Articolo metodologico

Modello murino di arresto cardiaco per l'imaging cerebrale e il monitoraggio della fisiologia cerebrale durante l'ischemia e la rianimazione

DOI:

10.3791/65340

⸱

14 aprile 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Multidisciplinary Brain Protection Program, Department of Anesthesiology, Duke University Medical Center, 2Department of Biomedical Engineering, Duke University, 3Department of Anesthesiology and Pain Management, UT Southwestern University Medical Center

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo protocollo dimostra un modello murino unico di arresto cardiaco per asfissia che non richiede compressione toracica per la rianimazione. Questo modello è utile per il monitoraggio e l'imaging delle dinamiche della fisiologia cerebrale durante l'arresto cardiaco e la rianimazione.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La maggior parte dei sopravvissuti all'arresto cardiaco (CA) sperimenta vari gradi di deficit neurologici. Per comprendere i meccanismi che sono alla base del danno cerebrale indotto da CA e, successivamente, sviluppare trattamenti efficaci, la ricerca sperimentale sulla CA è essenziale. A tal fine, sono stati stabiliti alcuni modelli di CA del topo. Nella maggior parte di questi modelli, i topi vengono posti in posizione supina per eseguire la compressione toracica per la rianimazione cardiopolmonare (RCP). Tuttavia, questa procedura di rianimazione rende difficile l'imaging/monitoraggio in tempo reale della fisiologia cerebrale durante la CA e la rianimazione. Per ottenere tali conoscenze critiche, il presente protocollo presenta un modello murino di CA per asfissia che non richiede la fase di RCP di compressione toracica. Questo modello consente lo studio dei cambiamenti dinamici nel flusso sanguigno, nella struttura vascolare, nei potenziali elettrici e nell'ossigeno del tessuto cerebrale dal basale pre-CA alla riperfusione post-CA precoce. È importante sottolineare che questo modello si applica ai topi anziani. Pertanto, questo modello murino di CA dovrebbe essere uno strumento fondamentale per decifrare l'impatto della CA sulla fisiologia del cervello.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L'arresto cardiaco (CA) rimane una crisi di salute pubblica globale1. Solo negli Stati Uniti vengono segnalati ogni anno più di 356.000 casi di CA extraospedaliera e 290.000 casi di CA in ospedale e la maggior parte delle vittime di CA ha più di 60 anni. In particolare, le compromissioni neurologiche post-CA sono comuni tra i sopravvissuti e rappresentano una sfida importante per la gestione della CA 2,3,4,5. Per comprendere i cambiamenti patologici cerebrali post-CA e i loro effetti sugli esiti neurologici, sono state applicate varie tecniche di monitoraggio neurofisiologico e del tessuto cerebrale nei pazienti 6,7,8,9,10,11,12. Utilizzando la spettroscopia nel vicino infrarosso, il monitoraggio cerebrale in tempo reale è stato eseguito anche nei ratti CA per prevedere gli esiti neurologici13.

Tuttavia, nei modelli murini di CA, tale approccio di imaging è stato complicato dalla necessità di compressioni toraciche per ripristinare la circolazione spontanea, che comporta sempre un notevole movimento fisico e, quindi, ostacola delicate procedure di imaging. Inoltre, i modelli di CA vengono normalmente eseguiti con topi in posizione supina, mentre i topi devono essere girati in posizione prona per molte modalità di imaging cerebrale. Pertanto, in molti casi è necessario un modello murino con un movimento minimo del corpo durante l'intervento chirurgico per eseguire l'imaging/monitoraggio in tempo reale del cervello durante l'intera procedura CA, che va dal pre-CA al post-rianimazione.

In precedenza, Zhang et al. hanno riportato un modello di CA murino che potrebbe essere utile per l'imaging cerebrale14. Nel loro modello, la CA è stata indotta da iniezioni in bolo di vecuronio ed esmololo seguite dalla cessazione della ventilazione meccanica. Hanno dimostrato che dopo 5 minuti di CA, la rianimazione potrebbe essere ottenuta infondendo una miscela di rianimazione. In particolare, tuttavia, l'arresto circolatorio nel loro modello si è verificato solo circa 10 secondi dopo l'iniezione di esmololo. Pertanto, questo modello non ricapitola la progressione della CA indotta da asfissia nei pazienti, compresa l'ipercapnia e l'ipossia tissutale durante il periodo pre-arresto.

