Generazione e manipolazione di organoidi intestinali di ratto

L'architettura epiteliale dell'intestino tenue umano e la composizione cellulare sono complesse e riflettono le loro funzioni fisiologiche. Il ruolo principale dell'intestino tenue è quello di assorbire i nutrienti dal cibo che passano attraverso il suo lume¹. Per massimizzare questa funzione, la superficie intestinale è organizzata in sporgenze simili a dita chiamate villi, che aumentano la superficie assorbente, e invaginazioni a forma di coppa chiamate cripte, che ospitano e isolano le cellule staminali. All'interno dell'epitelio vengono generati vari tipi di cellule assorbenti e secretorie specializzate per svolgere funzioni distinte¹. A causa di questa complessità, è stato difficile modellare tessuti come l'intestino in linee cellulari immortalizzate ad alto passaggio trasformato. Tuttavia, lo studio delle cellule staminali, in particolare delle cellule staminali adulte e dei loro meccanismi di differenziamento, ha permesso lo sviluppo di colture di organoidi intestinali 3D. L'uso di modelli di organoidi ha trasformato il campo, in parte a causa della loro ricapitolazione di alcune componenti architettoniche e dell'eterogeneità del tipo di cellula che si trova nell'intestino intatto. Gli organoidi intestinali possono essere coltivati a lungo termine in vitro grazie al mantenimento della popolazione attiva di cellule staminali².

Gli organoidi intestinali sono diventati rapidamente un modello adattabile per studiare la biologia delle cellule staminali, la fisiologia cellulare, le malattie genetiche e la nutrizione^3,4, nonché uno strumento per sviluppare nuovi metodi di somministrazione di farmaci⁵. Inoltre, gli organoidi derivati dai pazienti vengono utilizzati per la modellazione di malattie, la scoperta di farmaci e lo screening di trattamenti personalizzati, tra gli altri 6,7,8,9. Tuttavia, gli organoidi intestinali umani presentano ancora delle sfide. La disponibilità dei tessuti, i requisiti per l'approvazione dell'Institutional Review Board e le questioni etiche limitano l'uso diffuso di campioni umani. Inoltre, gli organoidi intestinali umani generati da cripte intestinali richiedono due distinte condizioni di coltura per il mantenimento di cellule staminali indifferenziate o per indurre la differenziazione di tipi di cellule mature¹⁰. Ciò contrasta con quello in vivo, in cui le cellule staminali e i tipi di cellule differenziate mature sono contemporaneamente presenti e generati/mantenuti continuamente¹. D'altra parte, gli organoidi intestinali di topo, che sono cresciuti in un cocktail meno complesso di fattori di crescita, non richiedono questo cambiamento nella composizione del terreno e possono mantenere le cellule staminali e le cellule differenziate nello stesso contesto del terreno ^2,11. Tuttavia, le differenze chiave nell'intestino di topo rispetto agli esseri umani possono rendere gli organoidi di topo un modello non ottimale in molti casi. Nel complesso, molti organoidi intestinali di mammiferi più grandi, tra cui cavalli, maiali, pecore, mucche, cani e gatti, sono stati generati con successo in condizioni di coltura più strettamente allineate con gli organoidi intestinali di topo rispetto alle condizioni di coltura degli organoidi intestinali umani¹². Le differenze nelle condizioni del fattore di crescita tra gli organoidi di topo e umani probabilmente riflettono differenze nella composizione della nicchia delle cellule staminali e diversi requisiti per la sopravvivenza, la proliferazione e il mantenimento delle cellule staminali. Pertanto, c'è bisogno di un sistema di organoidi modello facilmente accessibile che 1) assomigli molto alla composizione delle cellule intestinali umane, 2) contenga cellule staminali con requisiti di fattore di crescita come quelli degli organoidi intestinali umani e 3) sia in grado di mantenere continuamente compartimenti indifferenziati e differenziati. Idealmente, il sistema dovrebbe provenire da un modello animale preclinico comunemente usato, in modo tale che gli esperimenti in vivo e in vitro possano essere correlati e utilizzati in tandem.

I ratti sono un modello preclinico comunemente usato per gli studi di fisiologia e farmacologia intestinale a causa della loro fisiologia e biochimica intestinale molto simili a quelle dell'uomo¹³, in particolare per quanto riguarda la permeabilità intestinale¹⁴. Le loro dimensioni relativamente maggiori rispetto ai topi li rendono più suscettibili alle procedure chirurgiche. Mentre a volte vengono utilizzati modelli animali di grandi dimensioni, compresi i maiali, i ratti sono un modello più economico, richiedono meno spazio per l'allevamento e hanno ceppi standard prontamente disponibili in commercio¹⁵. Uno svantaggio dell'utilizzo di modelli di ratto è che il kit di strumenti genetici per gli studi in vivo non è ben sviluppato rispetto ai topi e la generazione di nuove linee di ratti, tra cui knockout, knock-in e transgenici, è spesso proibitiva dal punto di vista dei costi. Lo sviluppo e l'ottimizzazione di un robusto modello di organoide intestinale di ratto consentirebbe la manipolazione genetica, i trattamenti farmacologici e gli studi a più alto rendimento in un modello accessibile che mantiene una rilevanza fisiologica chiave per gli esseri umani. Tuttavia, i vantaggi di un modello di organoide di roditore rispetto a un altro dipendono fortemente dal particolare processo o gene studiato; Alcuni geni trovati nell'uomo possono essere pseudogeni nei topi, ma non nei ratti^16,17. Inoltre, i sottotipi di cellule specie-specifiche vengono sempre più svelati dall'RNAseq^18,19,20 a singola cellula. Infine, i modelli di malattie intestinali di ratto e topo mostrano spesso variazioni considerevoli nei fenotipi^21,22 in modo tale che il modello che ricapitola più fedelmente i sintomi e il processo patologico osservato nell'uomo deve essere selezionato per il lavoro a valle. La generazione di un modello di organoide intestinale di ratto offre ulteriore flessibilità e scelta ai ricercatori nella selezione di un sistema modello più appropriato per le loro circostanze. Qui, i protocolli esistenti^23,24 sono ampliati per la generazione di organoidi intestinali di ratto e viene delineato un protocollo per la generazione e il mantenimento di organoidi intestinali di ratto dal duodeno o digiuno. Inoltre, vengono descritte diverse applicazioni a valle, tra cui l'infezione lentivirale, la colorazione a monte intero e i saggi di rigonfiamento della forskolina.

