La rete mitocondriale è estremamente complessa, il che la rende molto difficile da analizzare. Un nuovo strumento MATLAB analizza i mitocondri confocali in tempo reale nelle immagini timelapse, ma produce un grande volume di output che richiede un'attenzione manuale individuale. Per risolvere questo problema, è stata sviluppata un'ottimizzazione di routine, che consente una rapida analisi dei file.
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Articolo metodologico
Analisi automatizzata ottimizzata della modulazione dell'omeostasi dei mitocondri neuronali vivi da parte dei recettori dell'acido retinoico isoform-specifici
In questo articolo
Sommario
Abstract
La complessa rete mitocondriale rende molto difficile segmentare, seguire e analizzare le cellule vive. Gli strumenti MATLAB consentono l'analisi dei mitocondri in file timelapse, semplificando e velocizzando notevolmente il processo di elaborazione delle immagini. Ciononostante, gli strumenti esistenti producono un grande volume di output, che richiede un'attenzione manuale individuale, e le configurazioni sperimentali di base hanno un output di migliaia di file, ognuno dei quali richiede una gestione estesa e dispendiosa in termini di tempo.
Per risolvere questi problemi, è stata sviluppata un'ottimizzazione di routine, sia in codice MATLAB che in forma live-script, che consente una rapida analisi dei file e riduce significativamente la lettura e l'elaborazione dei dati. Con una velocità di 100 file/min, l'ottimizzazione consente un'analisi complessivamente rapida. L'ottimizzazione raggiunge l'output dei risultati calcolando la media dei dati specifici del frame per i singoli mitocondri in intervalli di tempo, analizzando i dati in modo definito, coerente con quelli degli strumenti esistenti. L'imaging confocale dal vivo è stato eseguito utilizzando il colorante tetrametilrodamina estere metilico e l'ottimizzazione di routine è stata convalidata trattando le cellule neuronali con agonisti del recettore dell'acido retinoico (RAR), i cui effetti sui mitocondri neuronali sono stabiliti in letteratura. I risultati sono stati coerenti con la letteratura e hanno permesso un'ulteriore caratterizzazione del comportamento della rete mitocondriale in risposta alla modulazione RAR isoforma-specifica.
Questa nuova metodologia ha permesso una caratterizzazione rapida e validata della rete mitocondriale dell'intero neurone, ma consente anche la differenziazione tra mitocondri assone e corpo cellulare, una caratteristica essenziale da applicare nel campo delle neuroscienze. Inoltre, questo protocollo può essere applicato a esperimenti che utilizzano trattamenti ad azione rapida, consentendo l'imaging delle stesse cellule prima e dopo i trattamenti, trascendendo il campo delle neuroscienze.
Introduzione
I mitocondri cellulari sono al centro di tutti gli stati fisiologici e una comprensione approfondita della loro omeostasi (mitostasi) e del loro comportamento è fondamentale per aiutare a identificare il trattamento farmacologico per una vasta gamma di malattie, tra cui il cancro e il morbo di Alzheimer 1,2.
I mitocondri svolgono ruoli cellulari cruciali nell'omeostasi energetica, nella generazione di ATP, nel tamponamento del calcio e nella regolazione dei ROS, e la mitostasi è essenziale per mantenere l'omeostasi proteica poiché gli chaperoni molecolari sono dipendenti dall'energi....
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Protocollo
NOTA: Questo protocollo prevede due fasi principali: una fase di laboratorio umido, che coinvolge la coltura cellulare e la microscopia confocale dal vivo per ottenere immagini di mitocondri vivi (Figura 1) e una fase in silico per analizzare le immagini ottenute (Figura 2). Per l'analisi automatizzata dei dati dei mitocondri 3D con immagini dal vivo, è stata utilizzata l'applicazione MATLAB Mitometer fornita da Lefebvre et al.9. L'ottimizzazione di routine è scritta in MATLAB. Il software, le versioni aggiornate e le macro ImageJ per l'elaborazione sono disponibili gratuitame....
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Risultati
Per migliorare e accelerare l'analisi dei file di output in .txt formato, è stata codificata un'ottimizzazione di routine che legge i dati coerenti con i file di output di Mitometer .txt, con colonne che rappresentano un frame e linee che rappresentano i mitocondri identificati. L'ottimizzazione di routine produce dati in un unico valore per parametro calcolando la media dei frame per ogni mitocondri identificato e quindi calcolando la media dei risultati di tutti i mitocondri per campo visivo. La routine sviluppata legg.......
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Discussione
L'imaging di cellule vive produce file di grandi dimensioni che richiedono una seria elaborazione informatica, ma anche gli strumenti più recenti richiedono un ampio input manuale per l'elaborazione. Questa ottimizzazione di routine si concentra sulla semplificazione del processo di analisi dei mitocondri sul mitometro perché questo strumento presenta un ottimo equilibrio tra l'input dell'utente e l'output dei dati. In precedenza è stato esaminato un confronto completo tra diversi strumenti per l'analisi delle immagini d.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.
Ringraziamenti
L'acquisizione delle immagini è stata eseguita nella struttura LiM di iBiMED, un nodo di PPBI (Piattaforma Portoghese di BioImaging): POCI-01-0145-FEDER-022122. Questo lavoro è stato sostenuto da FCT (EXPL/BTM-SAL/0902/2021), LCF (CI21-00276), una sovvenzione a DT dalla Fundação para a Ciência e Tecnologia del Ministério da Educação e Ciência (2020.02006.CEECIND), una sovvenzione da ATG-The Gabba Alumni Association a VP e dall'Istituto di Biomedicina-iBiMED, Università di Aveiro.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| AM580 | Sigma-Aldrich | A8843 | |
| BDNF | Thermo-Fisher | RP8642 | |
| BMS493 | Tocris Bioscience | 3409 | |
| CD2314 | Tocris Bioscience | 3824 | |
| Ch55 | Tocris Bioscience | 2020 | |
| Siero bovino fetale | Thermo-Fisher | 10270106 | |
| GraphPad Prism v4.0 | GraphPad Software, La Jolla | n/a | |
| Ham' s F12 Miscela di nutrienti | Thermo-Fisher | 21765029 | |
| MATLAB R2022a | MathWorks | n/a | |
| Minimal Essential Medium | Thermo-Fisher | 31095 | |
| Nunc Piatti con fondo in vetro | Thermo-Fisher | 150680 | |
| Soluzione salina tampone fosfato | Thermo-Fisher | 28372 | |
| Acido retinoico | Sigma-Aldrich | R2625 | |
| TMRM | Thermo-Fisher | T668 | |
| Zeiss LSM 510 | Carl Zeiss | n/a | Dotato di camera di coltura per imaging di cellule vive e obiettivo ad immersione in olio 63x |
Riferimenti
- Trigo, D., Avelar, C., Fernandes, M., Sa, J., da Cruz, E. S. O. Mitochondria, energy, and metabolism in neuronal health and disease. FEBS Letters. 596 (9), 1095-1110 (2022).
- Zong, W. X., Rabinowitz, J. D., White, E. Mitochondria and cancer. Molecular Cell. 61 (5), 667-676 (2016).
- C....
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Ristampe e permessi
