Method Article

Saggio di vitalità dei conidi di Trichoderma stromaticum all'interno di macrofagi di derivazione mononucleare del sangue periferico umano

DOI:

10.3791/65231

⸱

October 20th, 2023

 ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Immunobiology - Department of Biological Sciences, State University of Santa Cruz - UESC, 2Università Degli Studi di Genova

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La tecnica che prevede la fagocitosi dei conidi fungini da parte dei macrofagi è ampiamente utilizzata per gli studi che valutano la modulazione delle risposte immunitarie nei confronti dei funghi. Lo scopo di questo manoscritto è quello di presentare un metodo per valutare la fagocitosi e le capacità di clearance dei macrofagi di derivazione mononucleare del sangue periferico umano stimolati con Trichoderma stromaticum conidia.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

I macrofagi rappresentano una linea di difesa cruciale e sono responsabili della prevenzione della crescita e della colonizzazione di agenti patogeni in diversi tessuti. La fagocitosi conidiale è un processo chiave che consente di studiare gli eventi citoplasmatici e molecolari coinvolti nelle interazioni macrofago-patogeno, nonché di determinare il momento di morte dei conidi internalizzati. La tecnica che prevede la fagocitosi dei conidi fungini da parte dei macrofagi è ampiamente utilizzata per gli studi che valutano la modulazione delle risposte immunitarie nei confronti dei funghi. L'evasione della fagocitosi e la fuga dei fagosomi sono meccanismi di virulenza fungina. Di seguito, riportiamo i metodi che possono essere utilizzati per l'analisi della fagocitosi, della clearance e della vitalità di T. stromaticum conidia, un fungo che viene utilizzato come agente di biocontrollo e biofertilizzante ed è in grado di indurre infezioni umane. Il protocollo consiste in 1) coltura di Trichoderma , 2) lavaggio per ottenere conidi, 3) isolamento delle cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) utilizzando il metodo della soluzione di polisaccarosio e la differenziazione delle PBMC in macrofagi, 4) un metodo di fagocitosi in vitro utilizzando vetrini coprioggetti rotondi e colorazione e 5) un test di clearance per valutare la vitalità dei conidi dopo la fagocitosi dei conidi. In sintesi, queste tecniche possono essere utilizzate per misurare l'efficienza di eliminazione fungina dei macrofagi.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il genere Trichoderma (Ordine: Hypocreales, Famiglia: Hypocreaceae) è composto da funghi saprofiti ubiquitari che sono parassiti di altre specie fungine e sono in grado di produrre una serie di enzimi commercialmente utili1. Queste specie fungine sono utilizzate per la produzione di proteine eterologhe2, la produzione di cellulosa3, etanolo, birra, vino e carta4, nell'industria tessile5, nell'industria alimentare6 e in agricoltura come agenti di controllo biologico 7,8. Oltre all'interesse industriale per queste specie fungine, il crescente numero di infezioni nell'uomo ha conferito ad alcune specie di Trichoderma lo status di patogeni opportunisti9.

Trichoderma spp. cresce rapidamente in coltura, con colonie inizialmente bianche e cotonose che virano dal giallo verdastro al verde scuro10. Sono adattati a vivere in un'ampia gamma di condizioni di pH e temperatura, e le specie opportuniste sono in grado di sopravvivere a pH e temperature fisiologiche e, quindi, colonizzare diversi tessuti umani 11,12,13. È importante sottolineare che l'aumento del tasso di infezione da Trichoderma spp. può essere associato a fattori di virulenza e questi non sono ben studiati. Inoltre, gli studi incentrati sulla comprensione della risposta immunitaria contro le specie opportuniste di Trichoderma sono ancora rari.

Durante un'infezione, insieme ai neutrofili, i macrofagi rappresentano la linea di difesa responsabile della fagocitosi e, quindi, impediscono la crescita e la colonizzazione di agenti patogeni in diversi tessuti. Utilizzando recettori di riconoscimento di pattern, come i recettori Toll-like e i recettori della lectina di tipo C, i macrofagi fagocitano i funghi e li trasformano in fagolisosomi, promuovendo così un'esplosione respiratoria, il rilascio di citochine pro-infiammatorie e la distruzione dei microrganismi fagocitati14. Il meccanismo della fagocitosi, tuttavia, può essere influenzato ed eluso da diverse strategie microbiche, come la dimensione e la forma delle cellule fungine; la presenza di capsule che ostacolano la fagocitosi; diminuzione del numero di recettori che inducono la fagocitosi; il rimodellamento della struttura delle fibre di actina nel citoplasma; ostacolare la formazione di pseudopodi; e il fagosoma o il fagolisosoma fuoriescono dopo il processo di fagocitosi14.

Molti agenti patogeni, tra cui il Cryptococcus neoformans, usano i macrofagi come nicchia per sopravvivere nell'ospite, disseminarsi e indurre l'infezione15. Il saggio di fagocitosi e clearance viene utilizzato per valutare la risposta immunitaria contro i patogeni e per identificare le strategie microbiche impiegate per eludere il sistema immunitario innato 15,16,17. Questo tipo di tecnica può anche essere utilizzata per esaminare la cinetica differenziale della fagocitosi, dell'acidificazione ritardata dei fagosomi e dell'esplosione ossidativa che si traducono in una riduzione dell'uccisione fungina18.

