Qui, presentiamo un protocollo che consente la fabbricazione rapida, robusta ed economica di sferoidi tumorali seguita dall'incapsulamento dell'idrogel. È ampiamente applicabile in quanto non richiede attrezzature specializzate. Sarebbe particolarmente utile per esplorare le interazioni sferoide-matrice e costruire modelli di fisiologia o patologia tissutale in vitro .
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Articolo metodologico
Fabbricazione e incapsulamento di sferoidi tumorali in idrogel di polietilenglicole per lo studio delle interazioni sferoide-matrice
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'incapsulamento tridimensionale (3D) degli sferoidi è fondamentale per replicare adeguatamente il microambiente tumorale per una crescita cellulare ottimale. Qui, abbiamo progettato un modello di glioblastoma 3D in vitro per l'incapsulamento sferoidale per imitare il microambiente extracellulare del tumore. Innanzitutto, abbiamo formato stampi per micropozzetti piramidali quadrati utilizzando il polidimetilsilossano. Questi stampi per micropozzetti sono stati poi utilizzati per fabbricare sferoidi tumorali con dimensioni strettamente controllate da 50 a 500 μm. Una volta formati, gli sferoidi sono stati raccolti e incapsulati in idrogel a base di polietilenglicole (PEG). Gli idrogel PEG sono una piattaforma versatile per l'incapsulamento degli sferoidi, poiché le proprietà dell'idrogel come la rigidità, la degradabilità e l'adesività cellulare possono essere regolate in modo indipendente. In questo caso, abbiamo utilizzato un idrogel morbido rappresentativo (~8 kPa) per incapsulare gli sferoidi del glioblastoma. Infine, è stato sviluppato un metodo per colorare e visualizzare gli sferoidi per ottenere immagini di alta qualità tramite microscopia confocale. A causa del denso nucleo sferoidale e della periferia relativamente scarsa, l'imaging può essere difficile, ma l'uso di una soluzione di purificazione e di un sezionamento ottico confocale aiuta ad alleviare queste difficoltà di imaging. In sintesi, mostriamo un metodo per fabbricare sferoidi uniformi, incapsularli in idrogel PEG ed eseguire la microscopia confocale sugli sferoidi incapsulati per studiare la crescita degli sferoidi e le varie interazioni cellula-matrice.
Introduzione
Gli sferoidi tumorali sono emersi come utili strumenti in vitro nello studio dell'eziologia, della patologia e della risposta ai farmacidel cancro 1. Tradizionalmente, gli sferoidi sono stati coltivati in condizioni come piastre a bassa adesione o bioreattori, in cui l'adesione cellula-cellula è favorita rispetto all'adesione cellula-superficie2. Tuttavia, è ormai riconosciuto che per ricapitolare più fedelmente il microambiente tumorale, i modelli di sferoidi in vitro dovrebbero catturare sia le interazioni cellula-cellula che cellula-matrice. Ciò ha spinto diversi gruppi a progettare scaffold, come gl....
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Protocollo
1. Preparazione delle soluzioni
- Preparazione di una soluzione di precursore del polidimetilsilossano (PDMS)
- Preparare la soluzione negativa del precursore del PDMS (utilizzata anche per la soluzione del precursore della colla). Raccogli l'elastomero in una bilancia usando una spatola e pesalo. Aggiungere l'agente indurente alla base elastomerica in rapporto 1:10. Mescolare il PDMS e l'agente indurente delicatamente e accuratamente utilizzando la spatola nella bilancia di plastica.
NOTA: Questa soluzione precursore PDMS viene versata nella piastra a micropozzetti piramidale quadrata a 6 pozzetti per formare lo stampo negativo. Quest....
- Preparare la soluzione negativa del precursore del PDMS (utilizzata anche per la soluzione del precursore della colla). Raccogli l'elastomero in una bilancia usando una spatola e pesalo. Aggiungere l'agente indurente alla base elastomerica in rapporto 1:10. Mescolare il PDMS e l'agente indurente delicatamente e accuratamente utilizzando la spatola nella bilancia di plastica.
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Risultati
Le piattaforme di screening farmacologico basate su sferoidi per studiare gli effetti chemioterapici sono sempre più ricercate a causa dell'enfasi sulla modulazione del microambiente tumorale sull'incapsulamento dello sferoide in biomateriali che replicano il tessuto nativo. Qui abbiamo sviluppato un metodo per la preparazione di sferoidi tumorali multicellulari e il successivo incapsulamento e imaging in un idrogel 3D. Gli sferoidi vengono preparati in stampi a micropozzetti (Figura 3A,B), .......
