Trasformazione della radice pelosa di soia per l'analisi della funzione genica

La soia (Glycine max) è tra le colture più preziose in agricoltura. Ha migliaia di usi commerciali e industriali, come cibo, mangimi, petrolio e come fonte di materie prime per la produzione¹. La sua capacità di formare una relazione simbiotica con i microrganismi del suolo che fissano l'azoto, vale a dire la rizobia, eleva ulteriormente l'importanza di studiare la genetica della soia². Ad esempio, la messa a punto delle proprietà di fissazione dell'azoto nelle radici di soia può portare alla riduzione delle emissioni di carbonio e ridurre notevolmente i requisiti per il fertilizzante azotato³. Pertanto, la comprensione della genetica che controlla gli aspetti della biologia delle radici di soia, in particolare, ha ampie applicazioni in agricoltura e nell'industria. Considerando questi benefici, è importante disporre di un protocollo affidabile per analizzare la funzione dei geni della soia.

Agrobacterium tumefaciens è forse lo strumento più comunemente usato per la trasformazione genetica delle piante in quanto ha la capacità di integrare il DNA di trasferimento (T-DNA) nel genoma nucleare di molte specie vegetali. Quando Agrobacterium infetta una pianta, trasferisce il plasmide che induce il tumore (Ti) nel cromosoma ospite, portando alla formazione di un tumore nel sito di infezione. La trasformazione mediata da Agrobacterium è stata ampiamente utilizzata per decenni per l'analisi funzionale genica e al fine di modificare i tratti delle colture⁴. Sebbene qualsiasi gene di interesse possa essere facilmente trasferito nelle cellule della pianta ospite attraverso la trasformazione mediata da A. tumefaciens, questo metodo presenta diversi inconvenienti; È dispendioso in termini di tempo, costoso e richiede una vasta esperienza per molte specie di piante, come la soia. Sebbene alcune varietà di soia possano essere trasformate dall'approccio del nodo cotiledonario utilizzando A. tumefaciens, l'inefficienza di questo approccio richiede la necessità di una tecnologia di trasformazione genetica alternativa che sia rapida e altamente efficiente ^4,5. Anche un non esperto può utilizzare questo metodo di trasformazione della radice pelosa (HR) mediata da Agrobacterium rhizogenes per superare questi svantaggi.

La trasformazione HR è uno strumento relativamente veloce, non solo per analizzare la funzione genica, ma anche per applicazioni biotecnologiche, come la produzione di metaboliti specializzati e chimica fine e complesse glicoproteine bioattive⁶. La produzione di HR di soia non richiede competenze approfondite, in quanto possono essere generate ferendo le superfici dei cotiledoni, seguita dall'inoculazione con Agrobacterium rhizogenes⁷. A. rhizogenes esprime geni di virulenza (Vir) codificati dal suo plasmide Ti che trasferiscono, trasportano e integrano il suo segmento di T-DNA nel genoma delle cellule vegetali stimolando contemporaneamente la crescita delle radici ectopiche⁸.

Rispetto ad altri sistemi di espressione genica della soia, come la biolistica, la trasformazione basata su A. tumefaciens di tessuti, cellule e colture di organi, il sistema di espressione HR presenta diversi vantaggi. In primo luogo, le HR sono geneticamente stabili e prodotte rapidamente su terreni privi di ormoni ^1,9,10. Inoltre, le HR possono produrre metaboliti specializzati in quantità equivalenti o superiori alle radici native^11,12. Questi vantaggi rendono le HR uno strumento biotecnologico desiderabile per le specie vegetali che sono incompatibili con A. tumefaciens o che richiedono particolari condizioni di coltura tissutale per formare tessuti compatibili. Il metodo HR è un approccio efficiente per analizzare le interazioni proteina-proteina, la localizzazione subcellulare delle proteine, la produzione di proteine ricombinanti, la fitorimediazione, la mutagenesi e gli effetti dell'intero genoma utilizzando il sequenziamento dell'RNA^13,14,15. Può anche essere usato per studiare la produzione di metaboliti specializzati che hanno valore nel settore, tra cui le gliceolline, che medicano la difesa della soia contro l'importante patogeno microbico Phytophthora sojae e hanno impressionanti attività antitumorali e neuroprotettive negli esseri umani^16,17.