Diversi metodi possono essere utilizzati per valutare la fagocitosi, la sopravvivenza fungina e l'evasione del processo di maturazione del fagosoma. Questi includono la microscopia a fluorescenza, che viene utilizzata per osservare la fagocitosi, la posizione cellulare e le molecole prodotte durante la fagocitosi19; citometria a flusso, che fornisce dati quantitativi sulla fagocitosi e viene utilizzata per valutare i diversi marcatori coinvolti nel processo20,21; microscopia intravitale, che viene utilizzata per valutare la cattura microbica e la maturazione dei fagosomi22; fagocitosi mediata da anticorpi, che viene utilizzata per valutare la specificità del processo di fagocitosi per un patogeno23; e altri 24,25,26,27.

Il protocollo qui presentato impiega un metodo comune, a basso costo e diretto che utilizza un microscopio ottico e un saggio di crescita su piastra per valutare la fagocitosi e l'uccisione dei conidi fungini. Questo protocollo fornirà ai lettori istruzioni dettagliate per l'esecuzione del saggio di fagocitosi e clearance utilizzando macrofagi di derivazione mononucleare del sangue periferico umano esposti a T. stromaticum. I PBMC sono stati utilizzati perché i conidi di Trichoderma sono applicati come biocontrollo contro i fitopatogeni e come biofertilizzante per le colture vegetali in tutto il mondo e hanno causato diverse infezioni umane, chiamate Trichodermosis. Oltre a ciò, ci sono solo due lavori precedenti incentrati sull'interazione tra Trichoderma conidi e il sistema immunitario umano, in cui abbiamo esaminato i neutrofili28 e l'autofagia nei macrofagi29. Questo articolo mostra in primo luogo come la fagocitosi dei conidi di T. stromaticum da parte di macrofagi derivati da PBMC possa essere studiata, e poi come la vitalità dei conidi inghiottiti possa essere valutata utilizzando semplici tecniche basate sulla microscopia. Questo protocollo può facilitare ulteriormente le indagini sulla risposta immunitaria associata ai macrofagi o sui meccanismi correlati alla modulazione del sistema immunitario.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Considerazioni etiche e soggetti umani
Tutti gli esperimenti con gli esseri umani descritti in questo studio sono stati condotti secondo la Dichiarazione di Helsinki e le leggi federali brasiliane e approvati dal Comitato Etico dell'Università Statale di Santa Cruz (codice di identificazione del progetto: 550.382/2014).

Il sangue periferico umano è stato raccolto da volontari sani della città di Ilhéus, Bahia, Brasile, non esposti ad attività lavorative legate al fungo studiato. Sono stati esclusi gli individui con condizioni mediche di salute segnalate o che fanno uso di farmaci. Tutti i soggetti hanno accettato volontariamente di partecipare e hanno firmato un modulo di consenso informato prima di essere inclusi in questo studio.

1. Preparazione dei reagenti e delle soluzioni

NOTA: Preparare i seguenti reagenti e soluzioni prima di procedere. Vedere la tabella dei materiali (TOM) per le informazioni sul fornitore del reagente e del materiale.

  1. Preparare una soluzione salina sterile bilanciata tamponata con fosfato 1x (PBS).
    NOTA: In questo protocollo, non è stato utilizzato PBS privo di endotossine.
  2. Preparare il terreno di agar destrosio di patate (PDA) e versare 20 ml in ciascuna capsula di Petri per la coltura di T. stromaticum . Preparare sei piastre con PDA per ogni donatrice e utilizzare una piastra per ogni condizione: 3 ore, 24 ore, 48 ore, 72 ore, 96 ore e 120 ore. Inoltre, utilizzare tre piastre per ciascun controllo: tre per il controllo Trichoderma e tre per il controllo medio R10. Utilizzare piastre di Petri da 60 mm x 15 mm o 100 mm x 15 mm per un recupero ottimale dei conidi.
  3. Sterilizzare il glicerolo al 100%.
  4. Preparare un terreno R10 per la coltura cellulare: terreno RPMI integrato con il 10% di siero fetale bovino e l'1% di antibiotico (penicillina/streptomicina).
  5. Sterilizzare l'acqua distillata per la lisi cellulare.
  6. Preparare l'acqua a pH 7,0 per il processo di colorazione.
    NOTA: Se necessario, regolare il pH utilizzando un pHmetro e soluzioni di NaOH 0,1 M/L e HCl 0,1 M/L.
  7. Sterilizzare il vetrino coprioggetti rotondo (13 mm) e le pinzette.

