In questo studio, è stata progettata un'applicazione di dot-blot per rilevare Leptospira dai tre cladi principali nei campioni d'acqua. Questo metodo consente l'identificazione di quantità minime di DNA specificamente bersaglio di una sonda marcata con digossigenina, facilmente rilevabili da un anticorpo anti-digossigenina. Questo approccio è uno strumento prezioso e soddisfacente ai fini dello screening.
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Articolo metodologico
Reazione a catena della polimerasi e ibridazione dot-blot per la rilevazione di leptospira in campioni d'acqua
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il dot-blot è una tecnica semplice, veloce, sensibile e versatile che consente l'identificazione di quantità minime di DNA specificamente bersaglio dell'ibridazione della sonda in presenza di DNA vettore. Si basa sul trasferimento di una quantità nota di DNA su un supporto solido inerte, come una membrana di nylon, utilizzando l'apparato dot-blot e senza separazione elettroforetica. Le membrane in nylon hanno il vantaggio di un'elevata capacità di legame dell'acido nucleico (400 μg/cm2), un'elevata resistenza e sono caricate positivamente o neutramente. La sonda utilizzata è un frammento di ssDNA altamente specifico di 18-20 basi lunghe marcate con digossigenina (DIG). La sonda si coniugherà con il DNA di Leptospira . Una volta che la sonda si è ibridata con il DNA bersaglio, viene rilevata da un anticorpo anti-digossigenina, consentendone una facile rilevazione attraverso le sue emissioni rivelate in una pellicola radiografica. I punti con un'emissione corrisponderanno ai frammenti di DNA di interesse. Questo metodo impiega la marcatura non isotopica della sonda, che può avere un'emivita molto lunga. Lo svantaggio di questa immuno-marcatura standard è una sensibilità inferiore rispetto alle sonde isotopiche. Tuttavia, è mitigato dall'accoppiamento della reazione a catena della polimerasi (PCR) e dai saggi dot-blot. Questo approccio consente l'arricchimento della sequenza di destinazione e il relativo rilevamento. Inoltre, può essere utilizzato come applicazione quantitativa se confrontato con una diluizione seriale di uno standard noto. Qui viene presentata un'applicazione dot-blot per rilevare Leptospira dai tre cladi principali nei campioni d'acqua. Questa metodologia può essere applicata a grandi quantità di acqua una volta che sono state concentrate mediante centrifugazione per fornire prove della presenza di DNA leptospirale. Questo è uno strumento prezioso e soddisfacente per scopi di screening generali e può essere utilizzato per altri batteri non coltivabili che possono essere presenti nell'acqua, migliorando la comprensione dell'ecosistema.
Introduzione
La leptospirosi nell'uomo ha origine principalmente da fonti ambientali 1,2. La presenza di Leptospira in laghi, fiumi e torrenti è un indicatore della trasmissione della leptospirosi tra la fauna selvatica e gli animali domestici e da produzione che possono eventualmente entrare in contatto con questi corpi idrici 1,3,4. Inoltre, Leptospira è stata identificata in fonti non naturali, tra cui acque reflue, stagnanti e di rubinetto 5,6.
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Protocollo
1. Preparazione del campione
- Concentrare ogni campione d'acqua in provette da microcentrifuga da 1,5 mL mediante centrifugazione a 8.000 x g per 10 minuti a 4 °C. Ripetere questo passaggio, tutte le volte che è necessario, per concentrare il campione in un volume di 250 μl.
- Utilizzare il kit di estrazione del DNA secondo le istruzioni del produttore (vedere la tabella dei materiali).
- Eseguire la PCR specifica in base alla sonda dot-blot che verrà utilizzata (Tabella 1).
- Eseguire le amplificazioni in provette PCR con il volume finale di 25 μL contenenti 1 tampone X, 2,5 un....
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Risultati
Per valutare l'efficacia della tecnica, è stato utilizzato DNA genomico da colture pure di ciascun sierotipo di Leptospira , insieme alla sonda specifica per clade. Le membrane sono state preparate con 100 ng di DNA genomico per reazione PCR per ciascun sierotipo, seguito da otto DNA genomico di batteri non correlati e concentrazioni variabili di DNA genomico dei sierotipi Leptospira ad hoc . Ogni test includeva un controllo positivo, negativo e non modello. Questi DNA genomici non correlati non hanno m.......
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Discussione
Le fasi critiche della tecnica dot-blot includono (1) immobilizzazione del DNA, (2) blocco dei siti di legame liberi sulla membrana con DNA non omologo, (3) la complementarità tra la sonda e il frammento bersaglio in condizioni di ricottura, (4) rimozione della sonda non ibridata e (5) il rilevamento della molecola reporter41.
La PCR-Dot-blot presenta alcune limitazioni, come la tecnica che non fornisce informazioni sulle dimensioni del frammento37
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano che non vi è alcun conflitto di interessi.
