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Articolo metodologico

Un modello di infezione da Candida albicans correlato al catetere nel topo

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DOI:

10.3791/65307

⸱

22 marzo 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1School of Pharmacy, Health Science Center, Xi’an Jiaotong University, 2Key Laboratory of Livestock Infectious Diseases in Northeast China, Ministry of Education, College of Animal Science and Veterinary Medicine, Shenyang Agricultural University

In questo articolo

Sommario

Stabiliamo un modello murino di infezione correlata al catetere (CRI) associata a C.albicans, in cui si forma un biofilm sul catetere e l'interazione tra C.albicans e l'ospite è ben correlata con l'IRC clinico. Questo modello aiuta a selezionare le terapie per l'IRC associato al biofilm di C.albicans , gettando le basi per la trasformazione clinica.

Abstract

L'infezione correlata al catetere (CRI) è un'infezione nosocomiale comune causata dalla candida albicans durante l'impianto del catetere. In genere, i biofilm si formano sulla superficie esterna del catetere e portano a infezioni disseminate, che sono fatali per i pazienti. Non ci sono un'efficace gestione della prevenzione e del trattamento nelle cliniche. Pertanto, è urgente stabilire un modello animale di CRI per lo screening preclinico di nuove strategie per la sua prevenzione e trattamento. In questo studio, un catetere in polietilene, un catetere medico ampiamente utilizzato, è stato inserito nella parte posteriore dei topi BALB/c dopo la depilazione. Candida albicans ATCC MYA-2876 (SC5314), che esprime una proteina fluorescente verde potenziata, è stata successivamente inoculata sulla superficie della pelle lungo il catetere. Un'intensa fluorescenza è stata osservata sulla superficie del catetere al microscopio fluorescente 3 giorni dopo. Biofilm maturi e spessi sono stati trovati sulla superficie del catetere tramite microscopia elettronica a scansione. Questi risultati hanno indicato l'adesione, la colonizzazione e la formazione di biofilm di candida albicans sulla superficie del catetere. L'iperplasia dell'epidermide e l'infiltrazione di cellule infiammatorie nei campioni di pelle indicavano i cambiamenti istopatologici della pelle associata al CRI. Per riassumere, è stato stabilito con successo un modello CRI del topo. Ci si aspetta che questo modello sia utile nella ricerca e nello sviluppo della gestione terapeutica per l'IRC associato alla candida albicans .

Introduzione

Negli ultimi anni, con lo sviluppo e l'applicazione di materiali biomedici, le infezioni correlate agli impianti stanno emergendo come problemi clinici difficili 1,2. Con l'ampia applicazione dei cateteri medici nelle cliniche, il numero di infezioni e decessi correlati è enorme ogni anno 3,4. Le vie di infezione comuni di un'infezione correlata al catetere (CRI) includono: (1) agenti patogeni sulla superficie della pelle si infiltrano nel corpo e aderiscono alla superficie esterna del catetere 5,6,7; (2) agenti patogeni derivati da operazioni asettiche improprie invadono, aderiscono e colonizzano il catetere; (3) gli agenti patogeni nella circolazione sanguigna aderiscono e colonizzano il catetere; (4) farmaci contaminati da microrganismi patogeni.

La candida è la terza causa più comune di CRI 8,9. È molto probabile che causi infezioni del flusso sanguigno e altre candidosi invasive pericolose per la vita dopo che si sono formati biofilm sulla superficie dell'impianto. La prognosi è infausta e il tasso di mortalità è alto2. È stato riportato che i biofilm si formano sulla superficie del catetere entro 2 settimane dall'inserimento venoso centrale e nel lume del catetere poche settimane dopo10,11.

