Questo protocollo dimostra un modello unico di ictus del topo con un infarto di medie dimensioni e un eccellente tasso di sopravvivenza. Questo modello consente ai ricercatori preclinici sull'ictus di estendere la durata dell'ischemia, utilizzare topi anziani e valutare gli esiti funzionali a lungo termine.
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Articolo metodologico
Un modello modificato di occlusione dell'arteria cerebrale media transcranica per studiare gli esiti dell'ictus nei topi anziani
In questo articolo
Sommario
Abstract
Nella ricerca sperimentale sull'ictus, l'occlusione dell'arteria cerebrale media (MCAO) con un filamento intraluminale è ampiamente utilizzata per modellare l'ictus ischemico nei topi. Il modello MCAO a filamento mostra tipicamente un infarto cerebrale massiccio nei topi C57Bl/6 che a volte include tessuto cerebrale nel territorio fornito dall'arteria cerebrale posteriore, che è in gran parte dovuta a un'elevata incidenza di atresia dell'arteria comunicante posteriore. Questo fenomeno è considerato uno dei principali fattori che contribuiscono all'alto tasso di mortalità osservato nei topi C57Bl/6 durante il recupero a lungo termine dell'ictus dopo il filamento MCAO. Pertanto, molti studi sull'ictus cronico sfruttano i modelli MCAO distali. Tuttavia, questi modelli di solito producono infarto solo nell'area della corteccia e, di conseguenza, la valutazione dei deficit neurologici post-ictus potrebbe essere una sfida. Questo studio ha stabilito un modello MCAO transcranico modificato in cui l'MCA al tronco è parzialmente occluso in modo permanente o transitorio attraverso una piccola finestra cranica. Poiché la posizione dell'occlusione è relativamente prossimale all'origine dell'MCA, questo modello genera danni cerebrali sia nella corteccia che nello striato. L'ampia caratterizzazione di questo modello ha dimostrato un eccellente tasso di sopravvivenza a lungo termine, anche nei topi anziani, nonché deficit neurologici facilmente rilevabili. Pertanto, il modello murino MCAO qui descritto rappresenta uno strumento prezioso per la ricerca sperimentale sull'ictus.
Introduzione
Quasi 800.000 persone subiscono un ictus negli Stati Uniti ogni anno e la maggior parte di questi ictus sonodi natura ischemica. Il ripristino tempestivo del flusso sanguigno cerebrale con attivatore tissutale del plasminogeno (tPA) e/o trombectomia è attualmente il trattamento più efficace per i pazienti colpiti da ictus; Tuttavia, il pieno recupero delle funzioni neurologiche a lungo termine è raro 2,3. Pertanto, la ricerca di una nuova terapia per l'ictus che miri al miglioramento funzionale è un'intensa area di ricerca che richiede modelli animali clinicamente rilevanti di ictus.
Il modello di ictus ischemico più comune nei roditori utilizza l'occlusione intraluminale dell'arteria cerebrale media (MCAO) per indurre l'ictus. In questo modello, inizialmente sviluppato da Zea Longa nel 1989, un filamento di nylon viene introdotto nell'arteria carotide interna (ICA) per bloccare il flusso sanguigno all'arteria cerebrale media (MCA)4. Tuttavia, questo modello presenta delle limitazioni. In primo luogo, quando il filamento viene inserito nell'ICA, anche il flusso sanguigno all'arteria cerebrale posteriore (PCA) potrebbe essere parzialmente bloccato, specialmente nei topi. Criticamente, l'arteria comunicante posteriore (PcomA), una piccola arteria che collega la circolazione cerebrale anteriore e posteriore, è spesso sottosviluppata in alcuni ceppi di topo, come C57Bl/6, il ceppo prevalentemente utilizzato nella ricerca sperimentale sull'ictus. Si ritiene che questa pervietà del PcomA contribuisca alla variabilità delle dimensioni della lesione nei topi dopo l'ictus5. Infatti, quando il flusso sanguigno al PCA scende precipitosamente durante l'MCAO e il PcomA non è in grado di fornire un flusso sanguigno collaterale sufficiente, l'infarto dell'ictus può espandersi nel territorio del PCA. Inoltre, in questo modello, una lunga durata dell'ischemia porta a una maggiore probabilità di mortalità nei topi. Di conseguenza, una breve durata MCAO di 30-60 minuti è tipicamente utilizzata nei topi. Tuttavia, la maggior parte dei pazienti colpiti da ictus sperimenta alcune ore di ischemia prima del trattamento di riperfusione. Pertanto, un modello di ictus murino con una durata estesa dell'ischemia è di elevata rilevanza clinica.