Questo rapporto dimostra un protocollo semplice ed efficiente per produrre HR di soia. Rispetto ai precedenti metodi di trasformazione HR, questo protocollo fornisce un miglioramento significativo (33% -50%) nel tasso di formazione di HR prescreening dei trasformanti A. rhizogenes per la presenza del plasmide Ti prima di inoculare i cotiledoni di soia. Dimostriamo l'applicabilità di questo protocollo trasformando diversi vettori binari che sovraesprimono o silenziano i geni del fattore di trascrizione della soia.

NOTA: Si raccomanda che tutte le fasi del procedimento siano condotte in condizioni sterili.

1. Sterilizzazione dei semi di soia

1. In un armadio di biosicurezza, posizionare 16-20 semi di soia Williams 82 rotondi in ottime condizioni (cioè senza crepe o imperfezioni) in una provetta da centrifuga da 50 ml.
2. Aggiungere 30 ml di alcool isopropilico al 70%, agitare delicatamente per 30 s, quindi decantare l'alcol.
3. Agitare delicatamente i semi con 30 ml di candeggina al 10% per 10 s e lasciare riposare i semi nella soluzione per 5 minuti a temperatura ambiente (RT, 25 °C). Dopo 5 minuti, scolare la candeggina.
4. Ripetere l'agitazione tre volte con 30 ml di H 2 O ultrapuro sterile per1 minuto per risciacquo ed eliminare l'H₂O tra ogni risciacquo.
5. Posizionare i semi sterilizzati su carta da filtro satura di 5 ml di terreno di germinazione e co-coltivazione (GC) (mezzo di autoclave semi-forza liquido Murashige e Skoog [MS] con 1% di saccarosio [pH = 5,8] e quindi aggiungere 2,5 ml / L di vitamine) in piastre di Petri sterili.
6. Porre le piastre al buio a RT (25 °C) per 3 giorni prima di trasferire le piastre a 22 °C sotto 16 h luci fluorescenti T5 bianco freddo (100 μE ^m-2·s-1) per 4 giorni per consentire ai semi di germinare.
   NOTA: Scartare i semi rugosi o incrinati. I semi migliori sono quelli che sono grandi e uniformemente gialli. Sterilizzare almeno il doppio del numero di semi necessari per l'esperimento per selezionare semi di buona qualità, poiché alcuni semi potrebbero non essere ottimali a causa di danni, malattie o mancata germinazione.

2. Infezione di cotiledoni con K599

NOTA: Utilizzare vettori della serie pGWB, poiché la loro doppia selezione garantisce l'integrazione genomica dell'intera cassetta T-DNA. L'elettroporazione è stata utilizzata per trasformare un vettore binario che ospita il gene di interesse in A. rhizogenes pRi2659¹⁸.