NOTA: Tutte le colture cellulari devono essere maneggiate utilizzando una tecnica asettica appropriata in una cappa per colture tissutali. Tutto il lavoro sugli animali in questo studio è stato approvato dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) di Yale.

1. Preparazione dei reagenti per colture cellulari

1. Preparare il terreno condizionato R-spondina 1 seguendo le istruzioni del produttore. Preparare il terreno condizionato Wnt3a seguendo le istruzioni del produttore. Preparare AdDMEM+ come descritto nella Tabella 1.
2. Risospendere la gastrina in dH₂O sterile per preparare un brodo da 100 μM. Aliquotare e conservare a -80 °C. Risospendere la N-acetilcisteina in acqua sterile per preparare una scorta da 100 mM. Aliquotare e conservare a -20 °C per un massimo di 1 mese.
3. Risospendere la Noggin umana ricombinante in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) + albumina sierica bovina (BSA) allo 0,1% per preparare uno stock di 250 μg/mL. Aliquotare e conservare a -80 °C. Risospendere il fattore di crescita epidermico (EGF) di topo ricombinante in PBS + 0,1% BSA per preparare uno stock di 100 μg/mL. Aliquotare e conservare a -80 °C.
4. Diluire IGF-1 umano ricombinante in PBS + 0,1% di BSA per preparare uno stock da 100 μg/mL. Aliquotare e conservare a -80 °C. Risospendere l'FGF-2 umano ricombinante in 5 mM Tris, pH 7,6, per preparare uno stock di 100 μg/mL. Aliquotare e conservare a -80 °C.
   NOTA: Per tutti i fattori di crescita, utilizzare una diluizione intermedia in PBS + 0,1% BSA fino a 100 volte la concentrazione finale nel terreno di coltura. Conservare a -20 °C.

2. Costituzione di organoidi dell'intestino tenue di ratto

NOTA: Questo protocollo è stato modificato da due protocolli precedentemente pubblicati per gli organoidi intestinali di ratto^23,24.

1. Preparare i terreni organoidi intestinali di ratto (rIOM) come da Tabella 2 e impostare un bagnomaria a 37 °C. Questo terreno completo è stabile per 5 giorni a 4 °C.
2. Preparare 10 mL di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) 3 mM in PBS in una provetta conica da 15 mL e conservare in ghiaccio. Scongelare 250 μL di estratto di matrice extracellulare (EME) su ghiaccio.
3. Digiunare un ratto durante la notte con accesso all'acqua ad libitum. Sopprimere il ratto secondo il protocollo approvato dalla IACUC. In questo protocollo, ratti maschi adulti di Sprague Dawley (del peso di ~ 200 g) sono stati soppressi tramite inalazione di CO₂ (Tabella dei materiali). La lussazione cervicale è stata utilizzata come metodo secondario di eutanasia.
4. Utilizzare pinze sterili sterilizzate in autoclave e forbici per la dissezione per la dissezione. Posizionare il ratto eutanasiato sulla superficie di dissezione, con il lato ventrale rivolto verso l'alto. Pizzica lo strato di pelle con una pinza; I seguenti tagli dovrebbero essere eseguiti a livello superficiale, in modo da tagliare solo questo strato cutaneo e non abbastanza in profondità da danneggiare gli organi interni.
5. Per aprire la cavità addominale, usando forbici da dissezione grandi e affilate, tagliare lo strato di pelle in un ampio taglio longitudinale a livello superficiale al centro dell'addome. Successivamente, partendo da quel taglio, fai due tagli orizzontali più corti, uno su ciascun lato. Usa le pinze per staccare la pelle per esporre la cavità addominale. Tagliare la membrana peritoneale per esporre completamente gli organi interni nella cavità addominale con un facile accesso all'intestino.
6. Usando forbici e pinze, individua lo stomaco e identifica il duodeno a circa 2-3 cm distale da esso, che appare come un segmento giallastro. Il digiuno prossimale si trova a circa 4-5 cm distali dal legamento di Treitz, che funge da punto di riferimento tra il duodeno e il digiuno.
7. Mettere il frammento intestinale isolato in una capsula di Petri di 10 cm. Pulire il più possibile il segmento intestinale desiderato del mesentere. Sciacquare con 10 ml di PBS ghiacciato fino a quando non viene eliminato il contenuto luminale. Su un tovagliolo di carta, tagliare il segmento intestinale in pezzi lunghi ~2 cm. Aprire longitudinalmente ogni pezzo intestinale per esporre l'epitelio.
8. Usando un vetrino da microscopio, raschiare la superficie luminale esposta per rimuovere i villi. Mettere i pezzi intestinali nella soluzione di EDTA preparata su ghiaccio. Ruotare a 4 °C per 30 min su un revolver a tubo impostato a 10 giri/min.
9. Al microscopio da dissezione, versare il contenuto della provetta conica in una capsula di Petri da 10 cm. Aggiungere altri ~5 ml di PBS ghiacciato.
10. Usando una pinza fine, tenere un segmento intestinale e agitare vigorosamente. Sarà possibile vedere il rilascio dell'epitelio nel PBS. All'inizio, il PBS conterrà principalmente villi.
11. Continuare a agitare. Eliminare periodicamente il PBS contenente i villi e aggiungere 10 ml di PBS fresco ghiacciato ai frammenti intestinali. Continuate a scuotere i frammenti e ripetete questa fase di lavaggio fino a quando i villi non vengono più rilasciati nel PBS, ma il PBS contiene principalmente cripte. Non superare i 15 minuti per l'isolamento della cripta, in modo che la vitalità cellulare non sia compromessa.
12. Scartare i frammenti intestinali rimanenti. Arricchire il PBS rimanente nella capsula di Petri per le cripte intestinali. In una cappa per coltura tissutale, raccogliere le cripte contenenti PBS e filtrarle attraverso un colino cellulare da 70 μm (Tabella dei materiali).
13. Centrifugare a 250 x g per 5 min. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet in 5 mL di AdDMEM+. Centrifugare nuovamente a 250 x g per 5 min.
    NOTA: Si consiglia di utilizzare una centrifuga con rotore a benna oscillante.
14. Rimuovere il surnatante, lasciando ~50 μL di terreno con il pellet. Risospendere il pellet nel mezzo rimanente e aggiungerlo all'aliquota dell'EME sul ghiaccio. Pipettare delicatamente su e giù per sospendere le cripte in modo uniforme in tutta l'EME. Evitare di introdurre bolle.
15. Mettere a piastre 50 μL di cupole EME in una piastra di coltura tissutale da 35 mm e incubare per 20 minuti in un'incubatrice per colture tissutali a 37 °C, 5% CO₂ .
16. Aggiungere 2 mL di rIOM (Tabella 2) contenente 10 μM Y27632 e 10 μM CHIR99021 (Tabella 3). Dopo il passaggio, Y27632 e CHIR99021 possono essere interrotti.
17. Cambiare il rIOM ogni 2-3 giorni. Passaggio secondo necessità, di solito tra 3-7 giorni, a seconda del numero iniziale di organoidi, delle dimensioni e del tasso di crescita.

