Isolamento di nuclei da cellule progenitrici cardiache di topo per il profilo dell'epigenoma e dell'espressione genica a risoluzione di singole cellule

Stephanie Ibrahim; Catherine Robert; Camille Humbert; Clotilde Ferreira; Gwenaëlle Collod; Sonia Stefanovic

doi:10.3791/65328

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Articolo metodologico

Isolamento di nuclei da cellule progenitrici cardiache di topo per il profilo dell'epigenoma e dell'espressione genica a risoluzione di singole cellule

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DOI:

10.3791/65328

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12 maggio 2023

Stephanie Ibrahim¹ , Catherine Robert² , Camille Humbert² , Clotilde Ferreira¹ , Gwenaëlle Collod² , Sonia Stefanovic¹

¹Center for Cardiovascular Disease & Nutrition, U1263, Aix-Marseille University, ²Marseille Medical Genetics, U1251, Aix-Marseille University

In questo articolo

Sommario

Qui, presentiamo un protocollo che descrive la preparazione dei nuclei cellulari. Dopo la microdissezione e la dissociazione enzimatica del tessuto cardiaco in singole cellule, le cellule progenitrici sono state congelate, seguite dall'isolamento di cellule vitali pure, che sono state utilizzate per il sequenziamento dell'RNA a singolo nucleo e dal test a nucleo singolo per la cromatina accessibile alla trasposasi con analisi di sequenziamento ad alto rendimento.

Abstract

Il cuore in via di sviluppo è una struttura complessa contenente varie cellule progenitrici controllate da complessi meccanismi di regolazione. L'esame dell'espressione genica e dello stato della cromatina delle singole cellule consente l'identificazione del tipo e dello stato cellulare. Gli approcci di sequenziamento a singola cellula hanno rivelato una serie di importanti caratteristiche dell'eterogeneità delle cellule progenitrici cardiache. Tuttavia, questi metodi sono generalmente limitati al tessuto fresco, il che limita gli studi con diverse condizioni sperimentali, poiché il tessuto fresco deve essere trattato contemporaneamente nello stesso ciclo per ridurre la variabilità tecnica. Pertanto, in quest'area sono necessarie procedure semplici e flessibili per produrre dati da metodi quali il sequenziamento dell'RNA a singolo nucleo (snRNA-seq) e il saggio a nucleo singolo per la cromatina accessibile alla trasposasi con sequenziamento ad alta produttività (snATAC-seq). Qui, presentiamo un protocollo per isolare rapidamente i nuclei per i successivi nuclei singoli dual-omici (combinati snRNA-seq e snATAC-seq). Questo metodo consente l'isolamento di nuclei da campioni congelati di cellule progenitrici cardiache e può essere combinato con piattaforme che utilizzano camere microfluidiche.

Introduzione

Tra i difetti alla nascita, i difetti cardiaci congeniti (CHD) sono i più comuni, che si verificano in circa l'1% dei nati vivi ogni anno ^1,2. Le mutazioni genetiche sono identificate solo in una minoranza di casi, il che implica che altre cause, come anomalie nella regolazione genica, sono coinvolte nell'eziologia della CHD ^2,3. Lo sviluppo cardiaco è un processo complesso di tipi cellulari diversi e interagenti, che rende difficile l'identificazione delle mutazioni causali non codificanti e dei loro effetti sulla regolazione genica. L'organogenesi de....