenziali. I seguenti parametri vengono misurati automaticamente dal software: durata dell'oscillazione, percentuale della durata della falcata in oscillazione, durata della frenata, percentuale della durata della falcata in frenata, durata della propulsione, percentuale della falcata nella propulsione, durata della posizione, percentuale della falcata in posizione, durata della falcata, percentuale di frenata della posizione, percentuale di propulsione della fase di appoggio, rapporto oscillazione/appoggio, lunghezza del passo, frequenza del passo, angolo della zampa, variabilità dell'angolo della zampa, larghezza della posizione, angolo del passo, variabilità della lunghezza della falcata, variabilità della larghezza della falcata, variabilità dell'angolo del passo, coefficiente di variazione della lunghezza della falcata, coefficiente di variazione della larghezza della posizione, coefficiente di variazione dell'angolo del passo, coefficiente di variazione della durata dell'oscillazione, area della zampa alla posizione di picco, variabilità dell'area della zampa alla posizione di picco, durata della posizione condivisa dell'arto posteriore, percentuale della posizione condivisa, rapporto tra la durata della posizione posteriore sinistra e destra, simmetria dell'andatura, velocità massima di cambiamento dell'area della zampa a contatto con il nastro del tapis roulant durante la fase di frenata, velocità massima di cambiamento dell'area della zampa a contatto con il nastro del tapis roulant durante la fase di propulsione, propulsione tau, distanza di sovrapposizione della zampa, posizionamento della zampa, coefficiente di atassia, distanza della linea mediana, distanza dell'asse e trascinamento della zampa. Il software consente una piccola correzione del rumore di traccia del passo, che dovrebbe essere completata prima dell'analisi statistica. Il software e l'hardware possono differire ed è necessario seguire i relativi manuali.
  5. Rotarod
    NOTA: Il test rotarod viene utilizzato per valutare le funzioni motorie dei roditori: equilibrio e coordinazione motoria. Il test richiede che un topo cammini su un'asta rotante di diametro fisso (5 cm), con la rotazione che accelera in un determinato periodo di tempo (5 minuti) fino a quando l'animale non riesce più a stare in piedi.
    1. Accendere l'apparecchiatura rotarod premendo l'interruttore di accensione/spegnimento sull'apparecchiatura e avviare il software facendo doppio clic sull'icona del software Rod. Inizializzare un nuovo file nella scheda File e salvarlo con il nome appropriato. Nella finestra Configurazione, compila i dettagli dell'esperimento, ad esempio la data, il nome dell'utente ed eventuali commenti. Impostare il profilo di velocità su 300 s, la velocità iniziale su 4 giri/min e la velocità terminale su 40 giri/min.
    2. Prepara un programma per gli animali testati nel campo Animali e assegna a ciascun animale la sua posizione sull'asta. Le posizioni non sono indicate nel software in modo esplicito, ma corrispondono alla riga dell'elenco; Ad esempio, la prima riga indicherebbe la prima posizione dell'asta, la quinta riga indicherebbe la quinta posizione dell'asta e così via. Ricordarsi di controbilanciare ogni posizione dell'asta tra i gruppi sperimentali.
      NOTA: Cinque animali possono essere testati contemporaneamente.
    3. Chiudere il pannello Impostazione facendo clic su Chiudi e aprire il pannello di misurazione facendo clic su Misura. Avviare la rotazione iniziale dell'asta a 4 giri/min facendo clic su Start/Stop e posizionare i primi cinque animali nelle posizioni assegnate. Quando tutti gli animali sono sull'asta, avviare il protocollo di test facendo clic su Avvia profilo e l'asta accelererà gradualmente a 40 giri/min in 5 minuti. Se un animale cade dall'asta, rimettila sull'asta prima dell'inizio del protocollo.
      NOTA: Gli animali di solito non rimangono sull'asta abbastanza a lungo da posizionare tutti i topi su di essa contemporaneamente durante il primo tentativo. È importante essere pazienti quando si posizionano gli animali sull'asta con la velocità di rotazione costante all'inizio. Lo scopo del test non è quello di determinare la resistenza dell'animale sull'asta a una velocità di rotazione fissa, ma di trovare la velocità alla quale l'animale non è in grado di rimanere sull'asta. La velocità dell'asta è proporzionale alla latenza di permanenza su di essa; Pertanto, è usato per esprimere l'equilibrio dell'animale.
    4. Spostare gli animali nella gabbia di detenzione temporanea dopo che tutti sono caduti dall'asta o dopo che sono trascorsi 5 minuti. Rimuovere eventuali escrementi animali e pulire l'asta e il vassoio con alcool.
    5. Fare clic su Animali -> per procedere con il gruppo di animali successivo nello stesso modo. Dopo aver testato tutti gli animali, chiudere la finestra Misura facendo clic su Chiudi e fare clic su Mostra per visualizzare i dati raccolti. Esportare i dati acquisiti in formato file .csv per ulteriori analisi facendo clic su Esporta CSV.
    6. Testare ogni animale sull'asta tre volte con intervalli di 15 minuti tra le prove. Utilizzare il valore medio della latenza per diminuire nelle tre prove per un'ulteriore analisi statistica. Valutare l'apprendimento motorio dell'animale ripetendo il test per 5 giorni consecutivi.
      NOTA: Il software e l'hardware possono differire ed è necessario seguire i relativi manuali. Inoltre, l'apparecchiatura stessa può variare, ad esempio, nel numero di posizioni di prova, nella costruzione complessiva e nelle dimensioni dell'asta.
  6. Costruzione di nidi di triturazione di nidi
    1. Separare gli animali in gabbie singole per topi in policarbonato con attrezzature standard (lettiera, rete alimentare e approvvigionamento idrico) per 1 settimana. Prendi circa 12 g di nido di cotone usando una pinza, registra il suo peso manualmente usando una bilancia e mettilo a caso in una gabbia, ma sul lato opposto alla rete idrica. Rimetti le gabbie con gli animali nella stanza di stabulazione.
    2. Pesare ogni nido alla stessa ora ogni giorno per i successivi 4 giorni manualmente utilizzando la bilancia. Registra i pesi su carta o in un foglio di calcolo predefinito. Assicurati che ogni nido sia asciutto quando viene pesato; In caso contrario, asciugare su un termoforo e riportare tutti i nidi nelle gabbie assegnate contemporaneamente nel luogo in cui il topo ha fatto il nido. Se il nido è strappato in più parti, pesare quella più grande.
    3. Per l'analisi dei dati, esprimere il decremento del peso del nido ogni giorno rispetto al peso iniziale e presentarlo come percentuale del materiale utilizzato.
      NOTA: Riportare i maschi in una gabbia comune può portare a un aumento dell'aggressività e a lesioni indesiderate tra gli animali. Pertanto, il test di triturazione del nido dovrebbe essere programmato verso la fine del regime di test per evitare di compromettere il benessere degli animali.