3. Organoidi intestinali di ratto che passano

1. Scongelare un'aliquota di 250 μL di EME su ghiaccio e preriscaldare la rIOM a 37 °C.
2. Aspirare il terreno da una piastra di 35 mm contenente organoidi e aggiungere 1 mL di reagente di dissociazione per rilasciare immediatamente gli organoidi dalle cupole EME.
3. Trasferire immediatamente il reagente di dissociazione con organoidi frammentati in una provetta conica da 15 mL. Lavare la piastra di coltura con 2 mL di AdDMEM+ e aggiungerla alla provetta conica da 15 mL contenente organoidi frammentati.
4. Con una pipetta Pasteur in vetro, pipettare delicatamente verso l'alto e verso il basso 15-20 volte per frammentare gli organoidi. Centrifugare a 350 x g per 2 min.
5. Aggiungere ~50 μL di soluzione dal fondo della provetta conica nell'EME. Pipettare delicatamente su e giù per mescolare. Evita di fare bolle.
6. Mettere in piastra 50 μL di cupole EME in una capsula da 35 mm e incubare per 20 minuti in un incubatore per colture tissutali a 37 °C, 5% CO₂ .
7. Aggiungere 2 mL di rIOM con 10 μM Y27632 e 10 μM CHIR99021. Cambiare il substrato di crescita ogni 2-3 giorni. Quando si cambia supporto, Y27632 e CHIR99021 possono essere omessi.

4. Crioconservazione e scongelamento di organoidi intestinali di ratto

1. Crioconservazione di organoidi intestinali di ratto
   NOTA: Il protocollo di crioconservazione è stato modificato da un protocollo precedente per organoidi umani e murini²⁵. Prima del congelamento, gli organoidi devono avere almeno due passaggi nella coltura primaria. Si consiglia di coltivare organoidi fino al punto di grandi sferoidi o organoidi leggermente germogliati prima della crioconservazione, in quanto ciò si tradurrà in una maggiore resa di organoidi vitali dopo lo scongelamento. Ciò può essere ottenuto aumentando il terreno condizionato con R-spondina al 15% e/o aggiungendo 10 mM di nicotinamide (Tabella 3) alla coltura di organoidi.
   1. Usando un microscopio, contare il numero di organoidi sulla capsula da 35 mm. Etichettare i crioviali in modo tale che 200 organoidi vengano aliquotati in ogni crioviale.
   2. Rimuovere il rIOM dalla parabola da 35 mm. Sostituire con 2 mL di PBS per coltura tissutale fredda.
   3. Utilizzando un puntale P1000, rilasciare le cupole EME dal fondo della piastra di coltura nel PBS pipettando su e giù. Continuare a pipettare su e giù ~20 volte per rompere l'EME e rilasciare gli organoidi. Raccogliere gli organoidi e il PBS in una provetta conica da 15 ml.
   4. Aggiungere 2 ml di PBS freddo al piatto di coltura e pipettare verso l'alto e verso il basso per rilasciare eventuali organoidi rimanenti nel PBS. Trasferire il PBS nella provetta conica da 15 ml.
   5. Pellet gli organoidi centrifugando a 290 x g per 5 min. Rimuovere ed eliminare il surnatante senza interrompere il pellet di organoidi.
   6. Lavare il pellet risospendendo delicatamente in 5 mL di AdDMEM+ freddo. Centrifugare a 200 x g per 4 min. Rimuovere con cautela ed eliminare il surnatante.
   7. Risospendere il pellet di organoidi in 1 mL di terreno di congelamento a freddo per 200 organoidi. Aliquote di 1 mL di organoidi in mezzo di congelamento per crioviale marcato. Mettere i crioviali in un contenitore per congelare.
   8. Conservare gli organoidi in un contenitore di congelamento a -80 °C per 24 ore, quindi trasferire i crioviali in azoto liquido per la conservazione a lungo termine.
2. Scongelamento degli organoidi intestinali di ratto
   NOTA: Questo protocollo è stato modificato da un precedente protocollo per lo scongelamento di organoidi intestinali umani e di topo²⁶.
   1. Scongelare un'aliquota di 250 μL di EME su ghiaccio. Preparare rIOM integrato con terreni condizionati con R-spondina al 15%, 10 μM Y27632 e 10 μM CHIR99021. Temperatura termica a 37 °C.
   2. Aggiungere 2 mL di mezzo di scongelamento (Tabella 3) in una provetta conica da 15 mL a temperatura ambiente.
   3. Recuperare e scongelare un flaconcino di organoidi dall'azoto liquido ponendo il flaconcino in un bagnomaria a 37 °C fino a quando il flaconcino non è quasi completamente scongelato.
   4. Aggiungere 1 mL di terreno di scongelamento al flaconcino e trasferire tutto il contenuto nella provetta conica contenente il mezzo di scongelamento. Lavare due volte il flaconcino con 1 mL di mezzo di scongelamento e trasferirlo nella provetta conica.
   5. Centrifugare a 200 x g per 5 min. Aspirare il terreno, lasciando ~50 μL di terreno con gli organoidi. Trasferire i terreni contenenti organoidi a 250 μL di EME.
   6. Distribuire uniformemente gli organoidi attraverso l'EME pipettando su e giù, evitando la formazione di bolle. Pipettare sei cupole da 50 μL in una piastra di coltura tissutale da 35 mm.
   7. Incubare nell'incubatore per colture tissutali per 15-20 minuti per consentire all'EME di polimerizzare. Aggiungere 2 mL di rIOM preparato al piatto.
   8. Dopo 2 giorni, sostituire il supporto con rIOM. L'uso di Y27632 e CHIR99021 può essere sospeso. La crescita degli organoidi può essere lenta nel primo passaggio dopo lo scongelamento. Si consiglia di far passare gli organoidi due volte dopo lo scongelamento prima di iniziare gli esperimenti.

