Articolo metodologico

Un metodo preciso e quantificabile per raccogliere emolinfa da piccoli artropodi

DOI:

10.3791/65250

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28 aprile 2023

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1State Key Laboratory of Plant Genomics, Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, 2CAS Center for Excellence in Biotic Interactions, University of Chinese Academy of Sciences, 3University of Chinese Academy of Sciences

In questo articolo

Sommario

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Descriviamo un metodo per raccogliere in modo efficiente l'emolinfa quantificabile da piccoli artropodi per analisi successive.

Abstract

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Gli artropodi sono noti per trasmettere una varietà di virus di importanza medica e agricola attraverso la loro emolinfa, che è essenziale per la trasmissione del virus. La raccolta dell'emolinfa è la tecnologia di base per lo studio delle interazioni virus-vettore. Qui, descriviamo un nuovo e semplice metodo per la raccolta quantitativa di emolinfa da piccoli artropodi usando Laodelphax striatellus (la piccola cavalletta bruna, SBPH) come modello di ricerca, poiché questo artropode è il principale vettore del virus della striscia di riso (RSV). In questo protocollo, il processo inizia pizzicando delicatamente una gamba dell'artropode congelato con una pinzetta a punta fine e premendo l'emolinfa fuori dalla ferita. Quindi, una semplice micropipetta composta da un capillare e un bulbo di pipetta viene utilizzata per raccogliere l'emolinfa trasudativa dalla ferita secondo il principio delle forze capillari. Infine, l'emolinfa raccolta può essere sciolta in un tampone specifico per ulteriori studi. Questo nuovo metodo per raccogliere emolinfa da piccoli artropodi è uno strumento utile ed efficiente per ulteriori ricerche sugli arbovirus e sulle interazioni vettore-virus.

Introduzione

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Sia i virus animali che quelli vegetali possono essere trasmessi dagli artropodi e questi virus rappresentano una grave minaccia per la salute umana e causano enormi perdite economiche in agricoltura 1,2,3. È importante sottolineare che l'emolinfa degli artropodi, che funge da sistema circolatorio e un elemento vitale del sistema immunitario negli artropodi, svolge un ruolo importante nella regolazione della trasmissione arbovirale. I virus acquisiti attraverso l'intestino degli artropodi vengono trasportati ad altri tessuti solo dopo essere sfuggiti con successo all'ambiente....

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Protocollo

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1. Allevamento di insetti

  1. Aumentare le SBPH utilizzate in questo esperimento nelle piantine di riso (Oryza sativa cv. Nipponbare). Piantare 20 piantine di riso in un'incubatrice (65 mm x 200 mm) e crescere a 25 °C sotto un fotoperiodo di 16 ore di luce e 8 ore di buio.

2. Dissezione degli SBPH per la raccolta dell'emolinfa

  1. Mettere gli SBPH in una provetta da centrifuga e metterli in un bagno di ghiaccio per 10-30 minuti.
    NOTA: Non posizionare gli SBPH nel bagno di ghiaccio per meno di 10 minuti, altrimenti gli insetti potrebbero rianimarsi.
  2. Posizionare un SBPH....

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Risultati

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Modello di micropipetta e raccolta dell'emolinfa
Abbiamo sviluppato una semplice micropipetta la cui azione si basa sulle forze capillari del tubo capillare. La micropipetta è composta da un tubo capillare e da un bulbo per pipetta (Figura 1A). I tubi capillari sono disponibili in diverse dimensioni di volume che vanno da 1 μL a 20 μL e i volumi dei tubi capillari sono selezionati in base alle esigenze. I tubi capillari con volumi più piccoli non sono suggeriti perché le .......

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Discussione

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L'emolinfa è il mezzo del sistema circolatorio negli artropodi e gli arbovirus possono invadere altri tessuti degli artropodi solo se sono in grado di sopravvivere all'ambiente emolinfatico ostile. La raccolta di un campione di alta qualità di emolinfa è il primo passo nello studio delle interazioni vettore-virus che si verificano nell'emolinfa. È stato riportato che l'emolinfa degli insetti può essere ottenuta da diversi siti sul corpo dell'insetto, tra cui una ferita sulla gamba anteriore, un'incisione minore nella zon.......

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Dichiarazioni

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Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è stato supportato dal National Key R&D Program of China (n. 2022YFD1401700) e dalla National Science Foundation of China (n. 32090013 e n. 32072385).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
10% SDS-PAGE gel proteicoBio-rad4561035Separazione e rilevamento delle proteine
4% paraformaldeideSolarbioP1110Per la fissazione delle cellule o dei tessuti...
Reagente colorante BradfordBio-rad5000205Rilevamento della concentrazione di proteine
CapillareHirschmannPer la raccolta dell'emolinfa
Camera di conteggio delle celluleACMECAYA0810Conteggio degli emociti
VetrinoGitoglas10127105APer la tenuta di insetti
Vetrino rivestito di silanoSigmaS4651-72EAPer la conservazione di campioni al microscopio
Reagente antisbiadimento in oro con DAPIInvitrogenP36935Colorazione del nucleo
Vetro di copertura del microscopioGitoglas10212424CPer l'osservazione microscopica
Bulbo per pipetteHirschmannPer la raccolta dell'emolinfa
Software Prisma 8.0GraphPad/Analisi statistiche
Stereomicroscopio MoticSMZ-168Per la dissezione degli insetti
PinzetteTianldP5622Per la dissezione
degli insetti Microscopio invertito ZeissZeissObserver Z1Osservazione degli emociti
9000101 di 9000101

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hogenhout, S. A., Ammar el, D., Whitfield, A. E., Redinbaugh, M. G. Insect vector interactions with persistently transmitted viruses. Annual Review of Phytopathology. 46, 327-359 (2008).
  2. Ray, S., Casteel, C. L. Effector-mediated plant-virus-vector interactions. Plant Cell. ....

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Raccolta dell emolinfaInterazioni virus vettoreTrasmissione di arbovirusMicropipetta capillareCicadellide bruno piccoloMicroscopio stereoscopicoQuantificazione delle proteineAnalisi degli emocitiSDS PAGE

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