I biofilm di Candida albicans (C. albicans) formati sui cateteri medici mostrano una rete a doppio strato composta da lievito, stroma e micelio12,13. La formazione di biofilm di C. albicans non è solo una chiave per la resistenza ai farmaci e l'evasione immunitaria13, ma anche vitale per produrre spore disseminate, che portano a ulteriori infezioni ematogene 2,12 e si traducono in conseguenze più gravi e persino pericolose per la vita. L'IRC associata a C. albicans è una delle principali cause di infezioni cliniche fungine del flusso sanguigno 7,14 e oltre il 40% dei pazienti con infezione da C. albicans nel catetere venoso centrale svilupperà in batteriemia15.

Secondo la Infectious Disease Society of America, il trattamento raccomandato della Candida CRI include (1) la rimozione del catetere infetto; (2) sottoporre i pazienti a una terapia antimicotica sistemica di 14 giorni8; (3) Reimpianto di un nuovo catetere4. Tuttavia, nelle applicazioni cliniche, a volte i cateteri non possono essere rimossi completamente. Alcuni pazienti possono essere trattati solo con antibiotici sistemici e terapia antimicrobica lock, accompagnati da forti effetti collaterali16,17.

I modelli animali esistenti di C. albicans, come il modello di candidosi orofaringea, il modello di candidosi vaginale e il modello di infezione sistemica invasiva causata da candidosi18,19 non possono correlare bene con l'IRC clinico. Pertanto, in questo studio, è stato stabilito un modello di CRI associato a C. albicans nei topi. I cateteri in polietilene di uso clinico comunemente usati sono stati utilizzati come impianti sottocutanei20,21 e C. albicans sono stati inoculati sulla superficie cutanea per simulare l'adesione di C. albicans ai cateteri medici e la formazione di biofilm.

Questo modello è stato utilizzato con successo nel nostro laboratorio per lo screening dell'effetto anti-biofilm di diverse terapie22. Inoltre, a causa del ritardo nel rilevamento di C. albicans dopo l'infezione da catetere, è stato costruito e inoculato nei topi un ceppo di C. albicans contenente una proteina fluorescente verde potenziata (EGFP) per facilitare l'osservazione intuitiva delle colonie e dei biofilm di C. albicans sul catetere impiantato.

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Protocollo

Gli animali da esperimento, topi maschi BALB/c (12-16 g), sono stati acquistati dal Laboratory Animal Center, Xi'an Jiaotong University Health Science Center. Tutte le procedure sono state approvate dall'Institutional Animal Ethical Committee della Xi'an Jiaotong University con il numero di licenza SCXK (Shaanxi) 2021-103.

1. Preparazione del tampone e dell'attrezzatura

  1. Ceppi di C. albicans con un plasmide ad alta espressione pCaExp.
    1. Acquista C. albicans (SC5314) da ATCC. Ottenere il ceppo fluorescente ad alta espressioneEGFP 22 trasfettando C. albicans con un plasmide ad alta espressione pCaExp contenente il frame di lettura aperto completo del gene EGFP (la mappa plasmidica è mostrata nella Figura 1) e utilizzarlo per esperimenti successivi.
  2. Coltura dei ceppi trasfettati di C. albicans .
    1. Selezionare colonie monoclonali del ceppo fluorescente di C. albicans dalla piastra di terreno peptone destrosio (YPD) dell'estratto di lievito e coltura durante la notte (30 °C e 220 rpm) in 5 mL di terreno liquido YPD (YPD + 50 μg/mL di carbenicillina).
    2. Risospendere il C. albicans in soluzione fisiologica normale dopo centrifugazione a 400 x g per 5 minuti a RT.
    3. Regolare la concentrazione della sospensione di C. albicans a 1 x 108 cellule/mL confrontando la torbidità con lo standard McFarland di 0,5.
  3. Preparare gli strumenti chirurgici.
    1. Assicurarsi di sterilizzare in autoclave tutti gli strumenti chirurgici (forbici, pinze, pinze emostatiche, portaaghi, aghi da sutura) a 121°C per 30 min. Vengono utilizzati cateteri sterili in polietilene (diametro interno: 0,28 mm; diametro esterno: 0,63 mm).
      NOTA: I cateteri utilizzati in questo studio sono stati sterilizzati con gas ossido di etilene e la confezione è stata aperta in un tavolo ultra-pulito esposto ai raggi UV per più di 30 minuti. Prima dell'impianto nei topi, i cateteri sono stati immersi in etanolo al 75% per prevenire la contaminazione.

