Articolo metodologico

Un modello murino per la neovascolarizzazione corneale mediante ustione alcalina

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DOI:

10.3791/65289

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30 giugno 2023

 ,  ,  , 
1Cullen Eye Institute, Department of Ophthalmology, Baylor College of Medicine

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo si concentra sulla neovascolarizzazione corneale indotta da ustioni alcaline nei topi. Il metodo genera un modello di malattia corneale riproducibile e controllabile per studiare l'angiogenesi patologica e i meccanismi molecolari associati e per testare nuovi agenti farmacologici per prevenire la neovascolarizzazione corneale.

Abstract

La neovascolarizzazione corneale (CoNV), una forma patologica di angiogenesi, comporta la crescita di vasi sanguigni e linfatici nella cornea avascolare dal limbus e influisce negativamente sulla trasparenza e sulla visione. L'ustione alcalina è una delle forme più comuni di trauma oculare che porta alla CoNV. In questo protocollo, CoNV viene indotto sperimentalmente utilizzando una soluzione di idrossido di sodio in modo controllato per garantire la riproducibilità. Il modello di ustione alcalina è utile per comprendere la patologia del CoNV e può essere esteso allo studio dell'angiogenesi in generale a causa della avascolarizzazione, della trasparenza e dell'accessibilità della cornea. In questo lavoro, il CoNV è stato analizzato mediante esame diretto al microscopio da dissezione e immunocolorazione delle cornee a montaggio piatto utilizzando anticorpi monoclonali anti-CD31. La linfangiogenesi è stata rilevata sulle cornee a montaggio piatto mediante immunocolorazione con anticorpi monoclonali anti-LYVE-1. L'edema corneale è stato visualizzato e quantificato utilizzando la tomografia a coerenza ottica (OCT). In sintesi, questo modello aiuterà a far progredire i saggi di neovascolarizzazione esistenti e a scoprire nuove strategie di trattamento per l'angiogenesi patologica oculare ed extraoculare.

Introduzione

La cornea è un tessuto avascolare che mantiene la sua trasparenza stabilendo un privilegio angiogenico 1,2. Il danno alla cornea può provocare infiammazione e sviluppo di vasi sanguigni e linfatici, nonché fibrosi3. La neovascolarizzazione corneale (CoNV) porta a disturbi visivi ed è la seconda causa di cecità in tutto il mondo4. La CoNV colpisce circa 1,4 milioni di persone all'anno negli Stati Uniti5. La CoNV può essere indotta da vari fattori, tra cui ustioni chimiche, infezioni, infiammazioni e ipossia 3,6. Le ustioni chimiche sono una delle emergenze oculari più comuni e rappresentano circa il 13,2% dei traumi oculari e richiedono una valutazione e un trattamento immediati7. Le ustioni chimiche potrebbero essere ustioni alcaline o acide, ma le ustioni alcaline causano lesioni più gravi, poiché l'alcali penetra più in profondità nel tessuto8.

I modelli murini di ustione alcalina sono ampiamente utilizzati per studiare la CoNV e la guarigione delle ferite. Rispetto al modello di angiogenesi della tasca corneale 9,10, i modelli di ustione alcalina sono relativamente semplici da creare e possono anche essere utilizzati per studiare l'infiammazione corneale, la fibrosi e la proliferazione epiteliale. Questi modelli sono anche più strettamente correlati alle ustioni chimiche cliniche rispetto ai modelli di sutura corneale dell'angiogenesi11. Con l'ustione alcalina, la cornea altrimenti avascolare sviluppa vasi sanguigni a causa dell'infiammazione e di uno squilibrio nei fattori anti-angiogenicie pro-angiogenici 1,2. Gli svantaggi dei modelli di ustione alcalina corneale sono le difficoltà nel controllare l'area e la gravità dell'ustione alcalina, la variazione della neovascolarizzazione corneale e la bruciatura involontaria dei tessuti adiacenti a causa dell'eccesso di soluzione alcalina. Lo scopo di questo studio è quello di descrivere un modello di ustione alcalina corneale controllata nei topi utilizzando carta da filtro pre-imbevuta di soluzione di idrossido di sodio. Questo modello potrebbe essere utilizzato per studiare i fattori angiogenici, i reagenti terapeutici anti-angiogenici e altri fattori e reagenti che potrebbero modulare l'infiammazione e la fibrosi.

