Articolo metodologico

Generazione di cibridi transmitocondriali utilizzando linee cellulari tumorali

DOI:

10.3791/65186

⸱

17 marzo 2023

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry, University of Zaragoza, 2Institute for Biocomputation and Physics of Complex Systems, University of Zaragoza, 3Sequencing and Functional Genomics Unit, University of Zaragoza-IACS

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo protocollo descrive una tecnica per la generazione di cibridi da cellule tumorali in sospensione come strumento per studiare il ruolo dei mitocondri nel processo tumorigenico.

Abstract

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Negli ultimi anni, il numero di studi dedicati ad accertare la connessione tra mitocondri e cancro è aumentato in modo significativo. Tuttavia, sono ancora necessari ulteriori sforzi per comprendere appieno il legame che coinvolge le alterazioni nei mitocondri e nella tumorigenesi, nonché per identificare i fenotipi mitocondriali associati al tumore. Ad esempio, per valutare il contributo dei mitocondri nei processi di tumorigenesi e metastasi, è essenziale comprendere l'influenza dei mitocondri dalle cellule tumorali in diversi ambienti nucleari. A tal fine, un possibile approccio consiste nel trasferire i mitocondri in un diverso background nucleare per ottenere le cosiddette cellule cibridi. Nelle tecniche tradizionali di cibridizzazione, una linea cellulare priva di mtDNA (ρ0, cellula donatrice nucleare) viene ripopolata con mitocondri derivati da cellule enucleate o piastrine. Tuttavia, il processo di enucleazione richiede una buona adesione cellulare alla piastra di coltura, una caratteristica che viene parzialmente o completamente persa in molti casi nelle cellule invasive. Inoltre, un'altra difficoltà riscontrata nei metodi tradizionali è quella di ottenere la completa rimozione del mtDNA endogeno dalla linea cellulare mitocondriale-ricevente per ottenere sfondi di DNA nucleare e mitocondriale puro, evitando la presenza di due diverse specie di mtDNA nel cibride generato. In questo lavoro, presentiamo un protocollo di scambio mitocondriale applicato alle cellule tumorali in sospensione in crescita basato sul ripopolamento di cellule pretrattate con rodamina 6G con mitocondri isolati. Questa metodologia ci consente di superare i limiti degli approcci tradizionali e quindi può essere utilizzata come strumento per espandere la comprensione del ruolo mitocondriale nella progressione del cancro e nelle metastasi.

Introduzione

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Riprogrammare il metabolismo energetico è un segno distintivo del cancro1 che è stato osservato per la prima volta da Otto Warburg nel 19302. In condizioni aerobiche, le cellule normali convertono il glucosio in piruvato, che poi genera acetil-coA, alimentando il macchinario mitocondriale e promuovendo la respirazione cellulare. Tuttavia, Warburg ha dimostrato che, anche in condizioni normossiche, la maggior parte delle cellule tumorali converte il piruvato ottenuto dal processo di glicolisi in lattato, spostando il loro modo di ottenere energia. Questo aggiustamento metabolico è noto come "effetto Warburg" e consente ad alcune cellule tumorali di soddisfare le loro richieste energetiche di crescita rapida e divisione, nonostante generino ATP in modo meno efficiente rispetto al processo aerobico 3,4,5. Negli ultimi decenni, numerosi lavori hanno supportato l'implicazione della riprogrammazione del metabolismo nella progressione del cancro. Quindi, l'energetica del tumore è considerata un obiettivo interessante contro il cancro1. Come hub centrale nel metabolismo energetico e nella fornitura di precursori essenziali, i mitocondri svolgono un ruolo chiave in questi adattamenti cellulari che, ad oggi, comprendiamo solo parzialmente.

In linea con quanto sopra, le mutazioni del DNA mitocondriale (mtDNA) sono state proposte come una delle possibili cause di questa riprogrammazione metabolica, che potrebbe portare a una ridotta prestazione della catena di trasporto degli elettroni (ETC)6 e spiegherebbe perché alcune cellule tumorali migliorano il loro metabolismo glicolitico per sopravvivere. Infatti, è stato riportato che il mtDNA accumula mutazioni all'interno delle cellule tumorali, essendo presente in almeno il 50% dei tumori7. Ad esempio, un recente studio condotto da Yuan et al. ha riportato la presenza di molecole di mtDNA ipermutate e troncate nei tumori del rene, del colon-retto e della tiroide8. Inoltre, molti lavori hanno dimostrato che alcune mutazioni del mtDNA sono associate ad un fenotipo tumorale più aggressivo e ad un aumento del potenziale metastatico delle cellule tumorali 9,10,11,12,13,14,15,16.

