Sistema di pseudoisole umane per la valutazione sincrona della dinamica dei biosensori fluorescenti e dei profili secretori ormonali

Sommario

Questo protocollo descrive un metodo per l'acquisizione sincrona e la co-registrazione di eventi di segnalazione intracellulare e la secrezione di insulina e glucagone da parte di pseudoisole umane primarie utilizzando la somministrazione adenovirale di un biosensore ciclico di adenosina monofosfato (cAMP), un rivelatore di differenza di cAMP in situ (cADDis) e un sistema di microperifusione.

Abstract

Le isole pancreatiche di Langerhans, che sono piccole raccolte 3D di cellule endocrine e di supporto specializzate sparse in tutto il pancreas, hanno un ruolo centrale nel controllo dell'omeostasi del glucosio attraverso la secrezione di insulina da parte delle cellule beta, che abbassa la glicemia, e glucagone da parte delle cellule alfa, che aumenta la glicemia. Le vie di segnalazione intracellulare, comprese quelle mediate dal cAMP, sono fondamentali per la secrezione ormonale delle cellule alfa e beta regolata. La struttura delle isole 3D, sebbene essenziale per la funzione coordinata delle isole, presenta sfide sperimentali per gli studi meccanicistici delle vie di segnalazione intracellulare nelle cellule insulari umane primarie. Per superare queste sfide e limitazioni, questo protocollo descrive una piattaforma integrata di imaging per cellule vive e microfluidica che utilizza pseudoisole umane primarie generate da donatori senza diabete che assomigliano alle isole native nella loro morfologia, composizione e funzione. Queste pseudoisole sono di dimensioni controllate attraverso il processo di dispersione e riaggregazione delle cellule insulari umane primarie. Allo stato disperso, l'espressione genica delle cellule insulari può essere manipolata; ad esempio, possono essere introdotti biosensori come il biosensore cAMP geneticamente codificato, cADDis. Una volta formate, le pseudoisole che esprimono un biosensore geneticamente codificato, in combinazione con la microscopia confocale e una piattaforma di microperifusione, consentono la valutazione sincrona della dinamica dei biosensori fluorescenti e dei profili secretori ormonali delle cellule alfa e beta per fornire maggiori informazioni sui processi e sulla funzione cellulare.

Introduzione

Le isole di Langerhans sono mini organi sparsi in tutto il pancreas la cui funzione è cruciale per il mantenimento dell'omeostasi del glucosio. L'insulina viene secreta dalle cellule beta in seguito al metabolismo del glucosio, all'aumento del rapporto ATP/ADP, alla chiusura dei canali del potassio sensibili all'ATP, alla depolarizzazione della membrana plasmatica e all'afflusso di calcio extracellulare¹. La secrezione di glucagone da parte delle cellule alfa è meno compresa, ma è stato ipotizzato che le vie intracellulari e paracrine contribuiscano all'esocitosi^dei granuli di glucagone ^2,3,4. Sia il diabete di tipo 1 che quello di tipo 2 sono associati alla disfunzione delle cellule insulari ^5,6,7. Pertanto, chiarire le vie di segnalazione intracellulare che mediano la secrezione dell'ormone insulare è essenziale per comprendere i meccanismi fisiologici e patologici nelle isole pancreatiche.

L'architettura sferica degli isolotti presenta alcuni ostacoli alla sperimentazione. Queste sfide includono la variazione delle dimensioni delle isole e la natura 3D degli isolotti, che riduce la trasduzione virale all'interno del nucleo dell'isolotto ^8,9. Per superare queste sfide, è stato sviluppato un sistema di pseudoisole, in cui le isole umane primarie sono disperse in singole cellule, trasdotte adenoviralmente con costrutti che codificano i bersagli di interesse e riaggregate per formare strutture simili a isole di dimensioni controllate, denominate pseudoisole⁷. Rispetto alle isole native dello stesso donatore che sono state coltivate in parallelo, queste pseudoisole sono simili nella morfologia, nella composizione delle cellule endocrine e nella secrezione ormonale⁷. Questo metodo consente l'espressione di costrutti in tutto lo pseudoisolotto, il che significa che supera una precedente barriera alla manipolazione genetica uniforme delle isole umane primarie ^7,8,9.