Protocollo

Tutto il lavoro sugli animali, comprese le procedure sperimentali e l'eutanasia, è stato approvato dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) del Baylor College of Medicine con il numero di protocollo AN-8790.

1. Preparazione di 1 N NaOH

  1. Aggiungere 4 mL di acqua deionizzata sterile a una provetta da centrifuga da 15 mL. Pesare 400 mg di idrossido di sodio (NaOH) e aggiungerlo con cura alla provetta.
  2. Sciogliere l'NaOH mescolando lentamente la soluzione con una bacchetta di vetro. Portare il volume a 10 ml aggiungendo acqua deionizzata sterile alla provetta e mescolare di nuovo capovolgendo delicatamente la provetta su e giù. Chiudere bene il tappo e conservare la soluzione a temperatura ambiente.
  3. Preparare la soluzione fresca ogni mese perché la concentrazione della soluzione di NaOH può essere ridotta dall'assorbimento dell'anidride carbonica nell'aria.
  4. Mescolare sempre delicatamente la soluzione di NaOH prima dell'uso.
    ATTENZIONE: Preparare la soluzione all'interno di una cappa chimica e indossare adeguati dispositivi di protezione individuale (DPI).

2. Preparazione della soluzione di paraformaldeide (PFA) al 4%

  1. Aggiungere 30 mL di 1x soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) in un bicchiere di vetro. Pesare 4 g di paraformaldeide (PFA) e aggiungerla al becher.
  2. Conservare il becher su una piastra calda a 60 °C mescolando. Aggiungere la soluzione di NaOH 1 N goccia a goccia per aumentare il pH fino a quando la soluzione non si schiarisce.
  3. Controllare e regolare il pH a 7,4 utilizzando 1 N di acido cloridrico (HCl). Regolare il volume finale a 50 mL con 1x PBS.
  4. Raffreddare e filtrare la soluzione. Conservare la soluzione a 4 °C.
    ATTENZIONE: Preparare la soluzione in una cappa aspirante indossando DPI adeguati.

3. Preparazione del cocktail ketamina/xilazina

  1. Preparare il cocktail ketamina/xilazina aggiungendo 0,8 mL di ketamina (concentrazione madre: 100 mg/mL) e 0,16 mL di xilazina (concentrazione madre: 100 mg/mL) a 9,4 mL di soluzione fisiologica.
  2. Conservare il cocktail in flaconi sterili per iniezione a temperatura ambiente (RT).

4. Ustione alcalina sulla cornea del topo

  1. Iniettare meloxicam (4-6 mg/kg di peso corporeo) per via sottocutanea 30 minuti prima della procedura per alleviare il dolore. Anestetizzare i topi (C57BL/6J, 6-8 settimane di età, maschio) utilizzando un'iniezione per via endovenosa del cocktail ketamina/xilazina (ketamina 80 mg/kg e xilazina 16 mg/kg di peso corporeo).
  2. Controllare la risposta riflessa (ritiro del pedale) pizzicando le dita del mouse e confermare l'assenza del riflesso. Applicare una goccia di anestetico topico, proparacaina allo 0,5%, sulla superficie corneale di un occhio e una goccia di lacrime artificiali sull'altro occhio.
  3. Utilizzando un punzone per biopsia da 2 mm, perforare i dischi di carta da filtro Whatman.
  4. Aggiungere 2 μL di NaOH 1N a una capsula di Petri pulita. Mettere il disco di carta da filtro da 2 mm sulla goccia di NaOH da 1 N e lasciarlo in ammollo per 15 s.
  5. Prendi la carta da filtro con una pinza e applica la carta da filtro sull'occhio trattato con proparacaina al centro della cornea per 30 secondi.
    NOTA: La carta da filtro deve toccare solo il centro della cornea e prestare attenzione per evitare il movimento della carta da filtro una volta posizionata, poiché lo spostamento della carta da filtro può causare ustioni ai tessuti adiacenti.
  6. Lavare l'occhio lavando con 20 ml di soluzione salina sterile in una siringa sterile.
    NOTA: È necessario prestare attenzione per garantire che la cornea, insieme al sacco congiuntivale, venga lavata accuratamente per garantire che non vengano danneggiati ulteriormente la cornea o il tessuto circostante. Il lavaggio del sacco congiuntivale previene ulteriormente il symblefaron.
  7. Pulisci delicatamente la soluzione salina in eccesso dagli occhi e dall'area circostante utilizzando salviette morbide usa e getta. Successivamente, tieni i topi in una gabbia di recupero su un termoforo caldo fino a quando non deambulano.
    NOTA: I topi vengono monitorati quotidianamente dopo l'ustione alcalina per 3 giorni. Se si osservano sintomi di dolore o stress, meloxicam (4-6 mg/kg di peso corporeo) viene somministrato per via sottocutanea.