Nonostante l'apparente rilevanza del genoma mitocondriale nella progressione del cancro, lo studio di queste mutazioni e il loro contributo alla malattia sono stati difficili a causa delle limitazioni nei modelli sperimentali e nelle tecnologie attualmente disponibili17. Pertanto, sono necessarie nuove tecniche per comprendere il reale impatto del DNA dei mitocondri nello sviluppo e nella progressione della malattia del cancro. In questo lavoro, introduciamo un protocollo per la generazione di cibridi transmitocondriali da cellule tumorali in crescita in sospensione, basato sul ripopolamento di cellule pretrattate con rodamina 6G con mitocondri isolati, che supera le principali sfide dei metodi tradizionali di cibridizzazione18,19. Questa metodologia consente l'utilizzo di qualsiasi nucleo donatore indipendentemente dalla disponibilità della corrispondente linea cellulare ρ0 e il trasferimento di mitocondri da cellule che, seguendo le tecniche tradizionali, sarebbero difficili da enucleare (cioè linee cellulari non aderenti).

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Protocollo

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NOTA: tutti i terreni di coltura e le composizioni buffer sono specificati nella tabella 1. Prima della generazione del cibride, entrambi i profili del DNA mitocondriale e nucleare delle cellule donatrici e riceventi devono essere tipizzati per confermare la presenza di differenze genetiche in entrambi i genomi tra le linee cellulari. In questo studio, sono state utilizzate una linea cellulare L929 disponibile in commercio e la sua linea cellulare derivata, L929dt, che è stata generata spontaneamente nel nostro laboratorio (vedi13 per maggiori informazioni). Queste linee cellulari presentano due differenze nella sequenza del loro gene mt-Nd2 che possono essere utilizzate per confermare la purezza del mtDNA una volta terminato il processo di cibridizzazione13. In questo caso, la purezza dello sfondo nucleare è stata confermata dalla sensibilità agli antibiotici, poiché, contrariamente alle cellule L929dt, L929 era resistente alla geneticina.

1. Deplezione mitocondriale mediante trattamento con rodamina 6G (cellule riceventi)

NOTA: Il primo passo per una generazione di cybrid di successo è quello di abolire completamente e irreversibilmente le funzioni mitocondriali nelle cellule riceventi. A tal fine, è necessario determinare in precedenza, per ciascuna linea cellulare, la concentrazione appropriata e la durata del trattamento con rodamina 6G. Questa concentrazione adeguata dovrebbe essere appena al di sotto della morte cellulare indotta dal farmaco (la più alta che non uccide le cellule durante il trattamento). Eseguire le seguenti operazioni una volta definite le condizioni ottimali.

  1. Seminare 10 6 cellule in una piastra a6 pozzetti utilizzando terreno di coltura completo (vedere Tabella 1 per i dettagli) e trattarle quotidianamente con la concentrazione ottimale di rodamina 6G per 3-10 giorni, a seconda della linea cellulare. Le concentrazioni tradizionali variano da 2 a 5 μg/ml per 3-10 giorni20,21. In questo studio, per le cellule derivate da L929, 2,5 μg/mL di rodamina 6G per 7 giorni è stato il trattamento selezionato 13,22.
  2. Per mantenere in vita le cellule, integrare il terreno di coltura cellulare con 50 μg/mL di uridina e 100 μg/mL di piruvato e rinnovarlo ogni 24 ore.
  3. Dopo il trattamento e prima della fusione, cambiare il terreno di coltura delle cellule trattate con rodamina 6G per completare il terreno di coltura cellulare senza rodamina 6G e lasciarle in questo mezzo per 3-4 ore in un incubatore a 37 °C con il 5% di CO2.
    NOTA: L'effetto tossico della rodamina 6G è irreversibile e le cellule con mitocondri non funzionali non dovrebbero recuperare20. Pertanto, dopo il trattamento, le cellule che non ricevono mitocondri funzionali dovrebbero morire anche nel terreno di coltura integrato con uridina. Pertanto, non dovrebbe essere necessaria alcuna selezione nucleare. Tuttavia, si raccomanda una fusione di controllo delle cellule trattate con rodamina 6G senza mitocondri.