5. Generazione di monostrati 2D intestinali di ratto da organoidi 3D

NOTA: Il seguente protocollo descrive i volumi necessari per generare 24 pozzetti di una piastra a 48 pozzetti rivestita con EME, a partire da sei cupole da 50 μL (piatto da 35 mm) contenenti ~300 organoidi intestinali/cupola (scala: una cupola genera quattro pozzetti), ma può essere scalato verso l'alto o verso il basso secondo necessità. Come scritto, questo protocollo raggiunge ~80% di confluenza in 4-5 giorni. A una maggiore confluenza, le cellule ricominciano ad acquisire strutture organoidi 3D. A bassa confluenza (≤40%), le cellule rimangono come monostrati e sono vitali per ~14 giorni. Se lo scopo dello studio è quello di utilizzare monostrati 2D, ridurre le dimensioni in modo che una cupola generi otto pozzetti di una piastra a 24 pozzetti. I pozzetti possono anche essere rivestiti con collagene I per formare monostrati.

1. Preparazione delle superfici rivestite
   1. Per rivestire la piastra con EME, diluire EME 1:20 in AdDMEM+ freddo (Tabella 1). Per il rivestimento con collagene, preparare il collagene I secondo le istruzioni del produttore. Diluire 5 mg/mL di collagene I in AdDMEM+ a 100 μg/mL (1:50 in questo caso).
   2. Rivestire la piastra con 200 μL di EME diluito o collagene per coprire interamente la superficie del pozzetto. Incubare per 1-2 ore a 37 °C in un incubatore per colture tissutali. Preparare il terreno organoide intestinale di ratto per la coltura monostrato 2D (rIOM2D) come da Tabella 4.
2. Generazione di monostrati
   1. Aspirare il terreno da una piastra da 35 mm contenente organoidi. Aggiungere 1 mL di PBS.
   2. Interrompere l'EME nei pozzetti grattando con una punta P1000. Pipettare su e giù circa 20 volte per allentare tutto l'EME. Trasferite il tutto in una provetta conica da 15 ml.
   3. Aggiungere 1 mL di PBS alla piastra da 35 mm per recuperare eventuali organoidi aggiuntivi e trasferirlo nella stessa provetta conica da 15 mL.
   4. Centrifugare a 350 x g per 2 minuti e aspirare il surnatante, compreso il residuo EME. Aggiungere 1 mL di soluzione di tripsina al pellet di organoide e incubare a 37 °C per 2 minuti.
   5. Pipettare su e giù 10 volte utilizzando un puntale P1000 e aggiungere 2 mL di AdDMEM+ per neutralizzare la tripsina.
   6. Centrifugare a 350 x g per 5 min. Aspirare il surnatante e aggiungere 4,8 mL di rIOM2D (Tabella 4). Risospendere il pellet cellulare.
   7. Prima di posizionare gli organoidi, eliminare l'EME o il collagene in eccesso in AdDMEM+ dai pozzetti. Quindi, aggiungere 200 μL di organoidi in rIOM2D e 10 μM Y27632 a ciascun pozzetto prerivestito.
   8. Dopo 4-16 ore, raccogliere il terreno e centrifugare a 1.000 x g per 1 min. Trasferire il surnatante in una nuova provetta conica da 15 mL ed eliminare il pellet.
   9. Lavare ogni pozzetto con 300 μL di PBS e aggiungere 200 μL di rIOM2D centrifugato a ciascun pozzetto. Cambiare il rIOM2D ogni 2-3 giorni, sospendendo l'uso di Y27632.
3. Riforma di organoidi 3D da monostrati 2D
   NOTA: I monostrati cresciuti su EME possono essere indotti a riformare gli organoidi 3D, mentre i monostrati cresciuti su collagene I non ritornano in modo efficiente agli organoidi 3D. Di solito, 2-3 pozzetti di organoidi generati da monostrati possono essere utilizzati per creare una cupola di 50 μL di EME al giorno 5.
   1. Diluire l'EME 1:4 in rIOM2D. Quando i monostrati raggiungono ~80% di confluenza, aspirare con cautela il terreno e aggiungere 100 μL di EME diluito ai pozzetti contenenti i monostrati.
   2. Incubare a 37 °C, 5% di CO₂ in un incubatore per colture tissutali per 20 minuti. Successivamente, aggiungere 100 μL di rIOM2D e rimettere nell'incubatore per colture tissutali. Gli organoidi 3D verranno generati entro 5 giorni dall'aggiunta di EME diluito.
   3. Dopo che i piccoli organoidi si sono riformati (~giorno 5), preparare rIOM. Raccogliere tutto il contenuto del pozzetto, pipettando su e giù per interrompere l'EME, e trasferirlo in una provetta conica da 15 mL.
   4. Centrifugare a 350 x g per 2 min. Aspirare il surnatante e il residuo EME.
   5. Aggiungere 1 mL di AdDMEM+ freddo e centrifugare a 350 x g per 2 min. Rimuovere il surnatante, lasciando ~50 μL di terreno.
   6. Trasferire i 50 μL di terreni e organoidi in un'aliquota EME da 250 μL. Pipettare su e giù per distribuire gli organoidi in tutta l'EME.
   7. Pipettare 50 μL di cupole EME in una capsula da 35 mm e incubare per 20 minuti in un incubatore per colture tissutali.
   8. Aggiungere 2 mL di rIOM più 10 μM Y27632. Cambiare il substrato di crescita ogni 2-3 giorni. Quando si cambia il supporto, Y27632 può essere omesso.