5. Esame e valutazione della neovascolarizzazione e dell'opacità

  1. Nei topi anestetizzati esaminare gli occhi al microscopio di dissezione il giorno 10 dopo l'ustione e ottenere immagini utilizzando una telecamera collegata al cannocchiale di dissezione per valutare l'opacità e la neovascolarizzazione.
    NOTA: È sufficiente un normale endoscopio di dissezione con una telecamera collegata.
  2. Mentre osservi la cornea attraverso il microscopio di dissezione, valutare l'opacità dopo l'ustione in base alla seguente scala12:
    0 = Nessuna opacità; cornea chiara
    1 = Opacità lieve; leggera opacità nelle zone dell'iride e della pupilla; iride e pupilla facilmente visibili
    2 = Opacità moderata; iride e pupilla appena visibili
    3 = Opacità grave; Iride o pupilla non visibili
    4 = Cornea opaca; Iride e pupilla non visibili
  3. Mentre si osserva la cornea attraverso il microscopio da dissezione, valutare il CoNV in base alla seguente scala12:
    0 = Nessuna neovascolarizzazione; Nessun nuovo vascello dal limbus
    1 = Neovascolarizzazione lieve; nuove navi provenienti dal limbus
    2 = Neovascolarizzazione moderata; I vasi sanguigni hanno avuto origine dal limbus e si sono sviluppati verso il centro della cornea
    3 = Neovascolarizzazione grave; vasi sanguigni che originano dal limbus e che raggiungono e/o attraversano il centro della cornea
  4. Usa un test t di Student per confrontare statisticamente i punteggi di opacità e neovascolarizzazione tra i gruppi di ustioni alcaline e occhi sani.
  5. Sopprimere i topi il giorno 10 con esposizione all'isoflurano al 5% fino a 1 minuto dopo l'arresto della respirazione, seguito da lussazione cervicale, e raccogliere le cornee per l'imaging a montaggio piatto.

6. Tomografia a coerenza ottica (OCT)

  1. Acquisisci immagini OCT del segmento anteriore degli occhi nei topi anestetizzati il giorno 10 dopo l'ustione. Esegui l'acquisizione di immagini OCT come scansione volumetrica utilizzando la modalità IR + OCT con un campo visivo di 30° e un'intensità IR del 100%.
  2. Quantificare lo spessore delle cornee utilizzando il software ImageJ.
  3. Per misurare lo spessore, utilizzare lo strumento Selezione linea nel software ImageJ per creare una linea retta tra le superfici anteriore e posteriore in corrispondenza della cornea centrale.
  4. Fare clic su Analizza > Misura negli strumenti software per trasferire i valori nella finestra dei dati.
  5. Copiare i valori in un foglio di calcolo e confrontare statisticamente lo spessore corneale tra l'ustione alcalina e i gruppi oculari sani utilizzando un test t di Student.
    NOTA: Lo spessore della cornea è la distanza da un punto sulla superficie corneale anteriore al punto più vicino sulla superficie corneale posteriore al centro corneale.