2. Creazione di un modello CRI murino

NOTA: La procedura chirurgica è mostrata nella Figura 2.

  1. Acclimatare 30 topi BALB/c (12-16 g, maschi) in condizioni di assenza di patogeni specifici (SPF) con libero accesso ad acqua e cibo e ciclo alternato di luce e buio di 12 ore-12 ore.
  2. Dividere in modo casuale 30 topi BALB/c in tre gruppi (n = 10 topi/gruppo): (A) gruppo di controllo normale; (B) gruppo catetere (cateteri impiantati senza C. albicans); (C) Gruppo modello (cateteri impiantati con C. albicans).
  3. Anestetizzare i topi con isoflurano all'1-4% e posizionare i topi su un tavolo operatorio in posizione prona. La perdita del riflesso di raddrizzamento e l'assenza di risposta alla stimolazione delle dita dei piedi confermano il successo dell'anestesia. Rimuovere i peli e sterilizzare il sito chirurgico con tre cicli alternati di scrub iodofori o clorexidina e alcol.
  4. Lasciare i topi nel normale gruppo di controllo senza alcun trattamento e fornire libero accesso a cibo e acqua.
  5. Per i topi nei gruppi catetere e modello, mantenere l'anestesia al 3% di isoflurano. Confermare l'adeguata profondità dell'anestetico in assenza di una risposta al pizzicamento del dito del piede e regolare la concentrazione di isoflurano secondo necessità.
  6. Per i topi nel gruppo catetere, inserire per via intradermica un ago da siringa sterile da 1 mL nell'area depilata per creare un foro. Inserire un catetere (lungo circa 1 cm) nel foro dopo aver rimosso l'ago della siringa.
  7. Per i topi del gruppo modello, pipettare 20 μL di sospensione di C. albicans sull'area di depilazione posteriore per simulare la presenza commensale di C. albicans sulla pelle.
  8. Dopo che la soluzione è stata assorbita dalla pelle, inserire un catetere nell'area depilata con le stesse procedure descritte al punto 2.5.
  9. Pipettare altri 20 μL di sospensione di C. albicans lungo il catetere al tessuto per simulare C. albicans nell'ambiente esterno.
  10. Fissare i cateteri con nastro adesivo e garza e riportare i topi nelle gabbie per l'alimentazione. Al termine del trattamento, iniettare per via sottocutanea ai topi meloxicam (4 mg/kg) come analgesia per tre giorni consecutivi.
    NOTA: Dopo l'intervento chirurgico, i topi sono stati nutriti con cura con acqua e cibo. I topi sono stati monitorati due volte al giorno. I topi sono stati soppressi con un metodo approvato dalla IACUC se hanno avuto difficoltà di alimentazione, significativa perdita di peso (10-20%) e ipotermia.