2. Espansione e isolamento mitocondriale (cellule donatrici)

  1. Espandere le cellule donatrici dei mitocondri durante il lasso di tempo del trattamento con rodamina 6G per ottenere circa 25 x 106 cellule.
  2. Il giorno 7, raccogliere le cellule in crescita esponenziale in una provetta da 50 ml e raccoglierle mediante centrifugazione a 520 x g per 5 minuti a temperatura ambiente (RT). Lavare le cellule 3 volte con soluzione salina tamponata con fosfato freddo (PBS) e sedimentarle mediante centrifugazione a 520 x g per 5 minuti a RT. D'ora in poi, eseguire tutte le fasi di estrazione mitocondriale a 4 °C, utilizzando reagenti freddi e mantenendo le provette con cellule o mitocondri sul ghiaccio.
  3. Dopo la terza centrifugazione, scartare il surnatante mediante aspirazione utilizzando una pipetta di vetro accoppiata ad una pompa per vuoto e risospendere le celle imballate in un volume di tampone ipotonico pari a 7x il volume del pellet cellulare. Quindi, trasferire la sospensione cellulare in un tubo omogeneizzatore e lasciare che le cellule si gonfino incubandole sul ghiaccio per 2 minuti.
  4. Rompere le membrane cellulari eseguendo da 8 a 10 colpi nell'omogeneizzatore accoppiato a un pestello motorizzato che ruota a 600 giri / min.
    NOTA: La fase di rottura della membrana cellulare può variare tra i tipi di cellule; Pertanto, deve essere ottimizzato per ogni tipo di cella.
  5. Aggiungere lo stesso volume di tampone ipertonico alla sospensione cellulare (7 volte il volume del pellet cellulare) per generare un ambiente isotonico.
  6. Trasferire l'omogenato in una provetta da 15 mL e centrifugarlo in un rotore fisso a 1.000 x g per 5 minuti a 4 °C. Quindi, raccogliere solo 3/4 del surnatante lasciando un ampio margine dal pellet, per evitare la contaminazione con nuclei o cellule intatte, e trasferirlo in un altro tubo. Ripeti lo stesso processo due volte. Si noti che il surnatante deve essere conservato e il pellet scartato.
  7. Salvare la frazione mitocondriale (supernatante). Trasferirlo in provette da 1,5 ml e centrifugare alla massima velocità (18.000 x g) per 2 minuti a 4 °C.
  8. Eliminare il surnatante e lavare il pellet arricchito di mitocondri con tampone A, combinando il contenuto delle due provette in uno e centrifugando nelle stesse condizioni descritte al punto 2.7. Ripetere lo stesso processo fino a quando tutto il materiale è in un solo tubo.
  9. Effettuare un ulteriore lavaggio con 300 μL di tampone A e quantificare la concentrazione di proteine mitocondriali utilizzando il saggio Bradford23. Per ogni test di cibridizzazione, deve essere determinata la quantità ottimale di mitocondri per la procedura di trasferimento (nel nostro caso, una concentrazione compresa tra 10-40 μg di proteina mitocondriale per 106 cellule).
  10. Contemporaneamente, preparare le cellule pretrattate con rodamina 6G per la fusione raccogliendole in un tubo da 15 ml e centrifugando a 520 x g per 5 minuti a RT. Si noti che il pellet acquisisce un colore rosa neon a causa del trattamento con rodamina 6G.
  11. Per garantire che sia l'abolizione della funzione mitocondriale nelle cellule recettoriali che la purificazione degli organelli dai donatori siano state eseguite correttamente, seminare un piccolo numero di cellule trattate con rodamina 6G e mitocondri isolati utilizzando il terreno di coltura completo in una piastra a 6 pozzetti e coltivarli per un mese per verificare che nessuna cellula sopravvissuta rimanga in nessuno dei pozzetti (Figura 2).
  12. In parallelo, valutare l'assenza di contaminanti nucleici nella frazione mitocondriale mediante immunorilevazione di proteine nucleari (ad esempio, lamina beta, istone H3, ecc.) o mediante amplificazione quantitativa della reazione a catena della polimerasi (qPCR) di un gene nucleare (SDH, rRNA 18S, ecc.).
    NOTA: Per evitare contaminazioni, si consiglia di eseguire tutti i passaggi in condizioni asettiche lavorando sotto una cappa a flusso laminare.