6. Manipolazione genetica

1. Trasfezione transitoria di monostrati 2D
   ATTENZIONE: Preparare i monostrati epiteliali intestinali di ratto seguendo il paragrafo 5.1 in una piastra da 48 pozzetti. La trasfezione deve essere eseguita al 70%-80% di confluenza. Sostituire sempre il terreno nei pozzetti con 200 μL di rIOM2D fresco prima della trasfezione. Calcolare i rapporti di assorbanza 260/280 nm e 260/230 nm del DNA plasmidico; Questi devono essere superiori a 1,8 per garantire buoni risultati di trasfezione.
   NOTA: Utilizzare un controllo plasmidico per calcolare l'efficienza della trasfezione. Un plasmide che codifica per una proteina fluorescente è raccomandato per facilitare. In questo protocollo è stato utilizzato pLJM1-EGFP²⁷ .
   1. Preparare 1 mg/mL di polietilenimmina (PEI) 20 kDa; Tabella 3). Per ogni pozzetto, preparare la provetta A (0,6 μg di plasmide + 50 μL di terreno sierico ridotto) e la provetta B (1,8 μL di PEI + 50 μL di terreno sierico ridotto). Mantenere un rapporto DNA:PEI di 1:3.
   2. Vorticare entrambi i tubi per 30 s. Unire il tubo A e il tubo B e vorticare di nuovo per 30 s. Se necessario, utilizzare una centrifuga per centrifugare. Incubare per 20 minuti a temperatura ambiente.
   3. Aggiungere delicatamente il complesso DNA/PEI goccia a goccia al monostrato 2D. Agitare delicatamente il piatto per mescolare. Incubare a 37 °C, 5% CO₂. L'espressione di solito può essere rilevata dopo 24 ore.
      NOTA: Se è necessario tornare alle strutture organoidi 3D, attendere 48 ore dopo la trasfezione per l'aggiunta di EME diluito.
2. Trasduzione lentivirale di organoidi intestinali di ratto
   NOTA: Prima di lavorare con i lentivirus, ottenere un'autorizzazione adeguata e una formazione specializzata dall'istituto. Indossare sempre dispositivi di protezione individuale (DPI) appropriati quando si maneggiano i lentivirus. Anche se non descritto qui, il lentivirus concentrato di alta qualità è essenziale per il successo dell'infezione degli organoidi. Questo protocollo utilizzava un vettore pLJM1-EGFP vuoto²⁷ per esprimere la GFP solubile. Questo protocollo è stato modificato da un protocollo pubblicato in precedenza²⁸. L'efficienza di trasduzione dipende dalla qualità e dalla concentrazione delle particelle virali, dall'efficiente dissociazione degli organoidi in piccoli gruppi cellulari e dal gene espresso. Quando è stata calcolata 5 giorni dopo l'infezione, l'efficienza media di trasduzione prima della selezione era del 19,4% (± deviazione standard del 6,5%).
   1. A 2 giorni prima dell'infezione lentivirale, pianificare il passaggio (sezione 3) di due pozzetti densi di una piastra da 24 pozzetti per ciascun lentivirus che verrà trasdotto. Ogni pozzetto di una piastra a 24 pozzetti può ospitare una cupola da 50 μL di EME.
   2. Una volta che l'EME si è solidificato, aggiungere 0,5 mL di rIOM integrato con 10 mM di nicotinamide, 10 μM Y27632 e 2,5 μM CHIR99021. Ciò induce grandi morfologie sferoidi, il che è favorevole per l'efficienza della trasduzione lentivirale. Entro 2 giorni dalla placcatura, gli organoidi di ratto dovrebbero essere grandi sferoidi. Se si osserva una differenziazione significativa (cioè la gemmazione), ripassare gli organoidi.
   3. Scongelare il virus concentrato sul ghiaccio. Preparare nuovi mezzi di trasduzione, come da Tabella 3.
   4. Utilizzando un puntale P1000, rilasciare le cupole EME dal fondo della piastra di coltura cellulare nel terreno pipettando verso l'alto e verso il basso. Continuare a pipettare su e giù 20 volte per rompere l'EME e rilasciare gli organoidi.
   5. Pipettare gli organoidi e i terreni in una provetta conica da 15 ml. Tutti i pozzetti possono essere raggruppati insieme, a condizione che gli organoidi abbiano lo stesso genotipo e provengano dalla stessa linea.
   6. Lavare ogni pozzetto due volte con 1 ml di AdDMEM+ freddo. Raccogliere l'AdDMEM+ e trasferirlo nella stessa provetta conica da 15 mL.
   7. Usando una pipetta di vetro Pasteur, disgregare meccanicamente gli organoidi di ratto. Si tratta di un passaggio critico, poiché l'obiettivo sono piccoli gruppi multicellulari di cellule. Pipettare su e giù ~30 volte. Verificare l'efficienza dell'interruzione al microscopio utilizzando un obiettivo 4x. Continuare questo processo fino a quando la sospensione cellulare è composta principalmente da gruppi di cellule con pochi organoidi rimasti.
      NOTA: In alternativa, gli organoidi possono essere centrifugati a 200 x g per 5 minuti a temperatura ambiente, rimosso con cura il surnatante e risospesi in 1 mL di enzima ricombinante che sostituisce la tripsina/EDTA convenzionale, preriscaldato a 37 °C nell'incubatore per colture tissutali. Incubare gli organoidi in sostituzione della tripsina per 2 minuti a bagnomaria a 37 °C, con vortici regolari per favorire la dissociazione. Evitare l'incubazione prolungata con la sostituzione della tripsina, in quanto ciò può favorire la morte cellulare. Controllare regolarmente l'efficienza dell'interruzione al microscopio utilizzando un obiettivo 4x. Quando la sospensione è composta principalmente da cellule singole con poche colture cellulari, diluire la tripsina sostitutiva aggiungendo 4 mL di AdDMEM+ e procedere con il passaggio successivo.
   8. Ruotare la provetta conica da 15 mL contenente i cluster di cellule a 200 x g per 5 minuti a 4 °C. Rimuovere con cautela ed eliminare il surnatante, facendo attenzione a non disturbare il pellet cellulare.
   9. Risospendere i cluster di cellule in 230 μL di terreno di trasduzione per pozzetto da infettare. Per l'infezione, utilizzare un pozzetto di una piastra da 48 pozzetti per ciascun lentivirus.
   10. Piastra 230 μL di sospensione cellulare in ciascun pozzetto di una piastra a 48 pozzetti marcata. Aggiungere 20 μL di virus concentrato in ciascun pozzetto. Utilizzare un puntale P1000 per mescolare la soluzione virus/cellulare in ciascun pozzetto e sigillare la piastra con una pellicola trasparente.
   11. Eseguire la spinoculazione: centrifugare la piastra a 600 x g per 1 ora a 32 °C. Aprire la piastra e incubare a 37 °C, 5% CO₂ per 6 ore.
   12. Preriscaldare una piastra da 24 pozzetti nell'incubatore a 37 °C.
   13. Dopo l'incubazione, pipettare ogni pozzetto su e giù e trasferire il contenuto in una provetta da 1,5 mL etichettata. Lavare ogni pozzetto con 750 μL di AdDMEM+ e trasferirlo nella provetta. Centrifugare i tubi a 600 x g per 5 minuti a 4 °C.
   14. Rimuovere le provette dalla centrifuga e conservarle su ghiaccio. Utilizzare una punta P1000 per rimuovere con cura e smaltire correttamente il surnatante.
   15. Risospendere il pellet cellulare in EME e piastre cupole da 50 μL nella piastra preriscaldata a 24 pozzetti. Incubare per 15-20 minuti a 37 °C fino a polimerizzazione dell'EME.
   16. A ciascun pozzetto, aggiungere 500 μL di rIOM integrato con 10 mM di nicotinamide, 10 μM Y27632 e 2,5 μM CHIR99021.
   17. Sostituire il terreno con rIOM plus 10 μM Y27632 1 giorno dopo l'infezione. Cambiare il supporto ogni 2-3 giorni. Se verrà eseguita la selezione, aggiungere la selezione 48-72 ore dopo l'infezione. Per la selezione della puromicina, utilizzare 2 μg/mL di puromicina.