1. Sulla base della sequenza del plasmide 18 di A. rhizogenes pRi2659, progettare primer per rilevare il gene plasmidico Ti VirD2 (VirD2 forward: 5'-CCCGATCGAGCTCAAGTTAT-3'; VirD2 inverso: 5'-TCGTCTGGCTGACTTTCGT-3'; Dimensione di amplificazione prevista: 221 bp). Dopo la trasformazione, testare le colonie di Agrobacterium per la ritenzione di VirD2 mediante reazione a catena della polimerasi (PCR) utilizzando un kit PCR (vedere Tabella dei materiali). Ciclo PCR: 94 °C per 3 min; 35 cicli (94 °C per 1 min, 58 °C per 30 sec, 72 °C per 1 min); e 72 °C per 10 min.
2. Dopo aver selezionato la colonia di A. rhizogenes che contiene sia VirD2 che il gene di interesse (GOI), striarne alcune su piastre medie Luria-Bertani (LB) contenenti gli antibiotici appropriati (50 mg/L) per il plasmide di interesse e incubare per una notte a 30 °C. Se si utilizza la spectinomicina, aggiungere una concentrazione di 100 mg / L.
3. Utilizzare una punta di pipetta P200 per raschiare via una lunghezza di ~ 1,5 cm di K599 Agrobacterium dalle piastre LB e risospendere le cellule in 1 mL di tampone fosfato (PB; 0,01 M Na₂HPO₄, 0,15 M NaCl, pH 7,5).
4. Diluire l'Agrobacterium in H₂O (v/v = 1:1) e acetosiringone sterilizzato ultrapuro (AS; 100 mM di stock in dimetilsolfossido, v/v = 1:1000). Misurare l'assorbanza utilizzando un tubo cuvette a una densità ottica di 600 nm (OD600). L'intervallo ottimale previsto è compreso tra 0,5 e 0,8.
5. In un armadio di biosicurezza, immergere un bisturi sterilizzato nella soluzione K599 Agrobacterium ed eseguire diversi tagli profondi di 1 mm lungo la superficie interna (lato adasassiale, piatto) del cotiledone. Durante l'inoculazione, utilizzare una pinza sterilizzata per stabilizzare il cotiledone.
6. Posizionare circa 6-8 cotiledoni tagliati con il lato rivolto verso il basso su una piastra di Petri contenente carta da filtro satura di mezzo GC con AS.
   NOTA: Per preparare 6 piastre, sono sufficienti 50 ml di terreno GC e 50 μL di 100 mM AS per ottenere una concentrazione finale di 100 μM.
7. Incubare le lastre a RT (25 °C) per 3 giorni sotto un fotoperiodo di 16 ore (~65 μE).
8. Trasferire i cotiledoni infetti su piastre di crescita delle radici pelose (HRG) (MS autoclave a mezza forza con saccarosio al 3% [pH = 5,8] e 2,6 g / L di Gelzan, quindi aggiungere 2,5 ml / L di miscela di vitamine e 500 mg / L di timentina).
   NOTA: Ci sono stati alcuni problemi con timentin da alcuni fornitori alternativi, di cui il K599 non è stato eliminato. Si consiglia di utilizzare piastre di Petri più alte (100 mm x 25 mm) per il mezzo HRG.
9. Incubare le piastre HRG a 22 °C in una camera di crescita con i parametri impostati su 100 μE di luce su un fotoperiodo di 16 ore fino a quando non si osservano radici primarie con radici secondarie lunghe 2-3 cm (~3-4 settimane).

3. Selezione e raccolta delle risorse umane

1. Raccogliere radici primarie (5-7 cm di lunghezza) che crescono dal callo e contengono radici secondarie (2-3 cm di lunghezza) usando un bisturi sterile e una pinza. Trasferire alla selezione piastre HRG contenenti gli antibiotici appropriati. Lascia crescere le HR per altri 5 giorni sulle piastre HRG di selezione.
   NOTA: Kanamicina (50 mg / L), igromicina (50 mg / L), o fosfinotricina (10 mg / L) sono tipicamente utilizzati per la selezione. Per i vettori di espressione, pGWB2 è usato per la sovraespressione, pANDA35HK è usato per il silenziamento dell'RNAi, pGWB6 è usato per la localizzazione subcellulare e pMDC7 è usato per l'espressione inducibile.
2. Il giorno 5, raccogliere HR transgenici con radici secondarie lunghe 3-6 cm. Se si osservano le proteine fluorescenti, le radici secondarie hanno poca autofluorescenza. Se si eseguono trattamenti elicitori o chimici, tagliare le radici secondarie in pezzi di 1 cm e posizionare ~ 100 mg su agar HRG in una pila. Quindi, saturare le pile con 80 μL del trattamento appropriato e lasciare che le piastre incubano a RT (25 °C).
3. Dopo il tempo di trattamento desiderato, procedere con estrazioni di RNA o metaboliti.
4. Per l'RNA, tamponare rapidamente le radici secche su un tovagliolo di carta sterilizzato e raccoglierle direttamente in una provetta da microcentrifuga da 2 ml.
5. Sigillare immediatamente la parte superiore del tubo usando il parafilm, praticare due piccoli fori con una pinza appuntita e immergere i tubi in azoto liquido. Liofilizzare per 3 giorni, quindi conservare i campioni a -80 °C.
   NOTA: è essenziale selezionare HR bianchi. Dopo 5 giorni di crescita sulla piastra selettiva, le HR transgeniche rimarranno bianche, ma le radici non transgeniche diventeranno marroni.