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Risultati

Sopraelevato più labirinto e test in campo aperto
I test EPM e OF utilizzano la naturale tendenza dei roditori ad esplorare nuovi ambienti18,19. L'esplorazione è governata da un conflitto di avvicinamento-evitamento, in cui i roditori scelgono tra l'esplorazione di un nuovo ambiente e l'evitare possibili pericoli. Gli animali esplorano luoghi sconosciuti alla ricerca di riparo, contatto sociale o foraggiamento. Tuttavia, i nuovi luoghi possono...

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Discussione

I modelli di AS creati in diversi ceppi murini sono comunemente convalidati con test dello stato emotivo, delle funzioni motorie e delle capacità cognitive degli animali per facilitare il confronto con i sintomi umani31,32. Un deficit motorio nei modelli di AS è il risultato più consistente in tutti i laboratori, seguito da uno stato emotivo invariato dei mutanti e dalle difficoltà a costruire i nidi31,32,33

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

Ringraziamenti

Questa ricerca è stata sostenuta dall'Accademia ceca delle scienze RVO 68378050, LM2018126 Centro ceco per la fenogenomica fornito da MEYS CR, OP RDE CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_013/0001789 (Upgrade of the Czech Centre for Phenogenomics: developing towards translation research by MEYS and ESIF), OP RDE CZ.02.1.01/0.0/0.0/18_046/0015861 (CCP Infrastructure Upgrade II di MEYS e ESIF) e OP RDI CZ.1.05/2.1.00/19.0395 (qualità e capacità superiori per i modelli transgenici di MEYS e FESR). Inoltre, questo studio ha ricevuto finanziamenti dall'ONG "Association of Gene Therapy (ASGENT)", dalla Repubblica Ceca (https://asgent.org/) e dal Centro cec LM2023036 o di fenogenomica fornito dal Ministero dell'Istruzione, della Gioventù e dello Sport della Repubblica Ceca.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Gabbie, ventilate individualmenteTechniplast
DigiGaitMouse Specifics, Inc., 2 Central Street Level
Unit 110
Framingham, MA 01701, USA		L'attrezzatura è stata offerta, non è stato fornito alcun numero di catalogo, né è stato possibile trovarlo sul sito web dell'aziendaAnalisi dettagliata dell'andatura del mouse, hardware e software forniti.
FDA Nestlet squaresDatesand Ltd., 7 Horsfield Way, Bredbury, Stockport SK6, Regno UnitoIl materiale è stato acquistato dal fornitore Velaz tramite richiesta diretta via e-mail. Velaz non fornisce alcun numero di catalogo.Nidi di cotone per test di costruzione del nido. Descrizione del nido: 2-3 g ciascuno, con diametro circa 5 x 5 x 0,5 cm.
Altramion
RotarodTSE Systems GmbH, Barbara-McClintock-Str.4
12489 Berlino, Germania		L'attrezzatura è stata offerta, non è stato fornito alcun numero di catalogo, né è stato possibile trovarlo sul sito web dell'aziendaRotarod per 5 mouse, hardware e software forniti. Dimensioni del tamburo: Diametro: 30 mm, larghezza per corsia: 50 mm, distanza di caduta 147 mm.
Test della sospensione della codaBioseb, In Vivo Research Instruments, 13845 Vitrolles
FRANCIA		Riferimento: BIO-TST5Apparecchiatura completamente automatizzata per la valutazione del tempo di immobilità di 3 topi impiccati per la coda, hardware e software forniti
Nastro medico TransporeMedical M, Ltd.P-AIRO1291Il nastro utilizzato per attaccare un animale al gancio per la coda.
Visualizzatore - Sistema di tracciamento videoBiobserve GmbH, Wilhelmstr. 23 A
53111 Bonn, Germania		Sono state presentate offerte per l'attrezzatura con software, non è stato fornito alcun numero di catalogo, né è stato possibile trovare sul sito web dell'aziendaSoftware con hardware personalizzato: labirinto, base IR, telecamere sensibili IR. Dimensioni OF su misura: 42 x 42 cm di superficie, 49 cm di altezza parete, zona centrale: 39 cm2. Un EPM su misura è stato sollevato a 50 cm dal pavimento, con un braccio aperto lungo 79 cm. 9 cm di larghezza e braccio chiuso 77 cm di lunghezza, 7,6 cm di larghezza.

Riferimenti

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