L'obiettivo generale dell'attuale procedura chirurgica è quello di modellare l'asfissia clinica CA nei topi seguita da rianimazione senza compressioni toraciche. Questo modello di CA, quindi, consente l'uso di tecniche di imaging complesse per studiare la fisiologia del cervello nei topi15.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Protocollo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutte le procedure qui descritte sono state condotte in conformità con le linee guida del National Institutes of Health (NIH) per la cura e l'uso degli animali nella ricerca e il protocollo è stato approvato dal Duke Institute of Animal Care and Use Committee (IACUC). Per il presente studio sono stati utilizzati topi maschi e femmine C57BL/6 di età compresa tra 8 e 10 settimane.

1. Preparazione chirurgica

  1. Pesa un mouse su una bilancia digitale e mettilo in una scatola di induzione per anestesia in plexiglass da 4 pollici x 4 pollici x 7.
  2. Regolare il vaporizzatore per anestesia al 5% di isoflurano, il flussometro dell'ossigeno a 30 e il flussometro dell'azoto a 70 (vedere la tabella dei materiali).
  3. Estrarre l'animale dalla scatola di induzione e adagiarlo in posizione supina sul banco operatorio quando la sua frequenza respiratoria è scesa a 30-40 respiri al minuto.
  4. Estrarre la lingua con una pinza smussata e tenerla con la mano non dominante. Usa la mano dominante per inserire un laringoscopio (vedi Tabella dei materiali) nella bocca del topo e visualizzare le corde vocali.
  5. Utilizzare la mano non dominante per inserire un filo guida e un catetere endovenoso da 20 G nella bocca. Inserire delicatamente il filo guida nella trachea.
  6. Spingere il catetere nella trachea fino a quando la parte alare del catetere non è a posto con la punta del naso.
    NOTA: Non intubare un topo che non è completamente anestetizzato poiché ciò potrebbe ferire la trachea e causare sanguinamento delle vie aeree.
  7. Collegare il topo intubato a un ventilatore per animali di piccola taglia (vedere la tabella dei materiali) e ridurre l'isoflurano all'1,5%.
  8. Inserire il peso corporeo del topo nel pannello di controllo del ventilatore per determinare il volume corrente e la frequenza respiratoria.
  9. Tenere il mouse in posizione supina sotto una lampada riscaldante e mantenere la temperatura rettale a 37 °C con un termoregolatore.
  10. Radere le aree inguinali, disinfettare l'area chirurgica almeno tre volte con iodio e alcol (vedere la tabella dei materiali) e coprire l'area con un telo chirurgico sterile.
  11. Applicare un unguento per gli occhi su entrambi gli occhi e somministrare 5 mg/kg di carprofene per via sottocutanea prima dell'intervento.
  12. Aprire la confezione sterile dello strumento per l'intervento chirurgico. Praticare un'incisione cutanea di 1 cm con forbici chirurgiche per accedere alle arterie femorali su entrambi i lati. Sezionare e legare l'arteria femorale distale con un singolo filo di sutura di seta 4-0 (vedi Tabella dei materiali) e applicare una goccia di lidocaina.
  13. Applicare una clip per aneurisma all'arteria femorale prossimale e praticare un piccolo taglio sull'arteria distale rispetto alla clip. Inserire un catetere in polietilene 10 (PE-10, vedere Tabella dei materiali) nelle arterie femorali sinistra e destra.
    NOTA: La linea arteriosa sinistra viene utilizzata per il monitoraggio della pressione arteriosa, mentre quella destra viene utilizzata per il prelievo di sangue e l'infusione della miscela per la rianimazione.
  14. Iniettare 50 μL di soluzione fisiologica eparinizzata 1:10 in ciascuna linea arteriosa per prevenire la coagulazione nella linea.
  15. Ruotare il mouse in posizione prona e montarlo su un telaio per la testa stereotassica.
  16. Collegare tre elettrodi ad ago (rosso, verde e nero) al braccio sinistro, alla gamba sinistra e al braccio destro per il monitoraggio dell'elettrocardiogramma (ECG, vedere la tabella dei materiali).
  17. Incollare una sonda flessibile in fibra di plastica sul cranio temporale intatto attraverso un'incisione cutanea di 0,5 cm per il monitoraggio del flusso sanguigno cerebrale. Questo passaggio è facoltativo.
  18. Radere la parte superiore della testa, disinfettare l'area chirurgica almeno tre volte con iodio e alcol e coprire l'area con un telo chirurgico sterile.
  19. Praticare un'incisione cutanea di 2,5 cm sulla linea mediana e utilizzare quattro piccoli divaricatori per esporre l'intera superficie del cranio per l'imaging cerebrale.
  20. Posizionare un imager di monitoraggio (ad es. un imager a contrasto a macchie laser, vedere Tabella dei materiali) sopra la testa.
    NOTA: Alcune gocce di soluzione fisiologica possono essere aggiunte alla superficie del cranio per facilitare l'imaging con contrasto con macchioline laser.

