Modellazione di tumori cerebrali in vivo utilizzando la somministrazione basata sull'elettroporazione di DNA plasmidico che rappresenta le firme di mutazione del paziente

Katie B. Grausam; Joshua J. Breunig

doi:10.3791/65286

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Articolo metodologico

Modellazione di tumori cerebrali in vivo utilizzando la somministrazione basata sull'elettroporazione di DNA plasmidico che rappresenta le firme di mutazione del paziente

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DOI:

10.3791/65286

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23 giugno 2023

Katie B. Grausam^*¹ , Joshua J. Breunig^*¹^,²^,³^,⁴^,⁵

¹Board of Governor’s Regenerative Medicine Institute, Cedars-Sinai Medical Center, ²Center for Neural Sciences in Medicine, Cedars-Sinai Medical Center, ³Department of Biomedical Sciences, Cedars-Sinai Medical Center, ⁴Samuel Oschin Comprehensive Cancer Institute, Cedars-Sinai Medical Center, ⁵Department of Medicine, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles

^* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

L'utilizzo di un modello tumorale autoctono immunocompetente guidato da mutazioni comuni dei pazienti per i test preclinici è fondamentale per i test immunoterapici. Questo protocollo descrive un metodo per generare modelli murini di tumore cerebrale utilizzando la somministrazione basata sull'elettroporazione di DNA plasmidico che rappresenta le mutazioni comuni dei pazienti, fornendo così un modello murino accurato, riproducibile e coerente.

Abstract

I modelli tumorali sono fondamentali per i test preclinici dei tumori cerebrali in termini di esplorazione di nuovi trattamenti più efficaci. Con un interesse significativo per l'immunoterapia, è ancora più importante disporre di un modello murino coerente, clinicamente pertinente e immunocompetente per esaminare le popolazioni di cellule tumorali e immunitarie nel cervello e la loro risposta al trattamento. Mentre la maggior parte dei modelli preclinici utilizza il trapianto ortotopico di linee cellulari tumorali consolidate, il sistema di modellazione qui presentato consente una rappresentazione "personalizzata" delle mutazioni tumorali specifiche del paziente in uno sviluppo graduale ma efficace da costrutti di DNA inseriti in cellule precursori neurali (NPC) in divisione in vivo. I costrutti di DNA presentano l'analisi a mosaico con il metodo MADR (dual-recombinase-mediated cassette exchange), che consente la mutagenesi somatica a copia singola delle mutazioni driver. Utilizzando cuccioli di topo appena nati tra la nascita e i 3 giorni di età, gli NPC vengono presi di mira sfruttando queste cellule divisorie che rivestono i ventricoli laterali. La microiniezione di plasmidi di DNA (ad esempio, derivati da MADR, trasposoni, sgRNA diretti da CRISPR) nei ventricoli è seguita dall'elettroporazione utilizzando pale che circondano la regione rostrale della testa. Dopo la stimolazione elettrica, il DNA viene assorbito nelle cellule in divisione, con il potenziale di integrarsi nel genoma. L'uso di questo metodo è stato dimostrato con successo nello sviluppo di tumori cerebrali sia pediatrici che adulti, incluso il tumore cerebrale maligno più comune, il glioblastoma. Questo articolo discute e dimostra le diverse fasi dello sviluppo di un modello di tumore cerebrale utilizzando questa tecnica, compresa la procedura di anestesia di giovani cuccioli di topo, alla microiniezione della miscela plasmidico, seguita dall'elettroporazione. Con questo modello murino autoctono e immunocompetente, i ricercatori avranno la possibilità di espandere gli approcci di modellazione preclinica, nel tentativo di migliorare ed esaminare l'efficacia del trattamento del cancro.

Introduzione

I modelli murini di tumore cerebrale sono cruciali per comprendere i meccanismi di formazione e trattamento del tumore cerebrale. I modelli attuali includono tipicamente trapianti sottocutanei o ortotopici prodotti rapidamente di linee cellulari tumorali comunemente usate, sulla base di un numero limitato di mutazioni driver o modelli di xenotrapianto derivati da pazienti, utilizzando topi immunodeficienti che ostacolano i corretti studi di immunoterapia 1,2,3,4. Inoltre, questi risultati preclinici possono portare a falsi positivi, in quant....