In questo protocollo, il sistema delle pseudoisole è integrato con un dispositivo microfluidico per esprimere i biosensori nelle cellule insulari umane primarie e ottenere la risoluzione temporale della secrezione dell'ormone delle pseudoisole durante la perifusione dinamica^10,11,12. Le pseudoisole vengono inserite in un microchip ed esposte a un flusso costante di diversi secretagoghi tramite una pompa peristaltica¹². Il microchip ha un fondo in vetro trasparente ed è montato su un microscopio confocale per registrare le dinamiche di segnalazione intracellulare attraverso le variazioni dell'intensità di fluorescenza del biosensore. L'imaging con biosensore è sincronizzato con la raccolta dell'effluente di microperifusione per la successiva analisi della secrezione di insulina e glucagone⁷. Rispetto alla macroperifusione, questo approccio di microperifusione consente di utilizzare un minor numero di pseudoisole a causa del volume inferiore del dispositivo microfluidico rispetto alla camera di macroperifusione⁷.

Per sfruttare l'utilità di questo sistema, il biosensore del rivelatore di differenza di adenosina monofosfato ciclico (cAMP) in situ (cADDis) è stato espresso in pseudoisole umane per valutare la dinamica del cAMP e la secrezione ormonale. Il biosensore cADDis è composto da una proteina fluorescente verde permutata circolarmente (cpGFP) posizionata nella regione cerniera di una proteina di scambio attivata da cAMP 2 (EPAC2), collegando le sue regioni regolatorie e catalitiche. Il legame del cAMP alla regione regolatoria di EPAC2 provoca un cambiamento conformazionale nella regione cerniera che aumenta la fluorescenza dal cpGFP¹³. I messaggeri intracellulari come il cAMP suscitano la secrezione di insulina e glucagone dopo l'attivazione a monte dei recettori accoppiati a proteine G¹⁴. L'imaging di cellule vive abbinato alla microperifusione aiuta a collegare la dinamica intracellulare del cAMP con la secrezione dell'ormone insulare. In particolare, in questo protocollo, vengono generate pseudoisole che esprimono cADDis per monitorare le risposte di cAMP nelle cellule alfa e beta a vari stimoli: basso livello di glucosio (2 mM di glucosio; G 2), glucosio alto più isobutilmetilxantina (IBMX; 20 mM di glucosio + 100 μM IBMX; G 20 + IBMX) e basso contenuto di glucosio più adrenalina (Epi; 2 mM di glucosio + 1 μM di Epi; G 2 + Epi). Questo flusso di lavoro di trattamento consente la valutazione della dinamica intracellulare del cAMP direttamente tramite 1) l'inibizione della fosfodiesterasi mediata da IBMX, che migliora i livelli intracellulari di cAMP prevenendone la degradazione, e 2) l'epinefrina, un noto stimolatore cAMP-dipendente della secrezione di glucagone delle cellule alfa mediata dall'attivazione del recettore β-adrenergico. Di seguito sono descritti in dettaglio i passaggi per la configurazione dell'apparato di microperifusione per esperimenti di imaging su cellule vive, il caricamento delle pseudoisole nel microchip, l'imaging sincrono di cellule vive e la microperifusione e l'analisi delle tracce del biosensore e della secrezione ormonale mediante saggi ormonali basati su micropiastre.

Protocollo

Le isole umane (N = 4 preparazioni) sono state ottenute attraverso partnership con il programma di distribuzione integrata delle isole, il programma di analisi del pancreas umano, Prodo Laboratories, Inc. e Imagine Pharma. Il Vanderbilt University Institutional Review Board non considera i campioni pancreatici umani anonimizzati come ricerca su soggetti umani. Questo lavoro non sarebbe possibile senza i donatori di organi, le loro famiglie e le organizzazioni di approvvigionamento di organi. Vedere la Tabella 1 per le informazioni demografiche sui donatori. Le isole umane di donatori di pancreas senza diabete sono state isolate con meno di 15 ore di ischemia fredda.