7. Colorazione a montaggio intero in immunofluorescenza di organoidi

1. Aspirare il terreno e aggiungere il 4% di paraformaldeide (PFA) in PBS-Tween 20 (PBS-T) (Tabella 3) agli organoidi in una piastra di coltura cellulare. Incubare a temperatura ambiente per 10 min.
2. Rilasciare gli organoidi dall'EME pipettando su e giù. Raccogliere gli organoidi in una provetta da 0,75 ml. Gli organoidi si depositeranno sul fondo del tubo per gravità entro pochi minuti. Se necessario, centrifugare a 100 x g per 1 min.
3. Utilizzando una pipetta di trasferimento, rimuovere il PFA e risospendere gli organoidi in PBS-T. Lascia che gli organoidi si depositino sul fondo del tubo. Rimuovere il PBS-T e risospendere in 200 μL di soluzione a blocchi (Tabella 3).
4. Incubare a temperatura ambiente su bilanciere o nutator per 45 min. Gli organoidi possono aggregarsi e depositarsi sul fondo del tubo. Muovere periodicamente con le dita il tubo per risospendere e disperdere la soluzione.
5. Lascia che gli organoidi si depositino sul fondo del tubo. Se necessario, centrifugare a 100 x g per 1 min. Rimuovere la soluzione a blocchi.
6. Aggiungere l'anticorpo primario diluito in 100 μL di soluzione in blocco. Incubare a temperatura ambiente su un miscelatore nutating per 45 min a 24 giri/min. Le concentrazioni di anticorpi variano a seconda dell'anticorpo utilizzato.
   NOTA: Questa fase può essere estesa in base all'anticorpo primario, fino a una notte a 4 °C.
7. Lascia che gli organoidi si depositino sul fondo del tubo. Se necessario, centrifugare a 100 x g per 1 min.
8. Lavare in PBS-T cinque volte utilizzando una pipetta di trasferimento. Incubare a temperatura ambiente per 5 min su mixer nutating a 24 rpm. Ripeti questo passaggio due volte.
9. Aggiungere l'anticorpo secondario diluito 1:200 e 50 μg/mL 4′,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) diluito in 100 μL di soluzione in blocchi. Incubare a temperatura ambiente su un miscelatore nutatore per 30 minuti a 24 giri/min.
10. Lascia che gli organoidi si depositino sul fondo del tubo. Se necessario, centrifugare a 100 x g per 1 min. Rimuovere l'anticorpo secondario. Lavare cinque volte in PBS-T utilizzando una pipetta di trasferimento.
11. Incubare a temperatura ambiente per 5 minuti su un mixer nutatore a 24 giri/min. Ripetere due volte la fase di lavaggio.
12. Durante il lavaggio degli organoidi, riscaldare un'aliquota di sigillante VALAP (Tabella 3) a 40-50 °C per liquefare. Usando un pennello, dipingi un quadrato sottile di VALAP su un vetrino da microscopio delle dimensioni di un vetrino coprioggetti. Utilizzare un vetrino coprioggetto n. 1,5 da 22 mm x 22 mm.
13. Usando le forbici, tagliare l'estremità di un puntale per pipetta P200. Trasferire gli organoidi nel pozzetto VALAP sul vetrino. Usando una salvietta fazzolettica, rimuovi con cura il PBS-T. Non lasciare che gli organoidi si asciughino.
14. Inondare il pozzetto VALAP con un mezzo di montaggio antisbiadimento (Tabella 3). Per un quadrato di ~22 mm x 22 mm, ciò richiederà 100-150 μL di antisbiadimento.
15. Gli organoidi possono raggrupparsi; Far roteare l'antifade con la punta di una pipetta per ridistribuire gli organoidi, se necessario. Montare con vetrino coprioggetti n. 1,5 da 22 mm x 22 mm, evitando bolle d'aria. Sigillare il vetrino coprioggetto dipingendo un sottile strato di VALAP sui bordi.
    NOTA: Per i microscopi invertiti, gli organoidi possono anche essere montati in un piatto con fondo di vetro da 35 mm.

