Sequenziamento ultraveloce di nuova generazione basato su ampliconi nel carcinoma polmonare non squamoso non a piccole cellule

Christophe Bontoux; Virginie Lespinet-Fabre; Olivier Bordone; Virginie Tanga; Maryline Allegra; Myriam Salah; Salomé Lalvée; Samantha Goffinet; Jonathan Benzaquen; Charles-Hugo Marquette; Marius Ilié; Véronique Hofman; Paul Hofman

doi:10.3791/65190

Articolo metodologico

Sequenziamento ultraveloce di nuova generazione basato su ampliconi nel carcinoma polmonare non squamoso non a piccole cellule

DOI:

10.3791/65190

⸱

8 settembre 2023

Christophe Bontoux¹^,²^,³^,⁴^,⁵ , Virginie Lespinet-Fabre¹^,²^,³^,⁴ , Olivier Bordone¹^,²^,³^,⁴ , Virginie Tanga¹^,²^,³^,⁴ , Maryline Allegra¹^,²^,³^,⁴ , Myriam Salah¹^,²^,³^,⁴ , Salomé Lalvée¹^,²^,³^,⁴ , Samantha Goffinet¹^,²^,³^,⁴ , Jonathan Benzaquen³^,⁴^,⁵^,⁶ , Charles-Hugo Marquette³^,⁴^,⁵^,⁶ , Marius Ilié¹^,²^,³^,⁴^,⁵ , Véronique Hofman¹^,²^,³^,⁴^,⁵ , Paul Hofman¹^,²^,³^,⁴^,⁵

¹Laboratory of Clinical and Experimental Pathology, Centre Hospitalier Universitaire de Nice, Université Côte d’Azur, CHU de Nice, ²Hospital-Integrated Biobank (BB-0033-00025), Université Côte d'Azur, Hôpital Pasteur, CHU de Nice, ³Institut Hospitalo-Universitaire (IHU), RespirERA, Université Côte d'Azur, Hôpital Pasteur, CHU de Nice, ⁴FHU OncoAge, Université Côte d'Azur, ⁵Team 4, Institute of Research on Cancer and Aging (IRCAN), CNRS INSERM, Centre Antoine-Lacassagne, Université Côte d'Azur, ⁶Department of Pulmonary Medicine and Thoracic Oncology, Centre Hospitalier Universitaire de Nice, Université Côte d'Azur

In questo articolo

Sommario

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L'aumento dei biomarcatori molecolari da testare per la gestione della cura del carcinoma polmonare non squamoso non a piccole cellule (NS-NSCLC) ha spinto lo sviluppo di metodi di rilevamento molecolare rapidi e affidabili. Descriviamo un flusso di lavoro per la valutazione dell'alterazione genomica per i pazienti NS-NSCLC utilizzando un approccio di sequenziamento di nuova generazione (NGS) ultraveloce.

Abstract

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Il numero di alterazioni molecolari da testare per la terapia mirata dei pazienti con carcinoma polmonare non squamoso non a piccole cellule (NS-NSCLC) è aumentato significativamente negli ultimi anni. L'individuazione di anomalie molecolari è obbligatoria per la cura ottimale dei pazienti NS-NSCLC avanzati o metastatici, consentendo la somministrazione di terapie mirate con un miglioramento della sopravvivenza globale. Tuttavia, questi tumori sviluppano meccanismi di resistenza che sono potenzialmente bersaglio utilizzando nuove terapie. Alcune alterazioni molecolari possono anche modulare la risposta al trattamento. La caratterizzazione molecolare di NS-NSCLC deve essere eseguita in un breve tempo di risposta (TAT), in meno di 10 giorni lavorativi, come raccomandato dalle linee guida internazionali. Inoltre, l'origine delle biopsie tissutali per l'analisi genomica è diversa e le loro dimensioni diminuiscono continuamente con lo sviluppo di metodi e protocolli meno invasivi. Di conseguenza, i patologi sono chiamati a eseguire tecniche molecolari efficaci mantenendo una strategia di diagnosi efficiente e rapida. In questo articolo, descriviamo il flusso di lavoro ultraveloce di sequenziamento di nuova generazione (NGS) basato su ampliconi utilizzato nella pratica di routine quotidiana per la diagnosi dei pazienti con NS-NSCLC. Abbiamo dimostrato che questo sistema è in grado di identificare gli attuali bersagli molecolari utilizzati in medicina di precisione in oncologia toracica in un TAT appropriato.