1. Formazione di pseudoisole (dettagliata in Walker et al.⁷)

1. Ottenere e selezionare manualmente le isole umane primarie utilizzando una pipetta P200 e un microscopio da banco, prestando molta attenzione a non contaminare il puntale della pipetta su superfici al di fuori del terreno di coltura dell'isola (10% FBS, 100 μg/mL streptomicina, 100 U/mL di penicillina, 2 mM di L-glutammina in CMRL 1066).
2. Trasferire le isole primarie in una provetta da 15 mL ed eseguire tutte le seguenti fasi di formazione delle pseudoisole sotto una cappa di coltura tissutale per prevenire la contaminazione. Dissociare lentamente le isole primarie per 7 minuti a temperatura ambiente con una pipetta P1000 in tripsina allo 0,025%. La soluzione diventerà opaca man mano che gli isolotti inizieranno a separarsi.
   1. Per questi studi, 200-300 isole primarie selezionate a mano con diametri di circa 200 μm disperse in 500 μL di tripsina allo 0,025% producono da una a due piastre da 96 pozzetti di pseudoisole; Il numero esatto può variare a seconda delle dimensioni medie dell'isolotto e della vitalità. Per >500 isole primarie, aumentare il volume di tripsina allo 0,025% utilizzato in un rapporto 1:1 (ad esempio, 600 μL di tripsina allo 0,025% per 600 isolotti selezionati a mano).
3. Estinguere la dispersione aggiungendo un volume di Vanderbilt Pseudoislet Media (VPM) equivalente al volume di tripsina utilizzato. Quindi, lavare due volte con 1 mL di VPM. Per i lavaggi, centrifugare le cellule disperse a 485 x g per 2-3 minuti a 4 °C in una centrifuga da banco. Risospendere le cellule in un volume definito di VPM (in genere 1 mL) per il conteggio.
   NOTA: La generazione delle pseudoisole e la composizione del VPM sono descritte in dettaglio in una precedente pubblicazione⁷. In breve, VPM contiene volumi uguali di terreni CMRL arricchiti (20% FBS, 100 μg/mL streptomicina, 100 U/mL di penicillina, 1 mM di piruvato di sodio, 2 mM di Glutamax, 2 mM di HEPES in CMRL 1066) e iEC-media (VEGF Medium Complete Kit meno FBS + 1 flacone di Endothelial Cells Medium Supplement). Uno schema riassuntivo della generazione delle pseudoisole è incluso nella Figura 1A.
4. Determinare la conta cellulare e la vitalità utilizzando un contatore cellulare automatizzato combinando 10 μL di Trypan Blue con 10 μL di sospensione cellulare. Mescolare bene la sospensione cellulare per garantire un conteggio accurato delle cellule.
5. Calcolare il volume di sospensione cellulare, virus e VPM necessari per il numero desiderato di pseudoisole. Basare tutti i calcoli sulla conta delle cellule vive ottenuta al punto 1.4.
   1. Per questi studi, trasdurre cellule insulari umane disperse a MOI 500 (N = 1) o 1.000 (N = 2) con Ad-CMV-cADDis in un volume totale di 500 μL. Una piastra di pseudoisole trasdotte (2.000 cellule/pseudoisola) produce tre repliche tecniche per donatore (32 pseudoisole/esperimento). L'adenovirus è stato ottenuto commercialmente in questo lavoro.
6. Combina le quantità calcolate di sospensione cellulare, virus e VPM in una provetta da 1,5 mL. Mescolare delicatamente il contenuto pipettando su e giù.
7. Durante la trasduzione, incubare le provette con tappi aperti e coprirle con una capsula di Petri sterile per 2 ore in un incubatore per colture tissutali a 37 °C e 5% di CO₂/95% di aria.
8. Aggiungere 500 μL di VPM a ciascuna provetta e lavare le cellule centrifugandole a 500 x g per 3 minuti a 4 °C. Completare altri due lavaggi per un totale di tre lavaggi. Aspirare il surnatante e risospendere le cellule in 1 mL di VPM.
9. Calcolare il volume totale di semina delle cellule (200 μL/pseudoisola). Aggiungere il VPM (il volume di semina della cella calcolato meno 2 mL) a una provetta conica di dimensioni adeguate. Aggiungere la sospensione cellulare trasdotta dal punto 1.7 al tubo conico. Tenere il tubo conico leggermente chiuso ma non ben chiuso per consentire lo scambio d'aria per le celle.
10. Sciacquare la provetta da 1,5 mL (dal punto 1.7) con 1 mL di VPM e trasferire il contenuto nella provetta conica, a quel punto la provetta conica dovrebbe contenere il volume totale di semina cellulare.
11. Miscelare bene il contenuto della provetta conica pipettando su e giù con una pipetta sierologica motorizzata, quindi trasferire il contenuto in un serbatoio sterile per reagenti. Se il serbatoio non contiene l'intero volume di semina delle celle, eseguire trasferimenti seriali e assicurarsi che la sospensione sia ben miscelata in ogni fase.
12. Utilizzando una pipetta P200 multicanale, pipettare la sospensione cellulare nel serbatoio del reagente su e giù 3-4 volte per garantire l'omogeneità, quindi pipettare 200 μL della sospensione cellulare in ciascun pozzetto delle piastre a micropozzetti.
13. Incubare le pseudoisole in un incubatore per colture tissutali a 37 °C e 5% di CO₂/95% di aria per 6 giorni senza cambi di terreno. Entro il 6° giorno, le pseudoisole dovrebbero essere completamente formate e pronte per gli esperimenti (Figura 1B-D).

2. Preparazione per l'imaging di cellule vive e microperifusione (1 giorno prima dell'esperimento)

NOTA: Le informazioni sulla preparazione del terreno di microperifusione sono disponibili tramite la risorsa protocols.io (https://www.protocols.io/view/analysis-of-islet-function-in-dynamic-cell-perifus-bt9knr4w.html).