L'obiettivo generale di questa procedura è quello di modellare l'ictus ischemico in topi che hanno un infarto di medie dimensioni e un eccellente tasso di sopravvivenza. Questo modello transcranico MCAO affronta gli attributi critici dell'ictus clinico, poiché è possibile eseguire un'ischemia prolungata e i topi anziani tollerano bene questo modello, consentendo la valutazione a lungo termine del recupero funzionale.
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Protocollo
Tutte le procedure descritte in questo lavoro sono condotte in conformità con le linee guida NIH per la cura e l'uso degli animali nella ricerca e il protocollo è stato approvato dal Comitato per la cura e l'uso degli animali del Duke Institute (IACUC). Per il presente studio sono stati utilizzati topi maschi C57Bl/6 giovani (8-10 settimane) e anziani (22 mesi). Una panoramica di questo protocollo è illustrata nella Figura 1.
1. Preparazione chirurgica
- Esaminare il topo per anomalie macroscopiche e deficit comportamentali.
NOTA: Prima dell'intervento chirurgico, è importante che i chirurghi indossino DPI (dispositivi di protezione individuale) adeguati, tra cui maschera chirurgica, cuffia, guanti e camice. - Pesare il mouse; programmare il ventilatore (vedere la tabella dei materiali) in base al peso corporeo.
- Posizionare il mouse in una scatola di induzione per anestesia da 4 pollici x 4 pollici x 7 pollici. Accendere il flussometro di ossigeno (vedi Tabella dei materiali), impostato a 30, e il flussometro di protossido di azoto, impostato a 70. Accendi il vaporizzatore con isoflurano al 5%.
- Inserire il filo guida nel catetere endovenoso (IV) da 20 G.
- Estrarre il topo dalla scatola di induzione quando la sua frequenza respiratoria è ridotta a 30-40 respiri al minuto.
- Appoggiare il mouse sul banco operatorio in posizione supina. Estrarre la lingua del mouse e tenerla con le dita della mano sinistra. Inserire un laringoscopio (vedere Tabella dei materiali) nella bocca dell'animale per visualizzare le corde vocali.
- Stabilizzare il mento del mouse sul laringoscopio usando il dito medio destro. Liberare la mano sinistra per tenere il catetere endovenoso da 20 G.
- Inserire leggermente il filo guida nella corda vocale, quindi spingere lentamente il catetere endovenoso da 20 G nella trachea fino a quando la parte dell'ala del catetere non diventa uniforme con la punta del naso.
NOTA: Se il mouse è in movimento, non inserire il filo. Ciò può causare traumi alla trachea e sanguinamento. - Accendere il ventilatore (vedere la tabella dei materiali) e collegarlo al catetere endovenoso da 20 G intubato nel topo. Ridurre l'isoflurano all'1,5% e assicurarsi che entrambi i polmoni siano ventilati meccanicamente.
NOTA: Non dimenticare di ridurre la concentrazione di isoflurano. In caso contrario, il topo riceverà un'overdose di anestesia. - Applicare l'unguento per gli occhi su entrambi gli occhi e iniettare 5 mg/kg di carprofene per via sottocutanea.
- Tenere il mouse in posizione laterale con l'area temporale destra rivolta verso l'alto. Mantenere la temperatura rettale a 37 °C utilizzando un termoforo (35 °C) e una lampada riscaldante controllata da un regolatore di temperatura (vedi Tabella dei materiali).
- Radere la superficie tra l'occhio destro e l'orecchio e disinfettare l'area chirurgica almeno tre volte con tamponi di iodio e alcol.
2. Chirurgia MCAO
- Aprire la confezione dello strumento sterile per la chirurgia MCAO. Indossare guanti sterili ed eseguire un'incisione cutanea di 1 cm tra l'occhio destro e l'orecchio destro utilizzando forbici chirurgiche.
NOTA: Monitorare il colore della pelle, la temperatura corporea e la risposta al pizzicamento delle dita dei piedi ogni 15 minuti. - Sezionare la fascia sottostante con una pinza per esporre i muscoli temporali e massetere.
NOTA: Fare attenzione a non danneggiare la ghiandola parotide. - Usa le pinze per toccare la parte inferiore del muscolo temporale e rilevare la posizione dell'arco zigomatico. Allontanare con cautela i rami del nervo facciale.
- Utilizzare la punta di un'ansa per cauterizzazione ad alta temperatura (vedere Tabella dei materiali) per praticare un'incisione trasversale di 5 mm sul muscolo temporale.