2. Induzione dell'arresto cardiaco

  1. Riempire una siringa di plastica da 1 mL con 26 μL di soluzione madre del cocktail per la rianimazione.
    NOTA: Ogni millilitro di questa soluzione contiene 400 μL di 1 mg/mL di epinefrina, 500 μL di bicarbonato di sodio all'8,4%, 50 μL di eparina 1.000 U/mL e 50 μL di cloruro di sodio allo 0,9% (vedere la tabella dei materiali).
  2. Attendere che la temperatura corporea raggiunga i 37 °C. Regolare il misuratore di ossigeno al 100% per ossigenare il sangue per 2 minuti.
  3. Prelevare il sangue arterioso ossigenato fino a 200 μL attraverso l'arteria femorale destra nella siringa di plastica preparata contenente 26 μL di soluzione madre per cocktail di rianimazione.
  4. Spegnere l'ossigeno e aumentare l'azoto al 100% per indurre l'anossia.
    NOTA: Dopo circa 45 secondi, il cuore non funzionerà più e la frequenza cardiaca diminuirà rapidamente, indicando l'insorgenza di CA. Dopo circa 2 minuti di privazione di ossigeno, il monitoraggio ECG indicherà un'asistolia e non ci sarà alcuna pressione sanguigna sistemica misurabile e un flusso sanguigno cerebrale trascurabile.
  5. Spegnere il ventilatore, il vaporizzatore di isoflurano, il regolatore di temperatura e il flussometro di azoto. Regolare l'ossigeno al 100% in preparazione alla rianimazione.

3. Procedura di rianimazione

  1. Accendere il ventilatore dopo 8 minuti dall'insorgenza della CA.
  2. Iniziare immediatamente a infondere il sangue ossigenato prelevato miscelato con il cocktail di rianimazione nella circolazione sanguigna attraverso l'arteria femorale destra in 1 minuto.
    NOTA: L'infusione porta ad un graduale aumento della frequenza cardiaca e al ripristino della perfusione sanguigna; alla fine, si ottiene il ritorno della circolazione spontanea (ROSC).

4. Recupero post-CA

  1. Posizionare il topo in posizione supina dopo averlo rimosso dalla struttura stereotassica e rimuovere i cateteri PE-10 dalle arterie femorali.
  2. Applicare bupivacaina allo 0,25% sull'incisione cutanea e suturare le incisioni cutanee utilizzando una sutura di nylon 6-0 (vedere la tabella dei materiali). Applicare un unguento antibiotico sulla superficie dell'incisione cutanea.
  3. Scollegare il ventilatore per topi quando viene ripristinata la respirazione spontanea.
  4. Trasferire il mouse in una camera di recupero a temperatura controllata di 32 °C.
  5. Dopo 2 ore di recupero, estubare il topo e tornare nella gabbia di casa. Iniettare 0,5 ml di soluzione fisiologica normale per via sottocutanea per prevenire la disidratazione.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Risultati