1. Raccogliere gli pseudoisolotti utilizzando una pipetta multicanale trasferendoli dalla piastra a 96 pozzetti in una capsula di Petri sterile. Quindi, raccogli a mano gli pseudoisolotti e trasferiscili in un'altra capsula di Petri sterile contenente VPM fresco. Lasciare incubare gli pseudoisolotti in un incubatore per colture tissutali a 37 °C e 5% di CO₂/95% di aria per tutta la notte.
2. Preparare 1 L di DMEM aggiungendo 1 g di BSA (grado di dosaggio radioimmunologico), 0,11 g di piruvato di sodio, 0,58 g di L-glutammina, 3,2 g di bicarbonato di sodio, 1,11 g di HEPES e 1 flacone di DMEM a 1 L di acqua ultra-purificata. Preparare una soluzione madre di glucosio 1 M in DMEM. Conservare entrambe le soluzioni a 4 °C per una notte.
3. Controllare il flusso del sistema di microperifusione il giorno prima dell'esperimento. Collegare tutti i tubi a un portachip contenente un microchip vuoto, come descritto nella Figura 2A-B. Utilizzare acqua ultra-purificata come effluente per confermare una portata di 100 μL/min al collettore di frazioni.

3. Aggiunta di secretagoghi al DMEM (giorno dell'esperimento)

1. Aggiungere 0,07 mg/mL di ascorbato al DMEM e preparare i secretagoghi nel tampone DMEM + ascorbato utilizzando una scorta di glucosio 1 M per i tamponi contenenti glucosio.
   NOTA: L'ascorbato viene utilizzato per stabilizzare l'epinefrina prevenendone l'ossidazione. Se l'epinefrina non viene utilizzata, l'ascorbato può essere omesso dal DMEM.
2. Filtrare i secretagoghi due volte attraverso un filtro poroso da 0,22 μm, utilizzando ogni volta un filtro nuovo. Riscaldare le soluzioni a 37 °C e misurare il glucosio tramite un glucometro per confermare la concentrazione desiderata.

4. Configurazione dell'apparato di microperifusione

1. Riscaldare la camera climatica di un microscopio confocale a scansione laser a 37 °C, assicurandosi che tutte le porte siano chiuse e che la camera mantenga una temperatura stabile. Posizionare il portatrucioli contenente il microchip nella camera per riscaldarlo. Verificare la temperatura del truciolo con una pistola a infrarossi.
   NOTA: In questo caso, la camera climatica è impostata a 38,5 °C, il che consente al chip di raggiungere i 37 °C.
2. Collegare tutti i tubi al portatrucioli (come indicato nella Figura 2A-B). Linea di risciacquo con secretagogo di base per 5 min. In questo studio, la linea è stata lavata con 2 mM di glucosio (G 2 ). Cambiare la membrana della trappola a bolle del de-bubbler ogni 8-10 esperimenti.

5. Caricamento delle pseudoisole nel microchip

1. Prima di caricare il microchip, acquisire un'immagine in campo chiaro e in campo scuro (ingrandimento 10x) delle pseudoisole che verranno utilizzate nell'esperimento per la successiva quantificazione degli equivalenti delle isole (IEQ).
   NOTA: L'IEQ viene utilizzato per normalizzare la secrezione ormonale alle variazioni del numero di isole attraverso gli esperimenti. Questo passaggio può essere eseguito anche il giorno prima dell'esperimento.
2. Aspirare il liquido in eccesso dalla metà inferiore e superiore del microchip. La metà superiore del microchip contiene guarnizioni che garantiscono un'adeguata tenuta di ciascun pozzetto, mentre la metà inferiore del microchip contiene i pozzetti con un vetrino coprioggetti attaccato. Pre-bagnare un pozzetto nel microchip con 5 μL di DMEM. Assicurati di pipettare intorno ai bordi esterni del pozzetto per bagnare le fessure.
3. Utilizzare una pipetta pre-bagnata per raccogliere 30-32 pseudoisole in un volume di 23 μL ed erogare lentamente le pseudoisole al centro del pozzetto nella parte inferiore del microchip. Controllare la punta della pipetta per verificare la presenza di eventuali pseudoisolette che potrebbero essere state attaccate.
4. Utilizzare una punta di caricamento del gel per manovrare delicatamente gli pseudoisolotti al centro del pozzetto. Ciò garantisce che il numero massimo di pseudoisolotti venga catturato in un campo visivo.
5. Scatta un'immagine delle pseudoisole nel microchip sullo stereoscopio. Questo conteggio verrà utilizzato per regolare l'IEQ calcolato per qualsiasi perdita di pseudoislet durante questo processo.
   1. Se tutte le pseudoisolette del punto 5.3 non sono caricate nel microchip, regolare l'IEQ di conseguenza. Ad esempio, se ora vengono visualizzate 30 pseudoisole ma 32 sono state visualizzate nel passaggio 5.1, calcolare l'IEQ sulle immagini del passaggio 5.1 e quindi moltiplicare per 30/32.
6. Posizionare la parte inferiore del microchip nell'apposito supporto. Posizionare con cautela la parte superiore del microchip con la guarnizione verde rivolta verso il basso.
7. Tenendo il microchip in posizione, chiudere delicatamente il supporto del microchip per bloccare il microchip. Cerca di non esercitare una pressione eccessiva sul microchip durante questo processo, poiché ciò sposterà il fluido contenuto nel pozzetto e potrebbe portare alla perdita di pseudoislette. Evitare di introdurre bolle d'aria nel pozzo.