2. Coltura e lavorazione del Trichoderma stromaticum

  1. Preparazione di un ceppo madre (M1) di T. stromaticum:
    NOTA: È necessario un ceppo madre (M1) per garantire che tutti gli esperimenti siano eseguiti dalla coltura della stessa generazione fresca (F1).
    1. Coltivare un inoculo di T. stromaticum in piastre di Petri con PDA a 28 °C al buio per 7-10 giorni fino a quando i conidi non vengono osservati e la coltura diventa verde.
    2. Lavare la coltura di T. stromaticum. Aggiungere 3-5 mL di PBS alla superficie di coltura utilizzando una pipetta. Raccogliere il PBS dalla piastra e distribuirlo nuovamente sulla coltura per rimuovere gradualmente i conidi utilizzando la pipetta. Ripetere questo processo quanto necessario fino a quando la sospensione non diventa verde scuro.
      NOTA: In alternativa, si suggerisce un lavaggio delicato della coltura aggiungendo 3-5 mL di PBS alla piastra seguito dall'esecuzione di un movimento circolare fino a quando la sospensione diventa verde per recuperare i conidi. Con il pipettaggio ripetuto, è possibile raccogliere più conidi.
    3. Trasferire la sospensione recuperata dalla piastra in una provetta sterile da 15 mL con una pipetta. Ripetere i passaggi 2.1.2-2.1.3 tutte le volte necessarie per ottenere più conidi.
    4. Centrifugare la sospensione a 1.160 x g per 5 minuti a 12 °C e risospendere il pellet in 5 mL di PBS. Ripetere questa fase (2.1.4) tre volte per ottenere una sospensione priva di ife.
      NOTA: Per risospendere correttamente il pellet, dopo la centrifugazione, si consiglia un breve vortex.
    5. Risospendere il pellet finale in 2-3 mL di PBS e contare i conidi in una camera Neubauer utilizzando una diluizione di 1:100 o 1:1.000.
      NOTA: In condizioni ottimali, è possibile recuperare dalla coltura una concentrazione finale di 2 x 108 conidi/mL. La valutazione della vitalità dei conidi utilizzando il metodo di esclusione del blu tripano è facoltativa.
    6. Aliquotare la sospensione in provette sterili da 1,5 mL aggiungendo 0,5 mL della sospensione dei conidi (dal punto 2.1.5) a ciascuna provetta. Quindi, aggiungere 0,5 mL di glicerolo sterile al 100% per ottenere scorte M1. Vorticare brevemente, identificare i tubi e conservare a -20 °C o -80 °C.
  2. Coltura di T. stromaticum e ottenimento dei conidi per l'esperimento
    1. Piastra 10 μL della sospensione M1 (preparata nella fase 2.1) in PDA a 28 °C al buio per 7-10 giorni fino a quando i conidi sono osservati e la coltura diventa verde per ottenere la generazione F1 fresca.
      NOTA: Per garantire una coltura di T. stromaticum fresca per l'esperimento, valutare il tempo necessario per la crescita del fungo e il tempo necessario per la differenziazione dei macrofagi.
    2. Raccogliere i conidi, ripetendo i passaggi 2.1.2-2.1.4.
    3. Risospendere il pellet finale in 2-3 mL di PBS. Valutare la vitalità dei conidi utilizzando il metodo di esclusione del blu tripano o contare i conidi come indicato al punto 2.1.5.

3. Isolamento delle cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC)

NOTA: Le PBMC sono ottenute con il metodo della barriera di densità utilizzando una soluzione di polisaccarosio di densità 1,077 g/mL30.

  1. Aliquotare 15 mL della soluzione di polisaccarosio in una provetta da 50 mL per ogni campione del donatore che verrà raccolto.
  2. Raccogliere 20 ml di sangue da ciascun donatore utilizzando da tre a quattro provette EDTA. Recluta un minimo di quattro donatori per esperimento. Non raccogliere il sangue dei donatori; Invece, usa ogni campione separatamente come replica biologica. Per ogni donatore, trasferire il sangue in una provetta da 50 mL e aggiungere PBS per ottenere un volume finale di 35 mL.
  3. Trasferire lentamente la sospensione di sangue (fase 3.2) lungo la parete della provetta contenente la soluzione di polisaccarosio (fase 3.1) per formare una sospensione bifasica.
    NOTA: Per evitare che il sangue si mescoli con la soluzione di polisaccarosio, aggiungere lentamente il sangue. Si raccomanda l'uso di un minimo di 7 ml di sangue di ciascun donatore per l'isolamento PBMC.
  4. Centrifugare immediatamente la provetta contenente la sospensione bifasica a 1.600 x g per 30 minuti a 24 °C. Programmare la centrifugazione delle PBMC: utilizzare l'accelerazione 1 e la decelerazione 0 per evitare un brusco arresto della centrifugazione.
  5. Osservare la formazione di un anello bianco contenente le PBMC dopo la centrifugazione. I globuli rossi e i granulociti risiedono nello strato inferiore, lo strato successivo contiene la soluzione di polisaccarosio e le PBMC risiedono nell'anello bianco tra la soluzione di polisaccarosio e il plasma (strato superiore). Raccogliere l'anello bianco aspirando delicatamente con una pipetta o una pipetta Pasteur sterile in modo da non impigliare globuli rossi, plasma o soluzione di polisaccarosio e trasferirlo in una provetta da 15 ml.
  6. Aggiungere PBS alla provetta da 15 mL contenente le PBMC per ottenere un volume finale di 10 mL. Omogeneizzare la sospensione e centrifugare la provetta a 1.600 x g per 30 minuti a 24 °C.
  7. Lavare le cellule tre volte a 1.600 x g per 5 minuti a 24 °C con 10 mL di PBS. Quindi, risospendere il pellet finale in 2 mL di terreno R10.
  8. Valutare la vitalità cellulare utilizzando il metodo di esclusione del blu di tripano e contare le cellule in una camera di Neubauer.

4. Cinetica della fagocitosi

NOTA: I macrofagi di derivazione mononucleare del sangue periferico umano sono trattati con conidi di T. stromaticum a una molteplicità di infezione (MOI) di 1:10 o solo terreno R10 come controllo. La molteplicità dell'infezione (MOI) rappresenta il rapporto tra gli agenti infettivi aggiunti ai bersagli di infezione ed è presentata come numeri assoluti: MOI = agenti:bersagli31. In questo caso, utilizziamo 1 conidi di T. stromaticum (agente) per 10 macrofagi (bersagli). Successivamente, le cellule vengono incubate a 37 °C e al 5% di CO2 per diversi periodi di tempo (3 h, 24 h, 48 h, 72 h, 96 h e 120 h). Successivamente, viene utilizzato un vetrino coprioggetti rotondo per visualizzare al microscopio i macrofagi aderenti coinvolti nel processo di fagocitosi. Viene fornita una figura di disegno sperimentale (Figura 1).