I risultati rappresentativi sono tratti dai dati pubblicati19,20. I risultati della PCR di colonia (cPCR) dell'agrobatterio K599 trasformato sono mostrati nella Figura 1. Come indicato dalle colonie positive nella Figura 1, il gene di interesse è stato rilevato mediante cPCR (Figura 1A). Tuttavia, da un terzo alla metà delle colonie erano negative per lo screening del gene VirD2 (Figura 1B), indicando la perdita del plasmide Ti, e sarebbero incapaci di generare callo o radici pelose. La figura 2 illustra la procedura complessiva di preparazione delle HR della soia e l'analisi dell'espressione genica. La Figura 3 illustra la localizzazione subcellulare di GFP-GmJAZ1-6. La Figura 4 è un'analisi dell'espressione genica che mostra la sovraespressione del fattore di trascrizione della gliceollina GmHSF6-1 e il silenziamento dell'RNAi di GmMYB29A2 nelle radici pelose di Williams 82. Risultati simili sono stati ottenuti in diversi rapporti recenti20,21.

Figura 1: Colony PCR (cPCR) dell'agrobatterio K599 utilizzando primer per colony PCR del gene di interesse o VirD2. (A) Gene di interesse cPCR. (B) VirD2 cPCR. Abbreviazioni: C = colonia; +ve = controllo positivo; -ve = controllo negativo. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 2: Panoramica della coltura della radice pelosa di soia (HR) e della procedura di analisi della funzione genica. I calli si sono formati sul sito di ferita 2 settimane dopo l'infezione da K599 Agrobacterium . La differenziazione cellulare si è verificata dopo 1 settimana, quindi è trascorsa 1 settimana per l'allungamento HR. Questo è stato seguito dalla raccolta HR e dal trattamento Wall glucan elicitor (WGE) / mock per 24 ore. Le HR sono state sottoposte rispettivamente all'estrazione dei metaboliti per l'analisi della cromatografia liquida ad ultra prestazioni (UPLC) e all'isolamento dell'RNA per l'analisi dell'espressione genica. WGE è l'elicitore di glucano murale di Phytophthora sojae. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 3: Microscopia a fluorescenza di GmJAZ1-6 traslazionalmente fuso in una proteina fluorescente verde (GFP) nelle radici pelose transgeniche di Williams 82. (A) Canale verde (GFP). (B) Canale blu (DAPI). (C) Canali verdi e blu uniti. Tutte le immagini sono state raccolte utilizzando un microscopio confocale Zeiss. Le immagini DAPI (6 μg/mL) indicano la colorazione nucleare. Le barre della scala sono 5 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Analisi dell'espressione genica. (A) Espressione genica nella sovraespressione di GmHSF6-119 Williams 82 HR di soia sotto trattamento simulato di 24 ore o indotta per 24 ore con WGE. (B) Espressione genica in RNAi-GmMYB29A2 20 Williams 82 HRs di soia suscitati per 24 ore con WGE. WGE è l'elicitore di glucano murale di Phytophthora sojae. unSignificativamente maggiore e bsignificativamente inferiore al controllo, gli studenti accoppiati t-test (p < 0,01). Le barre di errore rappresentano SE (n ≥ 3 repliche biologiche). Le radici secondarie raccolte da una radice primaria indicavano una replica biologica. Questa cifra è stata modificata con il permesso di Lin et al.19 e Jahan et al.20. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Gli autori non hanno nulla da rivelare.