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Per indurre la CA, il topo è stato anestetizzato con isoflurano all'1,5% e ventilato con azoto al 100%. Questa condizione ha portato a una grave bradicardia in 45 secondi (Figura 1). Dopo 2 minuti di anossia, la frequenza cardiaca si è ridotta drasticamente (Figura 2), la pressione sanguigna è scesa al di sotto di 20 mmHg e il flusso sanguigno cerebrale è cessato completamente (Figura 1). Quando l'isoflurano è stato spento, la tempe...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Negli studi sperimentali di CA, l'asfissia, le iniezioni di cloruro di potassio o la fibrillazione ventricolare derivata da corrente elettrica sono state utilizzate per indurre CA 16,17,18,19,20,21,22,23. Normalmente, la RCP è necessaria per la rianimazione...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno conflitti di interesse.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori ringraziano Kathy Gage per il suo supporto editoriale. Questo studio è stato supportato da fondi del Dipartimento di Anestesiologia (Duke University Medical Center), dalla sovvenzione dell'American Heart Association (18CSA34080277) e dalle sovvenzioni del National Institutes of Health (NIH) (NS099590, HL157354, NS117973 e NS127163).

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
AdrenalinaPar PharmaceuticalNDC 42023-159-01
Tamponi imbevuti di alcolBD326895
Animal Bio AmpADInstrumentsFE232
Trasduttore BPADInstruments MLT0699
Bridge AmpADInstrumentsFE117
Iniezione di eparina sodica, USPFresenius KabiNDC 63323-540-05
IsofluranoCovetrusNDC 11695-6777-2
Monitor di perfusione laser DopplerMoor InstrumentsmoorVMS-LDF1
Sistema di imaging laser speckleRWDRFLSI III
Unguento lubrificante per gli occhiBausch + Lomb339081
Micro clipRobozRS-5431
Sonda rettale per topoPhysitempRET-3
Elettrodo ad agoADInstrumentsMLA121329 Ga, attacco da 1,5 mm
AzotoAirgasUN1066
Fibra ottica in plasticaMoor InstrumentsPOF500
OtoscopioWelchallyn7282,5 mm Speculum
OxygenAirgasUN1072
Tubo PE-10BD427401Tubo in polietilene
Povidone-iodioCVS955338
PowerLab 8/35ADInstruments
Rimadyl (carprofene)Zoetis6100701Iniettabile 50 mg/ml
Ventilatore per piccoli animaliKent ScientificRoVent Jr.
Regolatore di temperaturaPhysitempTCAT-2DF
Triplo antibiorico e antidolorificoCVSNDC 59770-823-56
VaporizzatoreRWDR583S
0,25% bupivacainaHospiraNDC 0409-1159-18
0,9% croururo di sodioICU MedicalNDC 0990-7983-03
1 mL di plastica siringaBD309659
4-0 sutura in setaLookSP116Seta intrecciata nera
6-0 sutura in nylonEthilon1698G
8,4% bicarbonato di sodio Inj., USPHospiraNDC 0409-6625-02
Catetere IV da 20 GBD38153420GA 1,6 IN
30 G Ago PrecisionGlideBD30510630 G X 1/2