NOTA: Si consiglia l'uso di piastre a 24 pozzetti.

  1. Trattamento dei macrofagi di origine umana con T. stromaticum conidia
    1. Aggiungere un vetrino coprioggetti rotondo sterile (13 mm) a ciascun pozzetto utilizzando una pinzetta sterile.
    2. Regolare il volume della sospensione cellulare ottenuta nei passaggi 3,7-3,8 per placcare 8 x 105 cellule per pozzetto fino a un volume finale di 1 mL con terreno R10. Utilizzare un microscopio invertito per valutare la morfologia cellulare.
      NOTA: Le cellule devono essere sospese nel terreno e avere una morfologia arrotondata.
    3. Incubare le cellule a 37 °C in un'atmosfera di CO2 al 5% per 7 giorni e sostituire il terreno con terreno fresco R10 ogni 2 giorni per la differenziazione dei monociti in macrofagi32. Osservare la morfologia cellulare utilizzando un microscopio invertito. I macrofagi presenteranno morfologia fusiforme, con forme appiattite ed estese; Si può osservare anche un aumento del rapporto citoplasmatico e la presenza di pseudopodi. Cerca macrofagi aderenti di derivazione mononucleare.
      NOTA: Una percentuale molto piccola di monociti indifferenziati può rimanere sospesa nel terreno.
    4. Rimuovere il terreno di ciascun pozzetto utilizzando una pipetta e lavare le cellule con 1 mL di PBS per rimuovere detriti e cellule non aderenti.
    5. Utilizzare la sospensione preparata nella fase 2.2 per preparare una nuova sospensione di T. stromaticum conidia ad una concentrazione finale di 8 x 104 conidi/mL in terreno R10.
    6. Aggiungere 1 mL della sospensione di conidi preparata nella fase 4.1.5 a ciascun pozzetto di trattamento (3 h, 24 h, 48 h, 72 h, 96 h e 120 h) per ottenere un MOI di 1:10. Ai controlli, aggiungere solo 1 mL di terreno R10 al pozzetto.
    7. Sfidare i macrofagi per 3 ore con T. stromaticum conidi a 37 °C in un'atmosfera di CO2 al 5%. Dopo 3 ore, rimuovere il terreno e lavare le cellule per rimuovere i conidi non fagocitati.
    8. Aggiungere 1 mL di terreno R10 a ciascun pozzetto e incubare la piastra per tempi diversi (3 ore, 24 ore, 48 ore, 72 ore, 96 ore e 120 ore) a 37 °C in un'atmosfera di CO2 al 5%.
  2. Colorazione e analisi
    1. Al termine dell'incubazione corrispondente (passaggio 4.1.8), rimuovere il terreno da ciascun pozzetto e aggiungere 1 mL di PBS al pozzetto.
    2. Rimuovere i vetrini coprioggetti rotondi dai pozzetti utilizzando una pinzetta sterile e un ago per colorare con un kit di colorazione.
      NOTA: In alternativa, la colorazione può essere eseguita utilizzando la colorazione May Grünwald-Giemsa33.
    3. A ciascuno dei vetrini coprioggetti rotondi, aggiungere fissatore di macchie (5 s), colorante 1 (5 s), colorante 2 (2 s) e acqua tamponata pH 7,0 (5 s), che sono i componenti del kit di colorazione. Attendere che siano asciutti e fissare i vetrini coprioggetti su un vetrino utilizzando un agente di montaggio.
    4. Quantificare il risultato: contare un totale di 100 macrofagi (Mø) per ogni condizione temporale. Utilizzando un microscopio ottico, contare il numero di macrofagi con conidi fagocitati utilizzando un obiettivo 100x e olio da immersione (equazione [1]).
      figure-protocol-1 (1)
    5. Ottenere il numero di conidi fagocitati per macrofago: correlare i conidi presenti in 100 macrofagi diviso per il numero di macrofagi con almeno un conidio fagocitato (equazione [2])34.
      figure-protocol-2 (2)
      NOTA: Per valutare e contare i conidi, è possibile utilizzare il software ImageJ35.
    6. Fotografare la fagocitosi da ogni campione e condizione temporale utilizzando obiettivi 40x e 100x per presentare i risultati.

figure-protocol-3
Figura 1: Rappresentazione schematica del saggio di fagocitosi e vitalità conidiale utilizzando macrofagi di derivazione mononucleare del sangue periferico umano. (versetti da 1 a 10) Saggio di fagocitosi: Il T. stromaticum deve essere coltivato in PDA e i conidi vengono recuperati lavando la piastra con PBS. Le PBMC devono essere isolate con il metodo della barriera di densità utilizzando il protocollo descritto, coltivate in piastre a 24 pozzetti con vetrini coprioggetti rotondi sterili per 7 giorni per la differenziazione in macrofagi e quindi trattate con un MOI di 1:10 con intervalli di tempo diversi. I vetrini coprioggetti rotondi vengono rimossi e colorati con il kit di colorazione e i risultati vengono analizzati al microscopio ottico. (1-8,11-13) Saggio di vitalità dei conidi: dopo l'isolamento, i PBMC vengono coltivati in piastre da 24 pozzetti senza vetrini coprioggetti rotondi per 7 giorni per la differenziazione in macrofagi e quindi trattati con un MOI di 1:10 per diversi intervalli di tempo. Le cellule devono essere lisate mediante incubazione con acqua distillata; la sospensione viene quindi centrifugata, quindi il pellet risospeso viene placcato in PDA per analizzare la cinetica di crescita del Trichoderma. Questa figura è stata progettata utilizzando un database di immagini. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

5. Saggio di vitalità conidiale dopo fagocitosi

NOTA: Viene fornita una figura di disegno sperimentale (Figura 1).