8. Gonfiore indotto dalla forskolina degli organoidi intestinali di ratto

1. Far crescere gli organoidi per 3-5 giorni dopo il passaggio in rIOM. Si consiglia di coltivare organoidi in una piastra a 24 pozzetti per garantire che la stessa regione possa essere facilmente rielaborata. Acquisire immagini prima dell'aggiunta di forskolina (T0).
2. Aggiungere la forskolina (Tabella 3) direttamente al terreno organoide fino a una concentrazione finale di 10 μM. Aggiungere lo stesso volume di dimetilsolfossido (DMSO) ai pozzetti di controllo.
3. Visualizzare l'immagine dei pozzetti di controllo e trattati con forskolina a intervalli regolari, ogni 15-30 minuti. Quando non si esegue l'imaging, tenere gli organoidi nell'incubatrice o utilizzare un sistema di imaging controllato con incubazione. Il gonfiore massimo deve essere osservato entro 120 minuti.
4. Seguire i protocolli standard per calcolare il gonfiore relativo dalle immagini acquisite²⁹.

Gli organoidi duodenali e digiunali di ratto sono stati generati utilizzando il protocollo descritto nella sezione 2. È molto importante durante le fasi di isolamento della cripta che i villi siano esauriti in modo efficiente dal PBS. Se troppi villi sono placcati nell'EME con cripte, può causare la morte dell'intera coltura e l'incapacità di stabilire una linea di organoidi. Per questo motivo, è utile isolare le cripte sotto un cannocchiale di dissezione, consentendo la conferma visiva dell'esaurimento del villar. La figura 1 illustra frammenti e cripte rappresentativi di villar (figura 1A). Si noti la dimensione significativamente più piccola delle cripte rispetto ai villi (Figura 1B). Dopo la placcatura, le cripte si espanderanno in sferoidi nei giorni successivi e inizieranno a germogliare e differenziarsi entro il 4-7° giorno (Figura 2). Una volta che gli organoidi raggiungono uno stadio estensivamente germogliato, dovrebbero essere passati. Durante il passaggio, è importante distruggere gli organoidi abbastanza da dividere le gemme della cripta, in modo che il numero di organoidi possa essere espanso (Figura 3B).

Il successo del recupero degli organoidi dopo il congelamento dipende in larga misura dallo stato in cui vengono congelati. Gli organoidi in uno stato indifferenziato altamente proliferativo si riprendono con la massima efficienza. Pertanto, si consiglia di indurli ad essere sferici e cistici invece che gemmati e differenziati. Per raggiungere questo obiettivo, Wnt può essere iperattivato aumentando la quantità del ligando Wnt R-spondina nel terreno e includendo nicotinamide nel terreno, che ha dimostrato di supportare la formazione di organoidi e la sopravvivenza cellulare in diversi sistemi di coltura30,31. La Figura 3A mostra una coltura di organoidi sana appena 2 giorni dopo lo scongelamento. L'inclusione della BSA nei terreni durante lo scongelamento ha anche contribuito alla sopravvivenza delle colture di organoidi intestinali di ratto, che si sono dimostrate più delicate degli organoidi intestinali di topo.

Mentre la coltura di organoidi 3D è spesso preferita perché ricapitola parte della normale architettura intestinale, rende altri approcci, tra cui l'imaging dal vivo, le trasfezioni e le trasduzioni lentivirali, più impegnativi dal punto di vista tecnico. L'uso di monostrati 2D generati da organoidi 3D32 (Figura 4) consente una maggiore efficienza nell'introduzione dei plasmidi. Mentre gli organoidi intestinali 3D sono tradizionalmente resistenti alle trasfezioni transitorie, i plasmidi che codificano per EGFP possono essere introdotti con successo utilizzando metodi di trasfezione a base lipidica. L'approccio più efficace in termini di costi che utilizza il PEI è descritto nella fase 6.1 (Figura 5), ma anche l'elettroporazione e i reagenti di trasfezione disponibili in commercio hanno prodotto risultati comparabili (dati non mostrati). Gli studi futuri si concentreranno sulla possibilità di utilizzare questi approcci per introdurre costrutti CRISPR nei monostrati.

Era importante essere in grado di riformare gli organoidi 3D da monostrati 2D dopo la trasfezione in modo che potessero essere mantenuti come una linea di passaggio con componenti architettonici 3D delle cripte. È interessante notare che i monostrati 2D placcati sull'EME si sono prontamente riformati in piccoli sferoidi quando l'EME è stato aggiunto di nuovo alla parte superiore delle cellule, mentre un substrato di collagene I non era sufficiente per la riformazione delle strutture 3D (Figura 6).

Mentre le trasfezioni transitorie sono utili per molti studi, la formazione di linee stabili è spesso più utile, richiedendo l'introduzione di lentivirus nelle cellule. Gli organoidi intestinali di ratto sono stati infettati con lentivirus modificando i protocolli precedentemente pubblicati (Figura 7). Un passaggio chiave del protocollo è la disgregazione degli organoidi in piccoli aggregati o cluster di cellule. Se le colture non vengono interrotte in modo efficiente e gli organoidi rimangono intatti, le particelle lentivirali non entreranno nelle cellule. Dopo l'infezione, gli organoidi devono riprendersi e ricrescere. Il protocollo qui delineato consente l'assorbimento delle particelle virali dal 10% al 48% (media: 19,4% ± 6,5%) delle cellule prima della selezione.

La colorazione dell'intero supporto degli organoidi può rivelarsi difficile a causa della rimozione incompleta dei residui EME o della penetranza incompleta degli anticorpi. Il protocollo qui delineato consente la colorazione robusta degli organoidi. Anche la visualizzazione degli organoidi su un microscopio confocale può rivelarsi difficile se sono troppo lontani dal vetrino coprioggetto. Utilizzando VALAP, si crea un pozzetto con una certa altezza in modo tale che gli organoidi non vengano schiacciati dal vetrino coprioggetto, ma si lasci comunque depositare vicino al vetrino coprioggetti per facilitare l'imaging. La colorazione rappresentativa contro il canale anionico apicale, il regolatore della conduttanza transmembrana della fibrosi cistica (CFTR) e la falloidina per marcare la F-actina è mostrata nella Figura 8.