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Smith, A., Masters, S., Ball, S., Finn, J. The incidence and outcomes of out-of-hospital cardiac arrest in metropolitan versus rural locations: A systematic review and meta-analysis. Resuscitation. 185, 109655(2022).
  2. Amacher, S. A., et al. Predicting neurological outcome in adult patients with cardiac arrest: systematic review and meta-analysis of prediction model performance. Critical Care. 26 (1), 382(2022).
  3. Matsuyama, T., Ohta, B., Kiyohara, K., Kitamura, T. Intra-arrest partial carbon dioxide level and favorable neurological outcome after out-of-hospital cardiac arrest: A nationwide multicenter observational study in Japan (the JAAM-OHCA registry). European Heart Journal of Acute Cardiovascular Care. 12 (1), 14-21 (2023).
  4. Takahagi, M., Sawano, H., Moriyama, T. Long-term neurological outcome of extracorporeal cardiopulmonary resuscitation for out-of-hospital cardiac arrest patients with nonshockable rhythms: A single-center, consecutive, retrospective observational study. The Journal of Emergency Medicine. 63 (3), 367-375 (2022).
  5. Mork, S. R., Botker, M. T., Christensen, S., Tang, M., Terkelsen, C. J. Survival and neurological outcome after out-of-hospital cardiac arrest treated with and without mechanical circulatory support. Resuscition Plus. 10, 100230(2022).
  6. Koenig, M. A., Kaplan, P. W., Thakor, N. V. Clinical neurophysiologic monitoring and brain injury from cardiac arrest. Neurologic Clinics. 24 (1), 89-106 (2006).
  7. Cavazzoni, E., Schibler, A. Monitoring of brain tissue oxygen tension and use of vasopressin after cardiac arrest in a child with catecholamine-induced cardiac arrhythmia. Critical Care & Resuscitation. 10 (4), 316-319 (2008).
  8. Topjian, A. A., et al. Multimodal monitoring including early EEG improves stratification of brain injury severity after pediatric cardiac arrest. Resuscitation. 167, 282-288 (2021).
  9. Beekman, R., et al. Bedside monitoring of hypoxic ischemic brain injury using low-field, portable brain magnetic resonance imaging after cardiac arrest. Resuscitation. 176, 150-158 (2022).
  10. Sinha, N., Parnia, S. Monitoring the brain after cardiac arrest: A new era. Current Neurology Neuroscience Report. 17 (8), 62(2017).
  11. Reis, C., et al. Pathophysiology and the monitoring methods for cardiac arrest associated brain injury. International Journal of Molecular Sciences. 18 (1), 129(2017).
  12. Zhou, H., Lin, C., Liu, J., Wang, X. Continuous monitoring of brain perfusion by cerebral oximetry after spontaneous return of circulation in cardiac arrest: A case report. BMC Neurology. 22 (1), 365(2022).
  13. Takegawa, R., et al. Real-time brain monitoring by near-infrared spectroscopy predicts neurological outcome after cardiac arrest and resuscitation in rats: A proof of concept study of a novel prognostic measure after cardiac arrest. Journal Clinical Medicine. 11 (1), 131(2021).
  14. Zhang, C., et al. Invasion of peripheral immune cells into brain parenchyma after cardiac arrest and resuscitation. Aging and Disease. 9 (3), 412-425 (2018).
  15. Duan, W., et al. Cervical vagus nerve stimulation improves neurologic outcome after cardiac arrest in mice by attenuating oxidative stress and excessive autophagy. Neuromodulation. 25 (3), 414-423 (2022).
  16. Liu, H., et al. Novel modification of potassium chloride induced cardiac arrest model for aged mice. Aging and Disease. 9 (1), 31-39 (2018).
  17. Shen, Y., et al. Aging is associated with impaired activation of protein homeostasis-related pathways after cardiac arrest in mice. Journal of American Heart Association. 7 (17), e009634(2018).
  18. Wang, P., et al. Manganese porphyrin promotes post cardiac arrest recovery in mice and rats. Biology. 11 (7), 957(2022).
  19. Wang, W., et al. Development and evaluation of a novel mouse model of asphyxial cardiac arrest revealed severely impaired lymphopoiesis after resuscitation. Journal of American Heart Association. 10 (11), e019142(2021).
  20. Li, R., et al. Activation of the XBP1s/O-GlcNAcylation pathway improves functional outcome after cardiac arrest and resuscitation in young and aged mice. Shock. 56 (5), 755-761 (2021).
  21. Shen, Y., et al. Activation of the ATF6 (activating transcription factor 6) signaling pathway in neurons improves outcome after cardiac arrest in mice. Journal American Heart Association. 10 (12), e020216(2021).
  22. Jiang, M., et al. MCC950, a selective NLPR3 inflammasome inhibitor, improves neurologic function and survival after cardiac arrest and resuscitation. Journal of Neuroinflammation. 17 (1), 256(2020).
  23. Zhao, Q., et al. Cardiac arrest and resuscitation activates the hypothalamic-pituitary-adrenal axis and results in severe immunosuppression. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 41 (5), 1091-1102 (2021).

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Ristampe e permessi

Richiedi il permesso di riutilizzare il testo o le figure di questo articolo JoVE

Richiedi permesso

Tag

Modello di asfissia nel topoFlusso ematico cerebraleOssigenazione cerebraleFunzione neurologicaStruttura vascolareMonitoraggio della rianimazioneRicerca sperimentale sull arresto cardiaco

Articoli correlati