NOTA: Utilizzare piastre a 24 pozzetti.

  1. Sfida i macrofagi di origine umana con T. stromaticum conidia.
    1. Ripetere i passaggi 4.1.2-4.1.8 per differenziare i monociti e trattare i macrofagi con T. stromaticum conidia.
      NOTA: Non utilizzare vetrini coprioggetti rotondi nei pozzetti. Utilizzare gli stessi intervalli di tempo utilizzati per saggiare la cinetica di fagocitosi in modo che la fagocitosi possa essere correlata con la vitalità dei conidi.
    2. Valutare l'impatto del terreno R10 sulla crescita di T. stromaticum utilizzando pozzetti con la sospensione preparata al punto 4.1.5 (terreno R10 + conidi) come controllo.
  2. Saggio di vitalità conidiale
    1. Rimuovere il terreno dopo ogni periodo di incubazione (3 ore, 24 ore, 48 ore, 72 ore, 96 ore e 120 ore) e lavare le cellule due volte con PBS per rimuovere i conidi che non sono stati fagocitati.
      NOTA: Il controllo contenente R10 medio + conidi non deve essere lavato.
    2. Aggiungere 0,5 mL di acqua distillata sterile in ciascun pozzetto e incubare la piastra a 37 °C e 5% di CO2 per 30 min. Trascorso questo tempo, osservare la morfologia delle cellule al microscopio invertito per assicurarsi che le cellule siano state lisate.
    3. Raccogliere la sospensione e trasferirla in provette da 1,5 ml. Centrifugare la sospensione utilizzando una mini centrifuga a 6.000 x g per 5 minuti a temperatura ambiente.
    4. Scartare con cura il surnatante, risospendere il pellet in 10 μL di acqua distillata sterile e inoculare 10 μL di sospensione nella piastra contenente PDA a 28 °C al buio.
    5. Preparare un controllo positivo per la crescita di T. stromaticum : utilizzare la sospensione di T. stromaticum conidi (fase 2.2) per preparare una nuova sospensione con una concentrazione finale di 8 x 106 conidi/mL. Piastra 10 μL di questa sospensione in PDA a 28 °C al buio.
      NOTA: 10 μL di questa sospensione conterranno lo stesso numero di conidi (8 x 104) che è stato utilizzato per infettare i macrofagi di derivazione mononucleare del sangue. La differenza tra questo controllo positivo e quello menzionato al punto 5.1.2 è che il controllo menzionato al punto 5.1.2 viene utilizzato per valutare il possibile impatto del terreno R10 sulla crescita del Trichoderma durante il periodo di fagocitosi. Questo controllo positivo nella fase 5.2.5 utilizzando la sospensione di T. stromaticum conidia raccolta in PBS rappresenta un controllo per la crescita di Trichoderma senza l'influenza del terreno R10 per riflettere il modo in cui il fungo cresce naturalmente. Utilizzando questo controllo, è possibile valutare se il terreno R10 influenza la crescita del Trichoderma .
    6. Osservare ogni giorno la cinetica di crescita di T. stromaticum nel PDA e fotografare la coltura.
    7. Analisi: Due punti possono essere utilizzati per valutare i risultati: 1) il tempo (in giorni) necessario affinché la coltura occupi l'intera piastra di coltura, e 2) il tempo (in giorni) fino alla comparsa della caratteristica pigmentazione verde dei conidi di T. stromaticum in coltura.