6. Imaging sincrono di cellule vive e microperifusione

1. Trasferire i secretagoghi, la pompa e il microchip nel supporto nella camera ambientale montata sul microscopio confocale. Dirigere il tubo di efflusso fuori dalla camera verso il raccoglitore di frazioni.
   1. Inserire i tamponi in provette coniche da 15 mL con aperture praticate nei tappi. Questi fori impediscono al tubo di raccolta di fuoriuscire dal tubo.
   2. Quando si avvita il tubo nel gorgogliatore, separare il dado e la ghiera, quindi avvitare il degorgogliatore. In questo modo si evita la torsione del filo.
2. Impostare il raccoglitore di frazioni in modo che ruoti ogni 2 minuti. Caricare il numero appropriato di provette nel raccoglitore di frazioni, tenendo conto dei lavaggi e delle frazioni sperimentali. Per questi esperimenti sono stati utilizzati 15 tubi di lavaggio (30 minuti di lavaggio totale) e 28 tubi per la raccolta delle frazioni.
3. Avviare la pompa per erogare il fluido basale (contenente la concentrazione di glucosio al basale) a 100 μL/min (una raccolta di 2 minuti a una portata di 100 μL/min si traduce in 200 μL di effluente per ciascuna provetta di frazione). Questa portata è stata scelta per limitare lo stress sulle pseudoisole e prevenire un movimento significativo delle pseudoisole durante l'imaging dal vivo.
   1. Mentre il fluido scorre attraverso l'apparecchio, prestare attenzione a quanto segue:
      1. Prestare attenzione alle goccioline all'estremità del beccuccio del raccoglitore di frazioni, che indicano il flusso attraverso il sistema.
      2. Prestare attenzione alle diminuzioni dell'efflusso dal sistema; se c'è <200 μL nelle provette di raccolta, ciò indica che potrebbe esserci un blocco o una perdita nel sistema. Vedere la Tabella 2 per un elenco delle potenziali cause della diminuzione del volume dell'effluente, delle soluzioni e dei suggerimenti per la prevenzione.
4. Una volta che c'è un flusso di fluido costante dal tubo di eflusso, ruotare la testa del collettore di frazioni per erogare nei tubi e avviare il raccoglitore di frazioni. Raccogliere le prime 15 frazioni (30 min) come lavaggio per consentire agli pseudoisolotti di equilibrarsi. Utilizzare queste prime 15 frazioni per garantire un flusso continuo e accurato del fluido attraverso il sistema. Scartare queste frazioni in seguito.
5. Durante i 30 minuti di lavaggio, impostare il microscopio per l'imaging di cellule vive secondo questi parametri: obiettivo obiettivo: U Plan Fluorite 20x con zoom 1x; canali di fluorescenza: EGFP (emissione = 510 nm, lunghezza d'onda laser = 488, lunghezza d'onda di rivelazione = 500-600 nm); serie temporale: immagine acquisita ogni 2 s per l'intera durata dell'esperimento (es. 56 min); Velocità di campionamento: 2 μs/pixel.
   1. Identificare la parte inferiore delle pseudoisole nel campo visivo e regolare il piano focale a 15 μm al di sopra di questa posizione. Questo è il telaio che verrà utilizzato durante l'esperimento di imaging.
6. Una volta completato il lavaggio di 30 minuti, iniziare la raccolta delle frazioni e l'acquisizione delle immagini.
   NOTA: È necessario fare tutto il possibile per identificare e correggere eventuali problemi prima di questo passaggio. Una volta iniziata la raccolta dei dati, eventuali pause nell'esperimento o un'eccessiva esposizione ai secretagoghi possono influire negativamente sui risultati.
7. Continuare a perifondere gli pseudoisolotti con terreno basale per tutta la durata della prima raccolta basale, raccogliendo l'effluente in provette da 1,5 mL. Cambiare manualmente il tubo dal tampone di base al nuovo tubo tampone di stimolo quando il momento è appropriato per l'esperimento.
   1. Una sequenza standard di microperifusione è mostrata nella Tabella 3.
   2. Dopo aver raccolto ~10 frazioni, mettere tutte le frazioni in un frigorifero a 4 °C fino alla fine dell'esperimento per prevenire la degradazione degli ormoni, in particolare del glucagone.
   3. Continuare a monitorare il flusso del sistema durante l'esperimento controllando il volume dell'effluente in ciascuna provetta.
8. Al termine dell'esperimento, tornare al terreno basale e lasciare che la pompa continui a funzionare per 5 minuti per eliminare lo stimolo con il terreno basale (in questo caso, 2 mM di glucosio).
9. Arrestare la pompa e scollegare il tubo del supporto del microchip dal gorgogliatore e dal raccoglitore di frazioni per rimuovere il supporto del microchip dalla camera ambientale. Chiudere tutte le porte dopo aver rimosso il microchip per mantenere la temperatura.
10. Conservare i perifusati a -80 °C per la successiva analisi ormonale.