3. Valutazione del modello CRI

  1. Dopo 3 giorni, anestetizzare i topi con isoflurano al 3% e sacrificarli per lussazione cervicale. Raccogliere i cateteri e i campioni di tessuto cutaneo dalla parte posteriore dei topi.
  2. Osservare C. albicans e i biofilm sul catetere mediante microscopia elettronica a scansione.
    1. Immergere i cateteri in una soluzione di glutaraldeide al 2,5% a 4 °C per 48 ore. Sciacquare i cateteri con PBS sterile tre volte.
    2. Fissare i cateteri con acido osmico all'1% per 3 ore e risciacquarli tre volte con PBS sterile.
    3. Disidratare le cellule sui cateteri in soluzione di etanolo in gradiente con concentrazioni crescenti (50%, 70%, 80%, 90% e 100%, 15 min/gradiente).
    4. Immergere i cateteri in alcol terz-butilico tre volte (30 minuti ogni volta).
    5. Congelare rapidamente i cateteri in azoto liquido e liofilizzare il campione in un liofilizzatore secondo le istruzioni del produttore.
    6. Rivestire i campioni del catetere con un oro a 10 nm mediante deposizione di fascio ionico.
    7. Osservare la presenza di C. albicans e del suo biofilm sulla superficie del catetere di ciascun gruppo al microscopio elettronico a scansione (in condizioni di alto vuoto, 1,5 kV) e registrare le immagini in ciascun gruppo.
  3. Osservare C. albicans sul catetere mediante microscopia a fluorescenza.
    1. Immergere i cateteri in una soluzione di paraformaldeide al 4% per il fissaggio a 4 °C per 48 ore.
    2. Osservare la presenza di C. albicans e del suo biofilm sulla superficie del catetere di ciascun gruppo con un microscopio a fluorescenza con eccitazione di 484 nm e registrare le immagini in ciascun gruppo.
      NOTA: L'ingrandimento è 400x. La fluorescenza di Candida albicans può essere osservata con eccitazione a 490 nm ed emissione a 510 nm.
  4. Osservate C. albicans che risiede nella pelle del topo.
    1. Immergere i tessuti cutanei dorsali dei topi in una soluzione di paraformaldeide al 4% per il fissaggio a 4 °C per 48 ore.
    2. Disidratare i tessuti cutanei dorsali in una soluzione di etanolo a gradiente con concentrazioni crescenti (50%, 70%, 80%, 90% e 100%, 15 min/gradiente).
    3. Incorporare i tessuti cutanei dorsali disidratati in paraffina a 55-60 °C. Prestare attenzione alla temperatura per evitare tessuti fragili. Per rimuovere il maggior numero possibile di impurità, ripetere questo passaggio tre volte (30 minuti ciascuna).
    4. Sezionare i tessuti cutanei dorsali (spessore = 5 μm) con un microtomo.
    5. Decerare le sezioni di paraffina immergendo i vetrini in xilene due volte per 20 min.
    6. Reidratare le sezioni tramite eluizione con etanolo a gradiente (etanolo assoluto, etanolo al 90%, etanolo al 75%, acqua) per 5 minuti ogni volta.
    7. Colorare le sezioni con acido periodico immergendo la sezione nella soluzione acida periodica per 15 minuti prima di lavare con acqua corrente una volta e acqua distillata due volte.
    8. Colorare le sezioni con una soluzione colorante chevron (secondo le istruzioni del produttore) per 30 minuti al buio e sciacquare le sezioni sotto l'acqua corrente per 5 minuti.
    9. Immergere le sezioni in una soluzione di ematossilina per 3-5 minuti prima del lavaggio rispettivamente con acqua corrente (2-3 minuti), soluzione differenziata (5-10 minuti) e acqua corrente.
    10. Immergere le sezioni in etanolo tre volte (5 minuti ciascuna) e xilene due volte (5 minuti ciascuna) prima di sigillare la sezione con gomma neutra.
    11. Osservare le immagini dell'esemplare con un microscopio e analizzare i residui di C. albicans nella pelle di topo.
      NOTA: L'ingrandimento è 10x per l'oculare e 4x o 10x per l'obiettivo.
  5. Osservare i cambiamenti istopatologici nei tessuti cutanei dorsali.
    1. Immergere i tessuti cutanei dorsali in una soluzione di paraformaldeide al 4% per il fissaggio a 4 °C per 48 ore. Disidratare i tessuti cutanei dorsali in una soluzione di etanolo a gradiente con concentrazioni crescenti (50%, 70%, 80%, 90% e 100%, 15 min/gradiente).
    2. Incorporare i tessuti cutanei dorsali disidratati nella paraffina come descritto al punto 3.4.3.
    3. Sezionare i tessuti cutanei dorsali (spessore = 5 mm) con un microtomo.
    4. Decerare le sezioni di paraffina immergendo i vetrini in xilene due volte per 20 min.
    5. Reidratare le sezioni tramite eluizione con etanolo a gradiente (etanolo assoluto, etanolo al 90%, etanolo al 75%, acqua) per 5 minuti ogni volta.
    6. Colorare le sezioni con ematossilina per 4 minuti prima di risciacquare con acqua di rubinetto per rimuovere il colore del galleggiante.
    7. Differenziare il campione con una soluzione di acido cloridrico ed etanolo all'1% prima di risciacquare i vetrini con acqua corrente.
    8. Immergere il campione in etanolo all'85% e al 95% per 5 minuti e colorarlo con una soluzione di eosina per 3 minuti.
    9. Disidratare il campione immergendolo in etanolo a gradiente (70%, 90%, 95% e 100%) e xilene per 2 minuti ciascuno.
    10. Sigillare il campione con resina neutra.
    11. Osservare le immagini del campione con un microscopio e analizzare i cambiamenti patologici.