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Discussione
I modelli di sferoidi tumorali multicellulari basati su idrogel sono sempre più sviluppati per far progredire le scoperte terapeutiche del cancro 11,13,29. Sono utili perché emulano i parametri chiave del microambiente tumorale in modo controllato e, nonostante la loro complessità, sono più semplici ed economici da usare rispetto ai modelli in vivo e molti sono compatibili con le tecnologie di screening ad alto rendimento. I bio.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato finanziato da fondi iniziali forniti alla Dott.ssa Silviya P Zustiak dalla Saint Louis University e da una sovvenzione iniziale del Centro Henry e Amelia Nasrallah per le Neuroscienze dell'Università di Saint Louis assegnata alla Dott.ssa Silviya P Zustiak.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 70% Etanolo | Fisher Scientific | LC22210-4 | |
| coniche da 15 mL | Piastre a | 24 | |
| Piastre di fissaggio ultra basse | Fisher Scientific | 07-200-602 | |
| Piastra di Petri da 35 mm | Amazon | 706011 | |
| Poli(glicole etilenico)-acrilato a 4 bracci (PEG-Ac a 4 bracci; 10 kDa) | Laysan Bio | ACRL-PEG-ACRL-10K-5g | |
| 50 mL Coniche | Fisher Scinetific | ||
| AggreWell 400 a 6 pozzetti | StemCell Technologies, Vancouver, Canada | 34421 | Micropozzetti piramidali quadrati |
| soluzione di risciacquo antiaderente | StemCell Technologies, Vancouver, Canada | Cat #: 07010 | |
| Acido aspartico-Arginina-Cisteina-Glicina-Valina-Prolina-Metionina-Serina-Metionina-Arginina-Glicina-Cisteina-Arginina- Acido aspartico (DRCG-VPMSMR-GCRD) peptide | Genic Bio, Shanghai, Cina | n/a | Sintesi personalizzata |
| Cappa chimica | KEWAUNEE | 99151 | |
| Matrice della membrana basale Corning Matrigel, senza LDEV | Corning | 356234 | Detergente per matrice a membrana basale |
| - Triton-X | Sigma Aldrich | T8787 | Tensioattivo non ionico |
| Dimetil solfossido (DMSO) | Fisher Scientific | BP231-100 | |
| Pipette monouso (1 mL, 2 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL, 50 mL) | Fisher Scinetific | 1 mL: 13-678-11B, 2mL: 05214038, 5mL(FALCON): 357529, 10mL: 13-678-11E, 25mL: 13-678-11, 50mL: 13-678-11F | |
| Siero fetale bovino | HyClone | SH30073-03 | |
| Soluzione di formaldeide al 37% | Sigma Aldrich | F1635 | |
| Lastre di vetro | Slumpys | GBS4100SFSL | |
| Pipette di trasferimento in vetro | Fisher Scinetific | 5 3/4": 1367820A, 9":136786B | |
| Glicona-Arginina-Cisteina-Acido aspartico-Arginina-Glicina-Acido aspartico-Serina (GRCD-RGDS) peptide | Genic Bio, Shanghai, Cina | n/a | Sintesi personalizzata |
| Bright-Line | 383684 | ||
| Soluzione idrofobica - Repel Silane | GE Healthcare Bio-Sciences | 17-1332-01 | |
| Incubatore | NUAIRE NU-8500 | ||
| Microscopio invertito (Axiovert 25) | Zeiss | ||
| Invitrogen DiOC16(3) (3,3'-Dioxadecyloxacarbocianina Perclorato) | Fisher Scientific | D1125 | |
| Leica Confocal SP8 | Leica Microsystems Inc. | ||
| Microscopio ottico e fluorescente (Axiovert 200M) | Zeiss | 3820005619 | |
| Micro provette per centrifuga | Fisher Scientific | 2 mL: 02681258 | |
| Software | microscopio Zeiss | AxioVision Rel. 4.8.2 | |
| Nestin Alexa Fluor 594 | Santa Cruz Biotechnology | sc-23927 | |
| Parafilm | PARAFILM | PM992 | |
| PBS (1x), pH 7,4 | HyClone | SH30256,01 | |
| Penicillina Streptomicina | MP Biomedicals | 1670046 | |
| Pipette Aid | Drummond Scientific Co. | P-76864 | |
| Puntali per pipette (1– 200 µ L, 101– 1000 µ L) | Fisher Scinetific | 2707509 | |
| Pipette di trasferimento monouso standard in plastica | Fisher Scientific | 13-711-9D | |
| Barche di pesatura in plastica (100 mL) | Amazon | mdo-azoc-1030 | |
| poli(glicole etilenico)-ditiolo (PEG-diSH; 3,4 kDa) | Laysan Bio | SH-PEG-SH-3400-5g | |
| Polidimehylsiloxane (PDMS) [Kit elastomero Slygard 182] | Adesivi Elsworth | 3097358-1004 | polidimetilsilossano |
| Quest | 92897 | ||
| Ioduro di propidio, 1 mg/mL di soln. | Fisher Scientific | ||
| RPMI-1640 Medium (1x) | HyClone | SH30027-02 | |
| Distanziatori in silicone - Foglio in silicone, 0,5 mm di spessore/13 cm x 18 cm | Grace Bio-Labs | JTR-S-0,5 | |
| SOX2 Alexa Fluor 488 | Santa Cruz Biotechnology | sc-365823 | |
| Cappa per coltura tissutale | NUAIRE | NU-425-600 | |
| Trietanolammina, ≥ 99,0% (GC) | Sigma Aldrich | 90279 | |
| U-87 MG cellule di glioblastoma umano | Collezione di colture di tipo americano | HTB-14 |
Riferimenti
- Hirschhaeuser, F., et al. Multicellular tumor spheroids: an underestimated tool is catching up again. Journal of Biotechnology. 148 (1), 3-15 (2010).
- Costa, E. C., de Melo-Diogo, D., Moreira, A. F., Carvalho, M. P., Correia, I. J.
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Ristampe e permessi
