Un protocollo efficiente per l'analisi CUT&amp;RUN di cellule satelliti di topo isolate da FACS

Kamar Ghaibour; Joe Rizk; Claudine Ebel; Tao Ye; Muriel Philipps; Valérie Schreiber; Daniel Metzger; Delphine Duteil

doi:10.3791/65215

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Articolo metodologico

Un protocollo efficiente per l'analisi CUT&RUN di cellule satelliti di topo isolate da FACS

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DOI:

10.3791/65215

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7 luglio 2023

Kamar Ghaibour^*¹ , Joe Rizk^*¹ , Claudine Ebel¹ , Tao Ye¹ , Muriel Philipps¹ , Valérie Schreiber¹ , Daniel Metzger¹ , Delphine Duteil¹

¹CNRS, Inserm, IGBMC UMR 7104- UMR-S 1258, Université de Strasbourg

^* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Di seguito viene presentato un protocollo efficiente per l'isolamento di cellule satelliti di cellule di arto di topo (FACS) attivato dalla fluorescenza, adattato allo studio della regolazione della trascrizione nelle fibre muscolari mediante scissione sotto bersagli e rilascio mediante nucleasi (CUT&RUN).

Abstract

Le analisi dell'intero genoma con popolazioni di piccole cellule sono un vincolo importante per gli studi, in particolare nel campo delle cellule staminali. Questo lavoro descrive un protocollo efficiente per l'isolamento di cellule satelliti dal muscolo dell'arto, un tessuto con un alto contenuto di proteine strutturali. I muscoli degli arti sezionati da topi adulti sono stati interrotti meccanicamente tritando in mezzo integrato con dispasi e collagenasi di tipo I. Al momento della digestione, l'omogenato è stato filtrato attraverso filtri cellulari e le cellule sono state sospese in un tampone FACS. La vitalità è stata determinata con una colorazione di vitalità fissabile e le cellule satelliti immunocolorate sono state isolate mediante FACS. Le cellule sono state lisate con Triton X-100 e i nuclei rilasciati sono stati legati a perle magnetiche di concanavalina A. I complessi nucleo/perla sono stati incubati con anticorpi contro il fattore di trascrizione o le modificazioni istoniche di interesse. Dopo i lavaggi, i complessi nucleo/microperla sono stati incubati con la proteina A-micrococcica nucleasi e la scissione della cromatina è stata iniziata con CaCl₂. Dopo l'estrazione del DNA, sono state generate e sequenziate librerie e i profili per il legame del fattore di trascrizione a livello di genoma e le modifiche covalenti degli istoni sono stati ottenuti mediante analisi bioinformatica. I picchi ottenuti per i vari marcatori istonici hanno mostrato che gli eventi di legame erano specifici per le cellule satelliti. Inoltre, l'analisi dei motivi noti ha rivelato che il fattore di trascrizione era legato alla cromatina attraverso il suo elemento di risposta affine. Questo protocollo è quindi adattato per studiare la regolazione genica nelle cellule satelliti dei muscoli degli arti dei topi adulti.

Introduzione

I muscoli striati scheletrici rappresentano in media il 40% del peso totale del corpo umano¹. Le fibre muscolari mostrano una notevole capacità di rigenerazione in caso di lesione, che è descritta dalla fusione di miociti di nuova formazione e dalla generazione di nuove miofibre che sostituiscono quelle danneggiate². Nel 1961, Alexander Mauro riportò una popolazione di cellule mononucleate che definì cellule satelliti³. Queste cellule staminali esprimono il fattore di trascrizione 7 (PAX7) e si trovano tra la lamina basale e il sarcolemma delle fibre muscolari⁴. È stato rip....