Ringraziamenti
Siamo in debito con la collezione Leptospira del Dipartimento di Microbiologia e Immunologia, Facoltà di Medicina Veterinaria e Zootecnica, Università Nazionale Autonoma del Messico. Siamo grati per la generosa donazione dei ceppi di riferimento Leptospira ; Leptospira fainei sierotipo Hurstbridge ceppo BUT6 e Leptospira biflexa sierovariante Patoc ceppo Patoc I al Dr. Alejandro de la Peña Moctezuma. Ringraziamo il Dott. José Antonio Ocampo Cervantes, Coordinatore del CIBAC, e il personale per il loro supporto logistico. EDT faceva parte del programma Terminal Project per studenti universitari della Metropolitan Autonom....
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| REAGENTS | |||
| Purelink Kit di estrazione del DNA | Invitrogen | K182002 | |
| Gotaq Flexi DNA Polimerase (End-Point PCR Taq polimerasi) | Promega | M3001 | |
| Carta da filtro Whatman, grado 1, | Merk | WHA1001325 | |
| membrane di nylon, carica positivamente Rotolo 30cm x 3 m | Roche | ||
| Anti-Digoxigenina-AP, Frammenti Fab Ovino Policlonale Anticorpo primario | Roche | 11093274910 | |
| Base media EMJH | Difco | S1368JAA | |
| Arricchimento di leptospira EMJH | Difco | BD 279510 | |
| Reagente bloccante | Roche | 11096176001 | |
| CSPD pronto all'uso Disodio 3-(4-metossispiro {1,2-diossatano-3,2&primo;-(5&primo;-cloro) triciclo [3.3.1.13,7] decan}8-4-il) fenil fosfato | Merk | 11755633001 | |
| Acido desossiribonucleico da spermatozoi di aringhe | Sigma Aldrich | D3159 | |
| Sviluppatore | Carestream Carestream Health Inc | GBX5158621 | |
| Digoxigenina-11-ddUTP | Roche | 11363905910 | |
| EDTA, sale disodico (diidrato) | Promega | H5032 | |
| Ficoll 400 | Sigma Aldrich | F8016 | |
| Fixer Carestream | Carestream Carestream Health Inc | GBX 5158605 | |
| Lauryl sulfate Sodium Salt (Sodium dodecyl sulfate; SDS) C12H2504SNa | Sigma Aldrich | L5750 | |
| N- Lauroilsarcosina sale sodico CH3(CH2)10CON(CH3) CH2COONa | Sigma Aldrich | L-9150 | È un tensioattivo anionico |
| Polivinilpirrolidone (PVP-40) | Sigma Aldrich | PVP40 | |
| Polietilenglicole Monolaurato di sorbitano (Tween 20) | Sigma Aldrich | 9005-64-5 | |
| Cloruro di sodio (NaCl) | Sigma Aldrich | 7647-14-5 | |
| Sodio dodecil solfato (SDS) | Sigma Aldrich | 151-21-3 | |
| Idrossido di sodio (NaOH) | Sigma Aldrich | 1310-73-2 | |
| Sodio fosfato bibasico (NaH2PO4) | Sigma-Aldrich | 7558-79-4 | |
| Transferasi terminale, ricombinante | Roche | 3289869103 | |
| Tris cloridrato (Tris HCl) | Sigma-Aldrich | 1185-53-1 | |
| SSPE 20X | Sigma-Aldrich | S2015-1L | Può essere fatto in casa seguendo File supplementare 6 |
| Primer | Sigma-Aldrich | Su richiesta | Segui la tabella 1 |
| Sonde | Sigma-Aldrich | Su richiesta | Segui la tabella 1 |
| Equipment | |||
| Nanodrop™ Uno spettrofotometro | Thermo-Scientific | ND-ONE-W | |
| Microcentrifuga refrigerata Sigma 1-14K, adatta per la centrifugazione di provette per microcentrifuga da 1,5 ml a 14.000 giri/min | Sigma-Aldrich | 1-14K | |
| Pipette regolabili disinfettate, gamma 2-20 e micro; l, 20-200 µ l | Gilson | SKU:F167360 | |
| Provette monouso per microcentrifuga da 1,5 ml (autoclavate) | Axygen | MCT-150-SP | |
| Monouso 600 & micro; l provette per microcentrifuga (autoclavate) | Axygen | 3208 | |
| Puntali per pipette monouso 1-10 & micro; l | Axygen | T-300 | |
| Puntali per pipette monouso 1-200 &; l | Axygen | TR-222-Y | |
| Apparecchio Dot-Blot Bio-Dot | BIORAD | 1706545 | |
| Aspirazione portatile Hergom | Hergom | 7E-A | |
| Scientific Light Box (luce visibile PH90-115V) | Hoefer | PH90-115V | |
| Reticolante UV | Hoefer | UVC-500 | |
| Thermo Hybaid PCR Express Thermocycler | Hybaid | ||
| Cassetta radiografica con piastra IP14 X 17 | Fuji |
Riferimenti
- Bierque, E., Thibeaux, R., Girault, D., Soupé-Gilbert, M. E., Goarant, C. A systematic review of Leptospira in water and soil environments. PLOS One. 15 (1), e0227055(2020).
- Haake, D. A., Levett, P. N. Leptospirosis in humans. Current Topics in Microbiology and Immunology. 387
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Ristampe e permessi