Infine, gli organoidi hanno utilità nei saggi funzionali. Gli organoidi derivati da pazienti affetti da fibrosi cistica sono stati utilizzati per lo screening della funzione CFTR, poiché il trattamento con l'agonista del cAMP forskolina induce una robusta secrezione fluida mediata da CFTR, causando gonfiore degli organoidi 29,33-37. Uno degli obiettivi di questo lavoro è stato quello di identificare e sviluppare un modello di organoide che possa essere utilizzato in parallelo agli studi preclinici in vivo. Pertanto, abbiamo mirato a determinare se gli organoidi intestinali di ratto subiscono un gonfiore indotto dalla forskolina. Infatti, entro 30 minuti dal trattamento con forskolina, gli organoidi di ratto si sono gonfiati, con un effetto massimo osservato entro 120 minuti (Figura 9).

Figura 1: Frammenti e cripte di Villar durante l'isolamento epiteliale. (A) Immagine rappresentativa dei frammenti di Villar in soluzione di EDTA durante il protocollo di isolamento della cripta. Le punte di freccia gialle segnano i frammenti di villar. Le frecce rosse raffigurano cripte attaccate a un frammento di villar. Si noti la differenza nelle dimensioni relative. (B) Immagine a maggiore ingrandimento di una singola cripta (freccia rossa) in modo che la morfologia possa essere visualizzata. Barre della scala: 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Progressione degli organoidi intestinali di ratto. Le cripte di digiuno di ratto sono state placcate in EME subito dopo l'isolamento (A,B). Nel giro di 2 giorni, le cripte divennero sferoidi (C,D). Entro il giorno 5, hanno iniziato a dare inizio alle gemme della cripta (E,F), che si sono elaborate e cresciute entro il giorno 7 (G). Barre della scala: 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Organoidi dopo lo scongelamento e il passaggio. (A) Gli organoidi digiunali di ratto sono stati scongelati seguendo i protocolli delineati dopo la crioconservazione. Si noti la presenza sia di sferoidi che di organoidi gemmati appena 2 giorni dopo lo scongelamento. (B) La stessa linea di organoidi raffigurata in A subito dopo il passaggio seguendo il protocollo delineato. Si noti la differenza di dimensioni relative tra le strutture in A e B e la presenza di singoli domini simili a cripte in B. Barre della scala: 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Formazione di monostrati 2D da organoidi 3D. (A-C) Progressione monostrato 2D su EME. (D-F) Progressione monostrato 2D su collagene I. Entro il giorno 5, ogni condizione ha prodotto ~80% di confluenza. Barre della scala: 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Trasfezione transitoria di un monostrato 2D. Immagine rappresentativa di un monostrato 2D cresciuto su EME trasfettato transitoriamente con plasmide pLJM1-EGFP utilizzando PEI. (A) campo chiaro, (B) fluorescenza (GFP), (C) sovrapposizione. La linea rossa tratteggiata segna il contorno del monostrato. Barre della scala: 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6: Riformazione di organoidi 3D da monostrati 2D su EME. (A) Formazione di organoidi 3D da monostrati 2D cresciuti su EME. Organoidi formati in modo efficiente entro 5 giorni dall'aggiunta di EME alla superficie apicale del monostrato. Notate l'abbondanza di cellule morte che circondano i piccoli sferoidi 3D. (B) Persistenza dei monostrati 2D 5 giorni dopo l'aggiunta di collagene I alla superficie apicale dei monostrati 2D cresciuti su collagene I. Barre della scala: 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 7: Infezione lentivirale di organoidi 3D. Gli organoidi di digiuno di ratto sono stati infettati con particelle lentivirali GFP nucleari utilizzando il protocollo delineato. Dopo il recupero e la crescita per 5 giorni, gli organoidi sono stati fissati e controcolorati con DAPI. (A) DAPI: grigio; nucleareGFP: verde. (B) nucleareGFP: verde. La linea rossa tratteggiata segna il confine dell'organoide. Barre graduate: 50 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 8: Immunofluorescenza a montaggio intero di organoidi intestinali di ratto. (A) CFTR, (B) falloidina e (C) immunofluorescenza a montaggio intero di organoidi digiunali di ratto. Si noti l'arricchimento apicale della colorazione CFTR negli organoidi (grigio in A, magenta in C). La falloidina marca la F-actina ed etichetta in modo prominente il bordo apicale della spazzola (grigio in B, ciano in C). Barre della scala: 25 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 9: Gli organoidi intestinali di ratto si gonfiano dopo la stimolazione con forskolina. Decorso temporale rappresentativo del gonfiore degli organoidi intestinali di ratto dopo l'aggiunta dell'agonista cAMP forskolina. Il tempo 0 min rappresenta il punto di tempo immediatamente precedente l'aggiunta di 10 μM di forskolina. Le immagini mostrano lo stesso organoide a intervalli di tempo di 30 minuti. Il gonfiore massimo è stato osservato a 120 minuti dopo l'aggiunta di forskolina. La linea rossa tratteggiata delinea il confine dell'organoide. Il materiale scuro al centro del lume organoide è composto da cellule morte. Barre della scala: 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella 1: Ricetta AdDMEM+. Ingredienti per creare il supporto AdDMEM+ standard, che è il supporto di base in tutti i metodi mostrati qui. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Tabella 2: Ricetta dei terreni organoidi intestinali di ratto (rIOM). Ricetta dettagliata dei terreni organoidi intestinali standard di ratto, comprese le condizioni di solvente e conservazione per le proteine ricombinanti. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Tabella 3: Soluzioni. Ricette e istruzioni per realizzare altre soluzioni utilizzate in tutto il protocollo. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Tabella 4. Terreno organoide intestinale di ratto per coltura monostrato 2D (rIOM2D). Ricetta modificata di terreni di coltura organoidi ottimizzati per la crescita 2D di monostrati. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Nessuno.