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Risultati

Il SEM ha potuto osservare i C. albicans e i biofilm sui cateteri. Come mostrato nella Figura 322, la superficie dei cateteri in polietilene nel gruppo catetere era liscia e non è stato osservato alcun microrganismo patogeno aderente. Tuttavia, i biofilm maturi e densi di C. albicans erano visibili sulla superficie dei cateteri in polietilene nel gruppo modello, indicando che C. albicans poteva colonizzare e formare con successo biofilm sull...

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Discussione

L'IRC è una delle infezioni nosocomiali più comuni nella pratica clinica23. Gli agenti patogeni negli annessi cutanei, come l'epidermide, le ghiandole sebacee e i follicoli piliferi, sono tutte possibili cause di CRI23,24. La Candida è il terzo più grande agente patogeno che causa l'IRC, in cui la Candida albicans era il tipo più comune di infezione da biofilm25,26

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari o relazioni personali che possano aver influenzato il lavoro riportato in questo articolo.

Ringraziamenti

Siamo grati per il sostegno finanziario della Natural Science Foundation della provincia dello Shaanxi (numero di sovvenzione 2021SF-118) e della National Natural Science Foundation of China (numero di sovvenzione 81973409, 82204631).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
0,5 Mactutrius turbidibrisShanghai Lujing Technology Co., Ltd5106063
2,5% soluzione fissativa glutaraldeideXingzhi Biotechnology Co., LtdDF015
4 gradi C frigoriferoElectrolux (China) Electric Co., LtdESE6539TA
AgarBeijing Aoboxing Bio-tech Co., Ltd01-023
Bilance analiticheShimadzuATX124
Autoclavi SterilizzatoreSANYOMLS-3750
ButanoloTianjin Chemio Reagent Co., Ltd200-889-7
CarbenicillinaAmrescoC0885
Eclipse Ci Nikon microscopio ottico verticale NikonEclipse Ts2-FL
GlucosioMacklin 
Anello di inoculazioneThermo Scientific251586
IsofluranoRWD20210103
ParaformaldeideBeyotime BiotechnologyP0099
Kit colorante PASServicebioG1285
PeptoneBeijing Aoboxing Bio-tech Co., Ltd01-001
Catetere in polietileneShining Plastic MallPE100
RWD R550 macchina per anestesia multicanale per piccoli animali RWDR550
SEMHitachiTM-1000
Incubatore di temperaturaShanghai Zhichu Instrument Co., LtdZQTY-50N
Generatore di acqua ultrapuraHeal ForceNW20VF
Macchina ad ultrasuoniDo-ChromDS10260D
XyleneSinopharm  Reagente chimico Co., Ltd10023428
Estratto di lievitoThermo Scientific  OssoidiLP0021B
D823520

Riferimenti

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