7. Estrazione dell'etanolo acido pseudoislet

1. Aprire con cautela il supporto del microchip e sollevare la parte superiore del microchip. Utilizzare una pipetta e un microscopio da banco per prelevare le pseudoisole dal pozzetto e trasferirle in una provetta da 1,5 mL. Assicurarsi che tutti gli pseudoisolotti vengano raccolti utilizzando un microscopio da banco, se necessario.
   1. Acquisire un'immagine finale delle pseudoisole nel microchip prima della rimozione dal pozzetto per regolare l'IEQ dell'estratto dell'isolotto, in modo simile al punto 5.5.
2. Lavare due volte con 500 μL di PBS. Centrifugare gli pseudoisolotti per 1 minuto a 94 g tra un lavaggio e l'altro e aspirare il surnatante.
3. Dopo aver rimosso l'ultimo lavaggio, aggiungere 200 μL di etanolo acido (5,5 mL di etanolo al 95% + 50 μL di HCl 12 N). Conservare a 4 °C per una notte.
4. Il giorno successivo, centrifugare gli estratti per 10 minuti a 15.989 x g e 4 °C. Aliquot 45 μL in tre nuove provette. Conservare a -80 °C per l'analisi del contenuto ormonale. In alternativa alla normalizzazione della secrezione ormonale all'IEQ, la secrezione ormonale può anche essere normalizzata al contenuto di ormone pseudoinsulare misurato dagli estratti.

8. Ulteriori esperimenti e pulizia

1. Ripetere i passaggi 5-7 con i gruppi successivi di pseudoisolotti per ottenere ulteriori repliche tecniche.
2. Dopo aver terminato tutti gli esperimenti di microperifusione, far scorrere candeggina al 10% attraverso il microchip e il tubo per 5 minuti e poi acqua ultra-purificata per 30 minuti per disinfettare il tubo.

9. Analisi dei dati

NOTA: L'imaging di cellule vive è stato eseguito utilizzando un microscopio confocale a scansione laser. Le immagini sono state analizzate utilizzando il pacchetto software di imaging associato al microscopio. Di seguito sono riportate le linee guida generali, ma possono variare a seconda del produttore del microscopio e del software di acquisizione delle immagini.