6. Analisi statistica

  1. Utilizzare un test di Kruskal-Wallis per determinare differenze statisticamente significative tra gli 8 gruppi/trattamenti. Si consideri p < 0,05 come statisticamente significativo. Tutti i dati sono presentati come medie ± deviazione standard (SD). Nelle figure, # indica la significatività statistica a p < 0,05.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La tecnica che prevede la fagocitosi dei conidi fungini da parte dei macrofagi è ampiamente utilizzata per gli studi che valutano la modulazione delle risposte immunitarie nei confronti dei funghi. Abbiamo utilizzato la fagocitosi dei conidi di T. stromaticum per valutare la vitalità dei conidi dopo la fagocitosi, poiché l'evasione della fagocitosi e la fuga dei fagosomi sono meccanismi di virulenza fungina. I ricercatori dovrebbero eseguire queste tecniche come uno dei primi saggi quando studiano una specie di ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Per diversi patogeni fungini, tra cui Aspergillus fumigatus, Cryptococcus, Candida albicans e altri, la fagocitosi conidiale o del lievito è un processo chiave che consente di studiare gli eventi citoplasmatici e molecolari nelle interazioni macrofago-patogeno, nonché di determinare il momento della morte dei conidi internalizzati 14,39,40. La fagocitosi è il processo chiave nell'interazione Tricho...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutti gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo lavoro è stato sostenuto dalle seguenti istituzioni finanziarie brasiliane: Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado da Bahia (FAPESB) con sovvenzioni RED0011/2012 e RED008/2014. U.R.S., J.O.C. e M.E.S.M. riconoscono la borsa di studio concessa rispettivamente da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) e FAPESB.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Provette da centrifuga da 15 mLCorningCLS431470Provette da centrifuga da 15 mL, polipropilene, fondo conico con coperchio, sterili singolarmente
Piastra per coltura cellulare a fondo piatto a 24 pozzettiKasviK12-024Realizzato in polistirene con identificazione alfanumerica; La piastra per colture cellulari è priva di DNasi, RNasi e pirogeni e priva di sostanze citotossiche; Sterilizzato con radiazioni gamma;
Incubatore CO2 per colture cellulariSanyo303082Un incubatore a CO2 serve a creare e controllare condizioni simili a quelle di un corpo umano, consentendo così la crescita e la proliferazione in vitro di diversi tipi di cellule.
Microprovetta da centrifuga (tipo eppendorf) 1,5 mLCapp5101500Realizzata in polipropilene, con tappo attaccato alla provetta per l'apertura e la chiusura con una sola mano. Ha un interno lucidato contro l'adesione delle proteine e per la visibilità del campione, essendo privo di DNasi, RNasi e pirogeni Vetrino
coprioggetti circolare 15 mmOlenK5-0015I vetrini coprioggetti circolari sono utilizzati per le tecniche di microscopia nelle colture cellulari. Realizzato in vetro traslucido super trasparente; con spessore di 0,13 mm
Classe II Tipo B2 (scarico totale) Cabine di biosicurezzaEsco Lifesciences gruppo2010274Airstream Classe II Tipo B2 Le cappe di biosicurezza (AB2) forniscono protezione del prodotto, dell'operatore e dell'ambiente e sono adatte per lavorare con tracce di sostanze chimiche tossiche e agenti assegnati ai livelli di sicurezza biologica I, II o III. In un armadio di Classe II di Tipo B2, tutta l'aria in entrata e in discesa viene scaricata dopo la filtrazione HEPA/ULPA nell'ambiente esterno senza ricircolo sulla superficie di lavoro.
Destrosio Agar di patata medioMerck145Patata L'agar destrosio è utilizzato nella coltivazione e nel conteggio di lieviti e funghi
Provetta per prelievo di sangue sottovuoto EDTAFirstLabFL5-1109LEDTA è l'anticoagulante raccomandato per le routine ematologiche in quanto è il miglior anticoagulante per preservare la morfologia cellulare.
EntellanMerck1.07961 Agente fissativo; Entellan è un mezzo di montaggio senz'acqua per il montaggio permanente per microscopia.
Siero fetale bovinoGibcoA2720801Il siero fetale bovino (FBS) è un  Integratore universale per la crescita di terreni di coltura cellulare e tissutale. L'FBS è un cocktail naturale della maggior parte dei fattori necessari per l'attaccamento, la crescita e la proliferazione cellulare, efficace per la maggior parte dei tipi di cellule umane e animali (compresi gli insetti).
Flaticon  database di immagini
GliceroloMerck24900988 L'agentecrioprotettore glicerolo viene utilizzato per il congelamento di cellule e spore
polisaccarosioHistopaque-1077
Immagine J  Software di analisi delle immagini
Vetrini per microscopiaPrecision7105Vetrino per microscopia 26 x 76 mm Opaco Spessore lappato da 1,0 a 1,2 mm. Realizzato in vetro ottico speciale e confezionato con divisore in carta seta con trasparenza di alta qualità priva di imperfezioni
Mini centrifugaPrismaC1801La mini centrifuga Prism è stata progettata per essere estremamente compatta con un ingombro eccezionalmente ridotto. Include 2 rotori intercambiabili a sgancio rapido che girano fino a 6000 giri/min. Un freno elettronico fornisce una rapida decelerazione e il coperchio ad apertura automatica consente un facile accesso al campione, riducendo i tempi di manipolazione.
Camera NeubauerKasviK5-0011La camera di conteggio Neubauer viene utilizzata per il conteggio di celle o altre particelle sospese.
Veloce panottico Laborclin620529Laborclin's panoptic fast c è un kit per la colorazione rapida in ematologia
Soluzione di penicillina/streptomicina - 10.000ULGC- Biotecnologia BR3011001viene utilizzato per evitare possibili contaminazioni da manipolazioni esterne al flusso laminare.
Piastra Petri 90 x 15 mm SmoothCralplast18248Piastra Petri monouso; Realizzato in polistirene (PS) altamente trasparente; fondo piatto; Liscio; Dimensioni: 90 x 15 mm.
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)thermo fisher Scientific10010001PBS è una soluzione salina a base acquosa con una formulazione semplice. È isotonico e non tossico per la maggior parte delle cellule. Include tampone cloruro di sodio e fosfato ed è formulato per prevenire lo shock osmotico mantenendo l'equilibrio idrico delle cellule viventi.
Pipetta Pasteur 3 mL SterileAccumaxAP-3-B-SSTERILE ACCUMAX PASTEUR 3 ML PIPETTA con capacità di 3 mL, realizzata in polietilene trasparente a bassa densità (LDPE) e centrifuga
refrigerataThermo ScientificTS-HM16RLa centrifuga refrigerata Thermo Scientific Heraeus Megafuge 16R è una centrifuga refrigerata con il pannello di controllo di facile utilizzo che facilita la preimpostazione della velocità, del valore RCF, tempo di esecuzione,  temperatura e profilo di marcia. Il Megafuge 16R può raggiungere velocità massime di  15.200 giri/min e RCF massimo di 25.830 x g.
RPMI-1640 MediumMerckMFCD00217820HEPES Modification, con L-glutammina e 25 mM HEPES, senza bicarbonato di sodio, in polvere, adatto per colture cellulari
Le micropipette a canale singoloEppendorfZ683809Le micropipette a canale singolo sono utilizzate per trasferire e misurare con precisione quantità molto piccole di liquidi.
Puntale per MicropipettatoreCorning4894Capacità di 10 &; micro; L e 1.000 µ L
Microscopio invertito trioculareLABOMEDVU-7125500Permette di osservare le cellule all'interno di provette e flaconi, senza doverle aprire, evitando così problemi di contaminazione.
Soluzione di antibiotico sterile singolarmente autoclavabile