7. Immunocolorazione per CoNV su cornee flat-mount

  1. Sopprimere i topi il giorno 10 dopo l'ustione alcalina ed enucleare gli occhi con una dissezione contundente.
  2. Separa le palpebre usando il pollice e l'indice e posiziona una pinza sotto il globo oculare. Chiudi la pinza ed estrai delicatamente il bulbo oculare dall'orbita.
  3. Posiziona i bulbi oculari in 1x PBS. Per ogni bulbo oculare, rimuovere la cornea dal globo oculare praticando prima un'incisione con un ago da 30 G sotto l'area del limbus.
  4. Taglia intorno all'area del limbus usando le microforbici corneali, con l'incisione come punto di partenza, e separa lentamente la cornea e il limbus dal globo.
  5. Pulisci delicatamente le cornee con un pennello fine per rimuovere l'iride. Fissare le cornee in paraformaldeide al 4% per 1 ora.
  6. Lavare le cornee tre volte per 20 minuti ciascuna in 1x PBS a temperatura ambiente (RT).
  7. Incubare in un tampone bloccante (1x PBS integrato con lo 0,1% di Triton-X 100 e il 5% di albumina sierica bovina [BSA]) per 1 ora a RT.
  8. Trasferire le cornee in una soluzione anticorpale contenente anticorpi primari. Preparare la soluzione anticorpale in 1x PBS integrato con 1% di BSA, 0,1% Triton-X 100, anticorpi monoclonali anti-CD31 coniugati Dylight550 (1:100) e anticorpi monoclonali anti-LYVE-1 coniugati con Alexa Fluor488 (1:100).
  9. Incubare per 3 giorni a 4 °C. Lavare le cornee in PBS 1x tre volte per 20 minuti ciascuna.
  10. Colorare i nuclei con la soluzione colorante Hoechst (1:1.000) per 5 minuti al buio.
  11. Appiattire le cornee con tagli radiali e montarle su un vetrino pre-pulito utilizzando il mezzo di montaggio e i vetrini coprioggetti. Sigillare i vetrini coprioggetti con smalto trasparente e asciugare i vetrini per una notte al buio prima dell'analisi al microscopio confocale.
  12. Visualizzare le cornee piatte utilizzando la microscopia confocale cucendo le singole immagini Z-stack; Utilizzare un obiettivo 10x, laser da 488 nm e 561 nm e una risoluzione di 512 pixel x 512 pixel per fetta su scanner Galvano non risonanti.
  13. Quantifica la densità del sangue CD31+ e dei vasi linfatici LYVE-1+ utilizzando il software ImageJ.
  14. Per determinare la densità vascolare, convertire le immagini confocali in un'immagine a 8 bit.
  15. Scegli Densità vascolare dai plugin.
  16. Scegli la regione di interesse sull'immagine e fai clic su OK. Le misurazioni si apriranno in una nuova finestra di dati.
  17. Copiare i valori in un foglio di calcolo e confrontare statisticamente la densità vascolare tra l'ustione alcalina e i gruppi oculari sani utilizzando un test t di Student.
    NOTA: CD31, chiamato anche molecola di adesione delle cellule endoteliali piastriniche-1 (PECAM-1), è una molecola di adesione cellulare coinvolta nell'angiogenesi ed è altamente espressa nelle cellule endoteliali dei vasi sanguigni precoci e maturi13. LYVE-1 (lymphatic vessel endothelial hyaluronan receptor-1) è un marcatore di superficie cellulare sulle cellule endoteliali linfatiche e può essere utilizzato come marcatore di linfangiogenesi14.