- Utilizzare due pinze per sezionare l'arcata zigomatica sottostante ed esporre l'articolazione tra la mascella e le ossa zigomatiche.
- Usa le forbici per tagliare una porzione di 3 mm dell'arcata zigomatica e rimuoverla. Separare il muscolo massetere dalla base del cranio.
NOTA: Fare attenzione a non fratturare il seno retro-orbitale e la vena temporale superficiale. - Applicare quattro piccoli divaricatori posizionati in direzioni diverse per esporre la base cranica cranica, con i rami del nervo trigemino tirati lateralmente da un divaricatore.
NOTA: Un solco sulla superficie esterna della base cranica segna la posizione della fessura laterale tra i lobi frontale e temporale. L'MCA si trova qui (Figura 2A) e il suo tronco e i suoi rami sono visibili attraverso il cranio sottile e trasparente (Figura 2B). La relazione di questa arteria con le altre principali arterie cerebrali è mostrata nella Figura 2A. - Applicare una goccia di soluzione fisiologica normale allo 0,9% sul cranio sopra il tronco MCA e prossimale al ramo della corteccia rinale. Usa una smerigliatrice elettrica per assottigliare il cranio fino a quando non è visibile una piccola frattura.
NOTA: Non spingere la smerigliatrice contro il cranio, poiché potrebbe penetrare nel cranio e ferire l'arteria sottostante. - Usa la punta della pinza per sollevare il cranio assottigliato e rimuoverlo. Per i topi finti, fermati qui e non legare l'arteria.
NOTA: Si forma una piccola finestra rettangolare sul tronco MCA. - Posizionare un anello a filo singolo di seta intrecciata nera sopra l'MCA (Figura 2C). Inserire un 8-0 ago microchirurgico per sollevare il tronco MCA e legare la sutura (vedere Tabella dei materiali) sotto l'ago, lasciando entrambe le estremità dell'ago sulla parte superiore del nodo ad anello del filo di seta (Figura 2D).
- Per l'MCAO transitorio, stringere leggermente il nodo del filo di seta sotto l'ago per bloccare il flusso sanguigno arterioso (Figura 2E), che rappresenta l'insorgenza dell'MCAO.
- Utilizzare la pinza per tenere la sutura e rimuovere lentamente l'ago alla fine dell'ischemia (ad esempio, 60 minuti o più).
NOTA: Quando l'ago viene rimosso, il nodo del filo di seta viene sfilato dall'MCA e il cervello viene riperfuso (Figura 2F). - Per MCAO permanente, stringere saldamente l'anello del filo di seta attorno all'arteria e rimuovere l'ago. Tagliare e rimuovere i materiali di sutura in eccesso.
- Applicare una goccia di bupivacaina allo 0,25% sull'incisione cutanea e suturare il muscolo e la pelle separatamente utilizzando suture di nylon 6-0 in modo intermittente (vedere la tabella dei materiali). Applicare un unguento antibiotico sulla superficie dell'incisione cutanea.
NOTA: L'incisione cutanea può anche essere chiusa con graffette sterili o colla.
3. Cure post-chirurgiche
- Spegnere l'isoflurano per risvegliare il mouse. Scollegare il ventilatore quando viene ripristinata la respirazione spontanea.
- Trasferire il mouse in una camera di recupero (vedi Tabella dei materiali) a temperatura controllata.
- Estuba il mouse quando il suo riflesso di raddrizzamento viene ripristinato o inizia a muoversi.
- Monitorare attentamente il mouse in una camera a temperatura e umidità controllate. Riportare il topo nella gabbia di casa dopo che ha acquisito piena coscienza (periodo di recupero ~ 2 ore). Somministrare 5 mg/kg di Carprofene per via sottocutanea al giorno per 3 giorni.
4. Imaging a contrasto a speckle laser (LSCI)
- Sei e 24 ore dopo l'MCAO, montare il topo anestetizzato sul telaio stereotassico. Radersi la parte superiore della testa e pulirla con tre tamponi alternati di iodio e alcool.
NOTA: L'anestesia è stata eseguita come indicato al punto 1.3. Anche la LSCI viene eseguita prima dell'MCAO. - Fai un'incisione di 3 cm sulla linea mediana della pelle e seziona la pelle dal cranio. Applicare quattro piccoli divaricatori ad ago per esporre la parte superiore del cranio.
- Spostare la fotocamera a macchie laser (vedere Tabella dei materiali) sopra la testa e regolare la messa a fuoco della fotocamera. Immagine del flusso sanguigno cerebrale.