3. Fusione e generazione di cibridi

  1. Per procedere con la fusione, aggiungere con attenzione 106 delle cellule trattate con rodamina 6G al pellet mitocondriale isolato (10-40 μg di proteina mitocondriale) e centrifugare a 520 x g per 5 minuti per consentire alle cellule di mescolarsi con i mitocondri.
  2. Aggiungere 100 μL di glicole polietilenico (PEG, 50%) e risospendere delicatamente il pellet per 30 s. Quindi, lasciare riposare intatto per altri 30 secondi.
  3. Infine, trasferire la miscela in una piastra a 6 pozzetti con terreno di coltura cellulare completo fresco e porla nell'incubatore a 37 °C con CO2 al 5%. Dopo alcuni giorni (di solito 1 settimana), i cibridi transmitocondriali dovrebbero iniziare a crescere (Figura 2), dando origine a cloni che possono essere selezionati individualmente o miscelati in un pool prima della loro analisi.

4. Verifica del background mitocondriale e nucleare

NOTA: Una volta che la nuova linea cellulare è stata stabilita e le cellule iniziano a crescere in modo esponenziale, la purezza del loro DNA mitocondriale e nucleare deve essere verificata. Pertanto, le linee cellulari originali dovrebbero ospitare diverse mutazioni o polimorfismi all'interno dei loro genomi per renderli riconoscibili.

  1. Isolamento totale del DNA
    1. Isolare il DNA genomico di tutte le linee cellulari utilizzate per la generazione di cibridi utilizzando un kit commerciale di estrazione del DNA genomico (vedi Tabella dei materiali) o eseguendo un protocollo standard utilizzando l'estrazione di alcol fenolo-cloroformio-isoamilico e la precipitazione dell'alcol24.
  2. valutazione del mtDNA (Figura 3)
    NOTA: Diverse tecniche, come il sequenziamento, l'analisi del polimorfismo della lunghezza del frammento di restrizione (RFLP) o la qPCR allele-specifica, possono essere eseguite per analizzare la purezza del mtDNA. Per confermare la presenza di variazioni della sequenza del mtDNA mediante RFLP, seguire i passaggi successivi del protocollo.
    1. Amplificare un frammento di mtDNA contenente il cambiamento nucleotidico mediante PCR.
      1. Qui, le cellule L929dt presentano una mutazione del mtDNA in posizione 4206, all'interno di un gene mt-Nd2 (m.4206C>T) che è assente nelle cellule L929. Per confermare la presenza di questa sostituzione nei cibridi transmitocondriali, amplificare un frammento di 397 bp mediante PCR utilizzando un protocollo standard e i seguenti primer: 1) 5'-AAGCTATCGGG
        CCCATACCCCG-3' (posizioni 3862-3884) e 2) 5'-TAATCAGAAGTGGAATGGGGCG -3' (posizioni 4236-4258).
    2. Analizzare la presenza della sostituzione nucleotidica desiderata mediante RFLP, utilizzando un'endonucleasi specifica che riconosce il cambiamento di sequenza e genera un diverso schema di taglio per entrambe le linee cellulari.
      NOTA: Quando è presente la variante del mtDNA L929dt (4206T), l'amplicone ottenuto al punto 4.2.1 contiene due siti di restrizione per SspI (vedere Tabella dei materiali) che producono tre frammenti di DNA di 306 bp, 52 bp e 39 bp. Il sito di restrizione che genera le bande 52 e 39 viene interrotto quando è presente la versione wild-type (WT) C4206 e viene visualizzata una nuova banda di 91 bp. Pertanto, nell'analisi è incluso un controllo interno per la digestione completa per SspI. La reazione di digestione viene eseguita a 37 °C, seguendo le istruzioni del produttore.
    3. Separare i frammenti di restrizione mediante elettroforesi e confrontare il modello di bande.
      1. Una volta eseguita la digestione, analizzare i frammenti di restrizione ottenuti mediante elettroforesi in gel di poliacrilammide-tris-borato-EDTA (TBE) al 10% (vedere Tabella 1 per la composizione di 1x TBE). Eseguire l'elettroforesi a 80 V per 1 ora a RT. Visualizzare i frammenti di DNA dopo la colorazione del gel in una soluzione di bromuro di etidio in 1x TBE per 15 minuti a RT (vedere Tabella 1 per la composizione della soluzione colorante con gel).
  3. Genotipizzazione del DNA nucleare
    NOTA: La genotipizzazione del DNA nucleare deve essere eseguita utilizzando il precedente campione di estrazione del DNA utilizzato per l'analisi RFLP.
    1. Amplificare 16 loci (D21S11, CSF1PO, vWA, D8S1179, TH01, D18S51, D5S818, D16S539, D3S1358, D2S1338, TPOX, FGA, D7S820, D13S317, D19S433 e AMEL) utilizzando un pool di oligonucleotidi specifici per uso commerciale (vedere Tabella dei materiali).
    2. Eseguire l'elettroforesi utilizzando un analizzatore genetico per separare i frammenti precedentemente ottenuti.
      NOTA: Una volta amplificati, i diversi loci vengono analizzati mediante elettroforesi utilizzando un sistema capilare (vedi Tabella dei materiali). I frammenti sono separati in un capile lungo 50 cm riempito con un polimero commerciale. Anche i tamponi catodici e anodici sono disponibili in commercio, come mostrato nella tabella dei materiali. L'elettroforesi viene eseguita a 19,5 kV per 20 minuti a 60 °C.
    3. Utilizzare strumenti bioinformatici per determinare gli alleli corrispondenti a ciascun locus amplificato (vedi Tabella dei materiali).
    4. Confrontare i dati ottenuti nella fase 4.3.3 con il database del profilo del DNA nucleare (Tabella 1), per verificare se il profilo del DNA nucleare corrisponde al profilo della linea cellulare del recettore dei mitocondri (Figura 4).