1. Determinazione degli equivalenti totali delle isole (IEQ) per la normalizzazione dei dati
   1. Apri il programma software e fai clic sulla scheda Acquisizione in alto a destra della finestra. Masterizza in batch tutte le immagini in campo scuro selezionando la funzione Masterizza in batch in Gestione macro (Visualizza > Finestre degli strumenti > Gestione macro).
      1. Per masterizzare più immagini contemporaneamente, fare clic sul pulsante Attiva/disattiva modalità batch prima di fare clic sul pulsante Esegui all'interno di Macro Manager. Seguire le istruzioni visualizzate sullo schermo per selezionare la posizione dell'immagine di origine e la posizione di destinazione per le immagini masterizzate. Per il tipo di file immagine, scegliete Formato file immagine con tag (*.tif).
   2. Per la misurazione IEQ, aprire la versione masterizzata dell'immagine in campo scuro 10x scattata al punto 5.1. Fare clic sulla scheda Conteggio e misura in alto e scegliere il pulsante Soglia HSV manuale a sinistra.
      1. Utilizzare la funzione contagocce per aggiungere/rimuovere l'area positiva (in rosso) fino a quando ogni pseudoisolotto non viene evidenziato in rosso, senza estendersi oltre il bordo dello pseudoisolotto. Fare clic su Conta e misura.
   3. Utilizzare le funzioni di divisione automatica o divisione manuale per dividere gli pseudoisolotti che sono stati uniti.
      1. Per dividere manualmente gli pseudoisolotti, scegliere la funzione di divisione manuale, fare clic con il pulsante sinistro del mouse per disegnare una linea che li separi, quindi fare clic con il pulsante destro del mouse per completare la linea. Per la divisione automatica, scegliere la funzione di divisione automatica e fare clic sugli pseudoisolotti raggruppati di interesse. Confermare la corretta divisione automatica in seguito.
   4. Nelle immagini masterizzate in batch, la barra della scala e il testo dell'ingrandimento possono essere contrassegnati come positivi. Eliminare questi oggetti per un conteggio accurato evidenziando il testo e la barra della scala utilizzando il mouse e premendo il tasto Canc della tastiera.
   5. Attiva e disattiva il filtro per confermare che tutti gli pseudoisolotti vengono contati. Il file può anche essere aperto al di fuori del programma per riferimenti incrociati. Al termine, fare clic su Esporta in Excel.
   6. Apri il foglio di calcolo e modificalo come segue.
      1. Elimina le informazioni di conteggio, media e ordinamento in basso. Ordina gli oggetti in base al loro diametro medio. Inserire una colonna dopo il diametro medio e denominare la colonna "Conteggio pseudoisole".
      2. Il numero di isolotti è determinato dal numero di pseudoisolotti con diametri medi che rientrano in ciascun indice sottostante. Moltiplicare il numero di pseudoisolotti per indice per il rispettivo fattore di conversione IEQ e sommare questi valori per determinare l'IEQ totale. Eseguire i calcoli IEQ sulle immagini acquisite prima di ogni esperimento. Utilizzare gli indici e i fattori di conversione IEQ seguenti:
         1-49 μm: × 0,167
         50-100 μm: × 0,667
         101-150 μm: × 1,685
         151-200 μm: × 3.500
         201-300 μm: × 6,315
         301-350 μm: × 10,352
      3. Per un foglio di calcolo di esempio per determinare i conteggi IEQ, vedere File supplementare 1.
2. Quantificazione dell'imaging di cellule vive nel software
   1. Aprire il file desiderato (.oir) in cellSens.
   2. Designare le aree di interesse (ROI) come indicato di seguito.
      1. Utilizzare gli strumenti di disegno per designare le ROI (ad esempio, ogni pseudoisolotto). Se si utilizza l'opzione di disegno a mano libera, fare clic con il pulsante destro del mouse per chiudere la forma.
      2. Evidenzia tutte le ROI utilizzando la freccia e trascinandola per racchiudere tutte le ROI nell'immagine. Con tutte le ROI evidenziate, fare clic con il pulsante destro del mouse e selezionare Converti in ROI dinamico nel tempo
      3. Riproduci il file XYT per confermare che le ROI sono accurate nel tempo. Se il ROI non è accurato in un periodo specifico, correggerne le dimensioni/la posizione in quel periodo. Il software regolerà gradualmente le dimensioni/posizione del ROI nel tempo per adattarsi a questi cambiamenti. Ripeti questi passaggi fino a quando il ROI non è accurato durante l'esperimento di imaging.
   3. Eseguire misurazioni dell'intensità su ciascun ROI come segue.
      1. Nella barra degli strumenti, fare clic su Misura profilo di intensità. Evidenziare i ROI da analizzare; utilizzare Maiusc + clic per selezionare più ROI.
         NOTA: Sebbene nel software possano essere aperti più file alla volta, analizzare solo le ROI di un file alla volta.
      2. Per tenere conto del rumore di fondo, selezionare un valore costante da sottrarre da ciascun valore di intensità o designare un ROI come sfondo. Fare clic su Esegui.
      3. All'interno della barra degli strumenti Profilo di intensità , fare clic su Esporta in Excel per esportare i dati.
      4. Normalizzare tutti i punti dati alla media delle intensità misurate da 7-8 minuti (cioè l'ultimo minuto della prima perifusione del mezzo di base). Questi valori normalizzati in ogni punto temporale sono definiti come intensità relativa di cADDis. Per un esempio di foglio di calcolo per l'analisi e la normalizzazione dei dati di imaging, vedere File supplementare 2.
3. Misurare la secrezione ormonale in ogni frazione ed estratto di isole. In questi esperimenti, le concentrazioni di insulina e glucagone sono state misurate mediante ELISA. Normalizzare la secrezione ormonale in ciascuna frazione al volume della pseudoisola utilizzando le misurazioni IEQ determinate al punto 9.1 o dal contenuto di ormone estratto.