5. Colorazione del cloruro di 2,3,5-trifeniltetrazolio (TTC)
- Anestetizzare profondamente il topo con isoflurano al 5% alla fine dell'esperimento, in genere il giorno 1, 3 o 28 dopo l'ictus. Pizzica la coda per assicurarti che non ci sia risposta al dolore.
- Decapita il topo usando una forbice chirurgica e raccogli il cervello. Incubare il cervello in soluzione salina ghiacciata per 20 minuti.
- Metti il cervello in una matrice di affettatura del cervello sul ghiaccio e lascia cadere la soluzione salina fredda sul cervello. Tagliate il cervello a fette di 1 mm usando delle lamette sottili.
- Immergere le fette di cervello con lo stesso orientamento in un piatto di soluzione di TTC al 2% (vedi Tabella dei materiali). Conservare il piatto al buio a temperatura ambiente per 15 min.
NOTA: Il tessuto cerebrale normale diventa rosso e il tessuto ischemico rimane bianco. - Trasferire le fette di cervello in formalina al 10% per 24 ore di fissazione. Immagina le fette di cervello e misura l'area dell'infarto.
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Risultati
Con una visione diretta al microscopio operatorio, è possibile confermare visivamente che il flusso sanguigno MCA è bloccato durante l'ischemia. Il nostro studio precedente ha mostrato una riduzione del flusso sanguigno dell'>80% nell'area ischemica utilizzando un monitor laser Doppler6. Al fine di determinare le variazioni del flusso sanguigno post-MCAO, LSCI può essere utilizzato per confermare ulteriormente l'insulto ischemico e la riperfusione (Figura 1). Infat...
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Discussione
Il primo modello di occlusione transcranica MCA è stato stabilito nei ratti nel 1981 11,12 e sostituito dal modello MCAO senza craniectomia nel1989 4. L'occlusione transcranica iniziale dell'MCA aveva un ampio campo chirurgico, tale che l'intera arcata zigomatica veniva rimossa e i muscoli tirati lateralmente. I tessuti locali si sono gonfiati dopo l'intervento chirurgico, causando stress e diminuzione dell'assunzione di cibo per gli anima...
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Dichiarazioni
Tutti gli autori non hanno conflitti di interesse.
Ringraziamenti
Gli autori ringraziano Kathy Gage per il suo supporto editoriale. Le figure dello schema sono state create con BioRender.com. Questo studio è stato sostenuto da fondi del Dipartimento di Anestesiologia (Duke University Medical Center) e da sovvenzioni NIH (NS099590, HL157354, NS117973 e NS127163).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 0,25% bupivacaina | Hospira | NDC 0409-1159-18 | |
| 0,9% cloruro di sodio | ICU Medical | NDC 0990-7983-03 | |
| 2,3,5-trifeniltetrazolio cloruro (TTC) | Sigma o qualsiasi fornitore | ||
| Catetere IV da 20 G | BD | 381534 | 20 GA 1,6 IN |
| 30 G ago | BD | 305106 | |
| sutura in seta 4-0 | Look | SP116 | Sutura in seta intrecciata nera |
| 8-0 con ago... | Ethilon | 2822G | |
| Tamponi imbevuti di alcol | BD | 326895 | |
| Scatola di induzione per anestesia | Qualsiasi fornitore | Pexiglass | |
| Smerigliatrice elettrica | JSDA | JD 700 | |
| Punta ad anello per cauterizzazione ad alta temperatura | Bovie | AA03 | |
| Isoflurano | Covetrus | NDC 11695-6777-2 | |
| Monitor di perfusione laser doppler | Moor Instruments | moorVMS-LDF1 | |
| Unguento per occhi lubrificante | Bausch + Lomb | 339081 | |
| Sonda | rettale per topoPhysitemp | RET-3 | |
| Protossido di azoto | Airgas | UN1070 | |
| Otoscopio | Welchallyn | 728 | 2,5 mm Speculum Otoscope servito come laringoscopio per visualizzare le corde vocali nei topi |
| Oxygen | Airgas | UN1072 | |
| Povidone-iodio | CVS | 955338 | |
| Scatola di recupero | Brinsea | TLC eco | |
| Rimadyl (carprofene) | Zoetis | 6100701 | Iniettabile 50 mg/mL |
| Ventilatore per roditori | Kent Scientific | Roditore Jr. | |
| Regolatore di temperatura | Physitemp | TCAT-2DF | |
| Triplo antibio e antidolorifico | CVS | NDC 59770-823-56 | |
| Vaporizzatore | RWD | R583S |
Riferimenti
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