Introduzione

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Nell'ultimo decennio, lo sviluppo di terapie mirate e immunoterapeutiche ha aumentato significativamente la sopravvivenza globale (OS) del carcinoma polmonare non a piccole cellule non squamoso (NS-NSCLC)^1,2. A questo proposito, il numero di geni obbligatori e bersagli molecolari da analizzare nel trattamento di NS-NSCLC è aumentato negli ultimi anni ^3,4.

Le attuali linee guida internazionali raccomandano di testare EGFR, ALK, ROS1, BRAF, NTRK, RET, e MET alla di....

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Protocollo

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Tutte le procedure sono state approvate dal comitato etico locale (Comitato etico per la ricerca umana, Centre Hospitalier Universitaire de Nice, Tumorothèque BB-0033-00025). È stato ottenuto il consenso informato da parte di tutti i pazienti per l'utilizzo di campioni e dati generati. Tutti i campioni sono stati prelevati da pazienti con diagnosi di NS-NSCLC in LPCE (Nizza, Francia) tra il 20 settembre e il 31 gennaio 2022 nell'ambito delle cure mediche.

1. Preparazione di campioni di DNA e RNA FFPE utilizzando uno strumento di purificazione automatizzato (API) (Tempo di elaborazione: 5 h 15 min)

Eseguire la pian....

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Risultati

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Utilizzando la procedura qui presentata, descritta in dettaglio nelle nostre recenti pubblicazioni²¹, abbiamo sviluppato un flusso di lavoro ottimale per la valutazione dell'alterazione molecolare come test riflesso nella pratica clinica di routine per la diagnosi in pazienti con NS-NSCLC utilizzando un approccio di sequenziamento di nuova generazione basato su ampliconi ultraveloci. Il flusso di lavoro molecolare del metodo è mostrato nella Figura 1. L'elenco dei gen.......

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Discussione

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Lo sviluppo di un approccio NGS ultraveloce basato su ampliconi come test riflesso per la valutazione dell'alterazione molecolare alla diagnosi di NS-NSLC in qualsiasi stadio è un'opzione ottimale per la rilevazione di tutti i biomarcatori raccomandati dalle linee guida ed emergenti in NS-NSCLC ^5,22,23. Mentre i metodi sequenziali (IHC, PCR, FISH) si concentrano solo su geni specifici e possono causare l'esaurimento del material.......

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Dichiarazioni

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Christophe Bontoux partecipa alle attività di relatori retribuiti e riceve vantaggi da Thermo Fisher Scientific. Paul Hofman partecipa alle attività di relatori retribuiti e riceve benefici e finanziamenti da Thermo Fisher Scientific.

Ringraziamenti

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Ringraziamo Thermo Fisher Scientific per averci dato la possibilità di utilizzare il loro dispositivo e i loro materiali.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Piastra a guscio rigido a 96 pozzetti trasparente	Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA)	4483354
Foglio adesivo per piastra PCR	Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA)	AB0626
AutoLys M tubo	Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA)	A38738	Provette per l'elaborazione di campioni FFPE
Codici a barre Genexus 1-32 HD	Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA)	A40261
Chip Genexus GX5 e accoppiatore Genexus	Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA)	A40269
Puntali per pipette Genexus	Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA)	A40266
Strumento di purificazione Genexus	Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA)	A48148	Strumento di purificazione automatizzato (API)
Kit di sequenziamento Genexus	Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA)	A40271
Strisce per modelli Genexus 3-GX5 e 4	Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA)	A40263
Sequenziatore integrato Genexus	Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA)	A45727
Ion Torrent Kit combinato di purificazione DNA/RNA Genexus FFPE	Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA)	A45539
Oncomine Pannello GX (OPA) per saggi di precisione (incluse le strisce 1 e 2-HD)	Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA)	A46291

Riferimenti

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Howlader, N., et al. The effect of advances in lung-cancer treatment on population mortality. New England Journal of Medicine. 383 (7), 640-649 (2020).
Melosky, B., et al. The rapidly evolving landscape of novel t....

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Sequenziamento basato su ampliconi Alterazioni molecolari Profilazione genomica Terapia mirata Tessuto FFPE Purificazione di DNA e RNA Rilevamento di varianti Oncologia toracica

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