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Samuels, G. J. Trichoderma: A review of biology and systematics of the genus. Mycological Research. 100 (8), 923-935 (1996).
  2. Nevalainen, H., Peterson, R. Chapter 7 - Heterologous expression of proteins in Trichoderma. Biotechnology and Biology of Trichoderma. Gupta, V. K., Schmoll, M., Herrera-Estrella, A., Upadhyay, R. S., Druzhinina, I., Tuohy, M. G. , Oxford, UK. (2014).
  3. Do Vale, L. H. F., Filho, E. X. F., Miller, R. N. G., Ricart, C. A. O., de Sousa, M. V. Chapter 16 - Cellulase systems in Trichoderma: An overview. Biotechnology and Biology of Trichoderma. Gupta, V. K., Schmoll, M., Herrera-Estrella, A., Upadhyay, R. S., Druzhinina, I., Tuohy, M. G. , Oxford, UK. (2014).
  4. Ferreira, N. L., Margeot, A., Blanquet, S., Berrin, J. G. Chapter 17 - Use of cellulases from Trichoderma reesei in the twenty-first century part I: Current industrial uses and future applications in the production of second ethanol generation. Biotechnology and Biology of Trichoderma. Gupta, V. K., Schmoll, M., Herrera-Estrella, A., Upadhyay, R. S., Druzhinina, I., Tuohy, M. G. , Oxford, UK. (2014).
  5. Puranen, T., Alapuranen, M., Vehmaanperä, J. Chapter 26 - Trichoderma enzymes for textile industries. Biotechnology and Biology of Trichoderma. Gupta, V. K., Schmoll, M., Herrera-Estrella, A., Upadhyay, R. S., Druzhinina, I., Tuohy, M. G. , Oxford, UK. (2014).
  6. Kunamneni, A., Plou, F. J., Alcalde, M., Ballesteros, A. Chapter 24 - Trichoderma enzymes for food industries. Biotechnology and Biology of Trichoderma. Gupta, V. K., Schmoll, M., Herrera-Estrella, A., Upadhyay, R. S., Druzhinina, I., Tuohy, M. G. , Oxford, UK. (2014).
  7. Mukherjee, P. K., Horwitz, B. A., Herrera-Estrella, A., Schmoll, M., Kenerley, C. M. Trichoderma research in the genome era. Annual Review of Phytopathology. 51 (1), 105-129 (2013).
  8. Mukherjee, M., et al. Trichoderma-plant-pathogen interactions: Advances in genetics of biological control. Indian Journal of Microbiology. 52 (4), 522-529 (2012).
  9. dos Santos, U. R., dos Santos, J. L. Trichoderma after crossing kingdoms: Infections in human populations. Journal of Toxicology and Environmental Health, Part B. 26 (2), 97-126 (2023).
  10. Asis, A., et al. Identification patterns of Trichoderma strains using morphological characteristics, phylogenetic analyses and lignocellulolytic activities. Molecular Biology Reports. 48 (4), 3285-3301 (2021).
  11. Antal, Z., et al. Comparative study of potential virulence factors in human pathogenic and saprophytic Trichoderma longibrachiatum strains. Acta Microbiologica et Immunologica Hungarica. 52 (3-4), 341-350 (2005).
  12. Hatvani, L., Manczinger, L., Vágvölgyi, C., Kredics, L. Trichoderma as a human pathogen. Trichoderma: Biology and Applications. Mukherjee, P. K., Horwitz, B. A., Singh, U. S., Mukherjee, M., Schmoll, M. , Wallingford, UK. (2013).
  13. Kredics, L., et al. Clinical importance of the genus Trichoderma: A review. Acta Microbiologica et Immunologica Hungarica. 50 (2-3), 105-117 (2003).
  14. Erwig, L. P., Gow, N. A. R. Interactions of fungal pathogens with phagocytes. Nature Reviews Microbiology. 14 (3), 163-176 (2016).
  15. Nicola, A. M., Casadevall, A. In vitro measurement of phagocytosis and killing of Cryptococcus neoformans by macrophages. Methods in Molecular Biology. 844, 189-197 (2012).
  16. Medina, E., Goldmann, O. In vivo and ex vivo protocols for measuring the killing of extracellular pathogens by macrophages. Current Protocols in Immunology. , Chapter 14, Unit 14 1-17 (2011).
  17. Drevets, D. A., Canono, B. P., Campbell, P. A. Measurement of bacterial ingestion and killing by macrophages. Current Protocols in Immunology. 109, 1-17 (2015).
  18. Gresnigt, M. S., et al. Differential kinetics of Aspergillus nidulans and Aspergillus fumigatus phagocytosis. Journal of Innate Immunity. 10 (2), 145-160 (2018).
  19. Steinberg, B. E., Grinstein, S. Analysis of macrophage phagocytosis: Quantitative assays of phagosome formation and maturation using high-throughput fluorescence microscopy. Methods in Molecular Biology. 531, 45-56 (2009).
  20. Yan, Q., Ahn, S. H., Fowler, V. G. Macrophage phagocytosis assay of Staphylococcus aureus by flow cytometry. Bio-Protocol. 5 (4), 1406(2015).
  21. Marr, K. A., Koudadoust, M., Black, M. Early events in macrophage killing of Aspergillus fumigatus conidia New flow cytometric viability assay. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 8 (6), 1240-1247 (2001).
  22. Surewaard, B. G. J., Kubes, P. Measurement of bacterial capture and phagosome maturation of Kupffer cells by intravital microscopy. Methods. 128, 12-19 (2017).
  23. Siggins, M. K., et al. Differential timing of antibody-mediated phagocytosis and cell-free killing of invasive African Salmonella allows immune evasion. European Journal of Immunology. 44 (4), 1093-1098 (2014).