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Risultati

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Dopo aver seguito il protocollo sopra presentato, dovrebbe essere ottenuta una linea cellulare di cibride omoplasmatico con un background nucleare conservato ma con un nuovo genotipo mitocondriale, come rappresentato negli schemi in Figura 1 e Figura 2. La purezza del DNA mitocondriale e nucleare presente nei cibridi può essere confermata dalla RFLP, come mostrato nella Figura 3, e dall'analisi di genotipizzazione del DNA nucleare, ...

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Discussione

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Da quando Otto Warburg ha riferito che le cellule tumorali spostano il loro metabolismo e potenziano la "glicolisi aerobica"3,4 riducendo la respirazione mitocondriale, l'interesse per il ruolo dei mitocondri nella trasformazione e nella progressione del cancro è cresciuto esponenzialmente. Negli ultimi anni, le mutazioni nel mtDNA e la disfunzione mitocondriale sono state postulate come segni distintivi di molti tipi di cancro25. Ad oggi,...

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Dichiarazioni

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Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.

Ringraziamenti

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Questa ricerca è stata finanziata dal numero di sovvenzione PID2019-105128RB-I00 a RSA, JMB e AA e PGC2018-095795-B-I00 a PFS e RML, entrambi finanziati da MCIN / AEI / 10.13039 / 501100011033 e numeri di sovvenzione B31_20R (RSA, JMA e AA) e E35_17R (PFS e RML) e finanziato da Gobierno de Aragón. Il lavoro di RSA è stato sostenuto da una sovvenzione della Asociación Española Contra el Cáncer (AECC) PRDAR21487SOLE. Gli autori desiderano riconoscere l'uso di Servicio General de Apoyo a la Investigación-SAI, Universidad de Zaragoza.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Analizzatore genetico 3500XL ThermoFisher Scientific4406016
Piastra a 6 pozzettiCorning08-772-1B
Persolfato di ammonioSigma-AldrichA3678
AmpFlSTR Identifiler Plus Kit di amplificazione PCRThermoFisher Scientific4427368
Contenitore tampone per anodo Serie 3500 AppliedBiosystems4393927
Acido boricoSaggio PanReac131015
BradfordBiorad5000002
Contenitore tampone catodico Serie 3500Applied Biosystems4408256
Fiasche per colture cellulariTPP90076
DMEM Gibco ad alto contenuto di glucosio11965092
EDTAPanReac131026
Bromuro di etidioSigma-AldrichE8751
GeneticinGibco10131027
Omogeneizzatore Pestello in teflonDeltalab196102
linea cellulare L929ATCCCCL-1
MiniProtean Tetra4 Gel SystemBioRad1658004
MOPSSigma-AldrichM1254
PCRprimerSigma-AldrichProdotti
Soluzione di poliacrilammide 30%PanReacA3626
PolietilenglicoleSigma-AldrichP7181
POP-7Applied Biosystems4393714
PiruvatoSigma-AldrichP5280
QIAmp DNA Mini KitQiagen51306
Rhodamine-6GSigma-AldrichR4127
Siero fetale bovinoSigma-AldrichF7524
SspINew England BiolabsR3132
Streptomicina / penicillinaPAN biotechP06-07100
SaccarosioSigma-AldrichS3089
TEMEDSigma-AldrichT9281
TrisPanReacP14030b
UridinaSigma-AldrichU3750
personalizzati

Riferimenti

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