Risultati

Le pseudoisole umane che esprimono biosensori sono state create tramite la somministrazione adenovirale di costrutti che codificano per il biosensore cAMP cADDis (Figura 1A). La Figura 1B mostra la riaggregazione delle cellule insulari umane trasdotte nel tempo, con pseudoisole completamente formate osservate dopo 6 giorni di coltura. Le cellule hanno iniziato a mostrare una fluorescenza visibile di cADDis entro 48 ore e c'era un'elevata espressione del...

Discussione

L'integrazione di un sistema di microperifusione, di pseudoisolette che esprimono biosensori e di microscopia confocale a scansione laser consente la valutazione sincrona degli eventi di segnalazione intracellulare e dei profili dinamici della secrezione ormonale. Il sistema dinamico di microperifusione è in grado di fornire una serie di stimoli ben definiti alle pseudoisole e consente la raccolta dell'effluente, in cui le concentrazioni di insulina e glucagone possono essere misurate mediante ELISA disponibile in commer...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Ad-CMV-cADDis	Welgen	Non applicabile
0,01 pollici tubo in FEP	IDEX	1527L
1 M HEPES	Gibco	15630-080	Terreno arricchito CMRL Componente
1,5 mL e tubi conici	Qualsiasi	Qualsiasi
10 μ m Filtro PTFE	Cole-Parmer	SK-21940-41	Sostituzione ogni 8-10 cicli
100 mM Piruvato di sodio	Thermo Scientific	11360070	Componente del terreno arricchito CMRL
190 proof Etanolo	Decon labs	2816	Componente di etanolo acido
200 mM GlutaMAX-I Supplemento	Gibco	35050061	Componente del supporto Enriched-CMRL
Ascorbato	Sigma	A5960	DMEM Componente tampone perifusione
Albumina sierica bovina	Sigma	A7888	DMEM Componente tampone perifusione
Trappola a bolle	Omnifit	006BT
CellCarrier ULA  Micropiastre a 96 pozzetti	Perkin Elmer	6055330
cellSoftware di analisi Sens	Olympus	v3.1	Software utilizzato per l'analisi dei dati
CMRL 1066	MediaTech	15-110-CV	componenti multimediali CMRL arricchiti
(IDEX, P-794)	IDEX	P-794
D-(+)-Glucosio	Sigma	G7528	Componente tampone per glucosio
DMEM	Sigma	D5030	DMEM Perifusion Buffer Component
Camera ambientale	okolab	IX83
Epinepherine (Epi)	Sigma	E4250	Componente tampone di stimolazione
Siero fetale bovino (FBS), inattivato a caldo	Sigma	12306C	Componente del terreno CMRL arricchito
Glucagone ELISA	Mercodia	10-1281-01
Kit di glucagone HTRF	Cisbio	62CGLPEH
HCl (12N)	Qualsiasi		componente di etanolo acido
HEPES	Sigma	H7523	DMEM Componente tampone per perifusione
iCell Cellule endoteliali Integratore medio	Cell Dynamics	M1019	iEC Media Component
Idex Dado e ghiera Derlin 1/4-24	Cole-Parmer	EW-00414-LW
Insulina ELISA	Mercodia	10-1113-01
Isobutilmetilonina (IBMX)	Sigma	I5879	Componente tampone di stimolazione Microscopio
confocale a scansione laser	Olympus	FV3000
L-Glutammina	Sigma	G8540	DMEM Perifusion Buffer Component
Microchip (Università di Miami, FP-3W)	Università di Miami	Porta microchip FP-3W
	Micronit Microfluidics	FC_PRO_CH4525
Modello 2110 Collettore di frazioni	Biorad	7318122
P10, P200 e P1000 pipette e punte	Qualsiasi	Qualsiasi
Penicillina/Streptomicina	Gibco	15140-122	Componente multimediale CMRL arricchito
Pompa peristaltica	Instech	P720
Soluzione salina tamponata con fosfato	Gibco	14190-144	Lavare le isole
Sarstedt piatti	Sarstedt Sarstedt	dipende dal diametro
Bicarbonato di sodio	Sigma	S6014	DMEM Componente tampone perifusione
Piruvato di sodio	Sigma	P2256	Stereoscopio DMEM Perifusion Buffer Component
	Olympus	SZX12
Filtro Steriflip (0,22 &; m)	Millipore	SCGP00525	Filtra tutti i tamponi due volte
VascuLife VEGF Medium Kit completo	LifeLine Cell Technology	LL-0003	iEC Media Component