Risultati

Questo studio descrive un metodo per indurre l'angiogenesi corneale nell'occhio del topo mediante ustione alcalina. Le immagini ottenute con il microscopio di dissezione (Figura 1A,B) hanno dimostrato punteggi significativamente elevati di neovascolarizzazione e opacità nelle cornee nel gruppo ustionato dagli alcali (P < 0,05; Figura 1C,D). Le cornee che sono state raccolte il giorno 10 sono state ulteriormente immunocolorate con anticorpi monoclonali anti-CD31 per i vasi sanguigni e anticorpi monoclonali anti-LYVE-1 per i vasi linfatici, rispettivamente (Figura 2A-I). Il gruppo ustionato dagli alcali ha mostrato densità significativamente più elevate di vasi sanguigni e linfatici dopo 10 giorni (P < 0,001 e P < 0,05, rispettivamente; Figura 2J,K). Lo spessore della cornea, come ripreso e quantificato utilizzando l'OCT (Figura 3A,B), è stato osservato essere significativamente più alto nel gruppo con bruciatura alcalina (P < 0,01; Figura 3C).

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Figura 1: Neovascolarizzazione corneale indotta da ustioni alcaline e opacità. (A,B) La neovascolarizzazione corneale è germogliata dai vasi limbus verso il centro corneale nell'occhio di topo (A) bruciato dagli alcali (A) ma non sano 10 giorni dopo la lesione. (C,D) Quantificazione della neovascolarizzazione corneale (C) e dell'opacità (D) nei pannelli A e B (± SEM; t-test; *P < 0,05; n = 3 occhi, 1 occhio/topo). Le frecce rosse rappresentano il limbus e la freccia gialla indica la nascita di nuovi vasi. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 2: Neovascolarizzazione corneale e linfangiogenesi causate da ustione alcalina. L'immunoistochimica ha rivelato vasi sanguigni (A,D,G) e linfatici (B,E,H) utilizzando rispettivamente gli anticorpi monoclonali anti-CD31 e anti-LYVE-1. (A-C) La cornea sana del topo. (D-I) La cornea bruciata dagli alcali 10 giorni dopo l'infortunio. (C,F,I) Immagini sovrapposte dei segnali CD31 e LYVE-1. (G-I) Immagini ingrandite per i pannelli D-F. Barre della scala = (A-F) 200 μm e (G-I) 500 μm. (J,K) Quantificazione della densità dei vasi sanguigni e linfatici nei pannelli A-F, come indicato (± SEM; t-test; *P < 0,05; ***P < 0,001; n = 3 occhi, 1 occhio/topo). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 3: Aumento dello spessore corneale causato dall'ustione alcalina . (A) Un'immagine OCT di un occhio di topo sano. (B) Un'immagine OCT della cornea del topo 10 giorni dopo l'ustione alcalina. (C) Quantificazione dello spessore corneale nei pannelli A e B, misurato al centro della cornea (± SEM; t-test; **P < 0,01; n = 3 occhi, 1 occhio/topo). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

La cornea è un tessuto eccellente per lo studio dell'angiogenesi e dell'infiammazione perché è accessibile e avascolare, il che significa che la neovascolarizzazione può essere comodamente rilevata e documentata. L'ustione corneale in conigli, ratti e topi è stata utilizzata per studiare l'angiogenesi corneale, l'infiammazione e l'opacità, l'ulcerazione, la perforazione della cornea e la fibrosi15,16,17. Inoltre, il modello murino di ustione corneale è prezioso per testare varie strategie terapeutiche per l'angiogenesi e l'infiammazione perché i topi hanno un sistema immunitario strettamente correlato a quello degli esseri umani18. Anche la disponibilità di tecniche per manipolare geneticamente il genoma del topo rende la specie una scelta eccellente per questo tipo di studio19. La sfida in questa ricerca è stata quella di sviluppare un metodo di bruciatura corneale che fornisca una fisiopatologia coerente e riproducibile.