  24. Cannon, G. J., Swanson, J. A. The macrophage capacity for phagocytosis. Journal of Cell Science. 101 (4), 907-913 (1992).
  25. Harvath, L., Terle, D. A. Assay for phagocytosis. Methods in Molecular Biology. 115, 281-290 (1999).
  26. dos Santos, A. G., et al. Trichoderma asperelloides spores downregulate dectin1/2 and TLR2 receptors of mice macrophages and decrease Candida parapsilosis phagocytosis independent of the M1/M2 polarization. Frontiers in Microbiology. 8, 1681(2017).
  27. Souza, J. A. M., et al. Characterization of Aspergillus fumigatus extracellular vesicles and their effects on macrophages and neutrophils functions. Frontiers in Microbiology. 10, 2008(2019).
  28. Oliveira-Mendonça, L. S., et al. Inhibition of extracellular traps by spores of Trichoderma stromaticum on neutrophils obtained from human peripheral blood. Molecular Immunology. 141, 43-52 (2022).
  29. Oliveira-Mendonça, L. S., et al. Trichoderma stromaticum spores induce autophagy and downregulate inflammatory mediators in human peripheral blood-derived macrophages. Current Research in Microbial Sciences. 3, 100145(2022).
  30. Johnston, L., Harding, S. A., La Flamme, A. C. Comparing methods for ex vivo characterization of human monocyte phenotypes and in vitro responses. Immunobiology. 220 (12), 1305-1310 (2015).
  31. Abedon, S. T., Bartom, E. Multiplicity of infection. Brenner's Encyclopedia of Genetics. Second Edition. Maloy, S., Hughes, K. , Academic Press. Cambridge, MA. (2013).
  32. Rios, F. J., Touyz, R. M., Montezano, A. C. Isolation and differentiation of human macrophages. Methods in Molecular Biology. 1527, 311-320 (2017).
  33. Lombard, Y., Giaimis, J., Makaya-Kumba, M., Fonteneau, P., Poindron, P. A new method for studying the binding and ingestion of zymosan particles by macrophages. Journal of Immunological Methods. 174 (1-2), 155-165 (1994).
  34. Ghoneum, M., Gollapudi, S. Phagocytosis of Candida albicans by metastatic and non metastatic human breast cancer cell lines in vitro. Cancer Detection and Prevention. 28 (1), 17-26 (2004).
  35. Nunes, J. P. S., Dias, A. A. M. ImageJ macros for the user-friendly analysis of soft-agar and wound-healing assays. BioTechniques. 62 (4), 175-179 (2017).
  36. Alves-Filho, E. R., et al. The biocontrol fungus Trichoderma stromaticum downregulates respiratory burst and nitric oxide in phagocytes and IFN-gamma and IL-10. Journal of Toxicology and Environmental Health - Part A: Current Issues. 74 (14), 943-958 (2011).
  37. Slesiona, S., et al. Persistence versus escape: Aspergillus terreus and Aspergillus fumigatus employ different strategies during interactions with macrophages. PLoS One. 7 (2), 31223(2012).
  38. Johnston, S. A., May, R. C. Cryptococcus interactions with macrophages: Evasion and manipulation of the phagosome by a fungal pathogen. Cellular Microbiology. 15 (3), 403-411 (2013).
  39. Alonso, M. F., et al. The nature of the fungal cargo induces significantly different temporal programmes of macrophage phagocytosis. The Cell Surface. 8, 100082(2022).
  40. Brakhage, A. A., Bruns, S., Thywissen, A., Zipfel, P. F., Behnsen, J. Interaction of phagocytes with filamentous fungi. Current Opinion in Microbiology. 13 (4), 409-415 (2010).
  41. Dos Santos, U. R., et al. Exposition to biological control agent Trichoderma stromaticum increases the development of cancer in mice injected with murine melanoma. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 252(2020).
  42. Wang, G., et al. Exopolysaccharide from Trichoderma pseudokoningii induces macrophage activation. Carbohydrate Polymers. 149, 112-120 (2016).
  43. Xu, Y., et al. Exopolysaccharide from Trichoderma pseudokoningii promotes maturation of murine dendritic cells. International Journal of Biological Macromolecules. 92, 1155-1161 (2016).
  44. Schmoll, M., Esquivel-Naranjo, E. U., Herrera-Estrella, A. Trichoderma in the light of day - Physiology and development. Fungal Genetics and Biology. 47 (11), 909-916 (2010).
  45. Zhang, G., Li, D. Trichoderma longibrachiatum-associated skin inflammation and atypical hyperplasia in mouse. Frontiers in Medicine. 9, 865722(2022).
  46. Paredes, K., Capilla, J., Mayayo, E., Guarro, J. Virulence and experimental treatment of Trichoderma longibrachiatum, a fungus refractory to treatment. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 60 (8), 5029-5032 (2016).
  47. Perkhofer, S., Speth, C., Dierich, M. P., Lass-Flörl, C. In vitro determination of phagocytosis and intracellular killing of Aspergillus species by mononuclear phagocytes. Mycopathologia. 163 (6), 303-307 (2007).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Trichoderma StromaticumConidial ViabilityMacrophage PhagocytosisPeripheral Blood MononuclearFungal ClearanceIn Vitro PhagocytosisConidia IsolationHuman MacrophagesPhagocytosis AssayFungal Pathogenesis

Related Articles