Il modello di ustione alcalina è particolarmente utile per lo screening farmacologico di farmaci che modulano l'angiogenesi, l'infiammazione e la fibrosi. I requisiti minimi di reagenti e risorse, la semplicità di esecuzione della bruciatura alcalina e i vantaggi della breve durata del protocollo e dell'osservazione diretta dei risultati rendono la bruciatura alcalina sulla cornea del topo una scelta primaria per lo screening farmacologico dei farmaci. Tuttavia, è necessario prendere in considerazione alcune precauzioni durante l'esecuzione di questa procedura per garantire coerenza e riproducibilità. Innanzitutto, la carta da filtro deve essere posizionata al centro della cornea per evitare di bruciare altre zone dell'occhio, in particolare il limbus, le palpebre e la congiuntiva; in secondo luogo, il volume e la concentrazione di NaOH dovrebbero essere appropriati per ottenere risultati coerenti dall'ustione alcalina sulla cornea. Il filtro non deve gocciolare bagnato ma deve essere stato immerso nella soluzione di NaOH. La dimensione e il tipo di filtro, nonché la normalità e il volume della soluzione utilizzata in questo metodo sono ottimizzati per evitare un trabocco di NaOH. L'utilizzo di una carta da filtro di dimensioni diverse o di un volume maggiore o minore di NaOH causerebbe incongruenze nella neovascolarizzazione. In terzo luogo, è importante evitare che la soluzione di NaOH assorba CO2 nell'aria ambiente serrando immediatamente il tappo del tubo della soluzione dopo l'uso e riducendo il rapporto aria/soluzione. È necessario prestare attenzione all'uso di soluzioni alcaline fresche per prevenire incongruenze nella neovascolarizzazione ed evitare ulcerazioni corneali. Infine, è necessario un lavaggio approfondito di tutta la soluzione di NaOH dall'occhio e dalla congiuntiva con soluzione fisiologica per prevenire ulteriori danni alla cornea e ai tessuti circostanti dell'occhio. Il lavaggio accurato della cornea e dei tessuti adiacenti previene anche il symblepharon.

Il protocollo qui descritto è un metodo efficiente e affidabile per lo studio della fisiopatologia dell'angiogenesi corneale. Questo protocollo può essere ulteriormente utilizzato per studiare l'infiammazione corneale, la fibrosi e la guarigione delle ferite.

Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato sostenuto dalla SRB Charitable Corporation, dal National Institutes of Health (NIH) P30EY002520 e da una sovvenzione istituzionale illimitata da Research to Prevent Blindness (RPB) al Dipartimento di Oftalmologia, Baylor College of Medicine. W.L. è supportato da The Knights Templar Eye Foundation Endowment in Ophthalmology.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Iniezione di cloruro di sodio allo 0,9%HospiraKL-7302
30 G AgoMcKesson16-N3005
A1R ConfocaleNikon Instruments
Anti-CD31Novus BiologicalsNB100-1642R
Anti-LYVE-1Life technologies53-0443-82
Modulo ASMHeidelberg IngegneriaObiettivo del segmento anteriore
Punzone per biopsiaMcKesson16-1309
BSAThermoscientific9048-46-8
Vetrino coprioggettiVWR International22X22-1-601640G
Microscopio per dissezioneAmScopeSM-4TZ-30WY-10M3
Fluoromount-GMicroscopia elettronica Scienze17984-25
PinzeStrumenti per la scienza fine15000-02
PinzeStrumenti per la scienza fine11049-10
PinzeFisherbrand12-000-157
Pinze RobozRS-4905
Gonak Ipromellosa Akorn17478006412
GraphPad Prism 9GraphPad Sotware, Inc
Cuscinetto riscaldanteK& H Pet Products100213018
HoeschtLife Technologies62249
HRA + OCT SpectralisHeidelberg Engineering
Siringa da insulinaMckesson102-SN310C31516P
KimwipeKimberly Clark Professional34155
Micro Cover GlassVWR48366-067
MicroforbiciRobozRS-5110
Vetrino microscopicoFisherbrand12-550-15
NaOHSigma Aldrich55881-500G
Neomicina e polimixina B Solfati e desametasone Bausch & Lomb24208-0795-35
Siero normaleJackson Immuno008-000-121
ParaformaldeideSigma Aldrich158127-500G
PBSGibco20012-027
Proparacaina HClBausch & Lomb24208073006
soluzione salinaHenry Schein1531042
SMZ125Nikon Instruments
Siringa 10 mLMcKesson16-S10C
Triton X-100Sigma AldrichTX1568-1
Whatmann Carta da filtroCytivaWHA1003323

Riferimenti

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