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Summary

Questo articolo presenta un protocollo per la differenziazione diretta e l’analisi funzionale di cellule simili a cellule β. Descriviamo le condizioni e i passaggi di coltura ottimali per le cellule staminali pluripotenti umane prima di generare cellule pancreatiche produttrici di insulina. La differenziazione a sei stadi progredisce dalla formazione definitiva dell’endoderma alle cellule funzionali simili a cellule β che secernono insulina in risposta al glucosio.

Abstract

Le cellule staminali pluripotenti umane (hPSC) possono differenziarsi in qualsiasi tipo di cellula, rendendole un’eccellente fonte alternativa di cellule β pancreatiche umane. Le hPSC possono essere cellule staminali embrionali (hESC) derivate dalla blastocisti o cellule pluripotenti indotte (hiPSC) generate direttamente da cellule somatiche utilizzando un processo di riprogrammazione. Qui viene presentato un protocollo basato su video per delineare le condizioni ottimali di coltura e passaggio per le hPSC, prima della loro differenziazione e della successiva generazione di cellule pancreatiche produttrici di insulina. Questa metodologia segue il processo in sei fasi per la differenziazione diretta a β cellule, in cui le hPSC si differenziano in endoderma definitivo (DE), tubo intestinale primitivo, destino dell’intestino anteriore posteriore, progenitori pancreatici, progenitori endocrini pancreatici e, infine, cellule β pancreatiche. È interessante notare che questa metodologia di differenziazione impiega un periodo di 27 giorni per generare cellule β pancreatiche umane. Il potenziale della secrezione di insulina è stato valutato attraverso due esperimenti, che includevano l’immunocolorazione e la secrezione di insulina stimolata dal glucosio.

Introduction

Le cellule staminali pluripotenti umane (hPSC) hanno la capacità unica di differenziarsi in vari tipi di cellule, il che le rende una valida alternativa alle cellule β pancreatiche umane¹. Queste hPSC sono classificate in due tipi: cellule staminali embrionali (hESCs), derivate dalla blastocisti², e cellule pluripotenti indotte (hiPSCs), generate dalla riprogrammazione diretta delle cellule somatiche³. Lo sviluppo di tecniche per differenziare le hPSC in cellule β ha importanti implicazioni sia per la ricerca di base che per la pratica clinica ^1,4. Il diabete mellito è una malattia cronica che colpisce >400 milioni di persone in tutto il mondo e deriva dall’incapacità dell’organismo di regolare la glicemia a causa di un malfunzionamento o della perdita di cellule β pancreatiche⁵. La limitata disponibilità di cellule delle isole pancreatiche per il trapianto ha ostacolato lo sviluppo di terapie di sostituzione cellulare per il diabete 2,4,6,7. La capacità di generare cellule che secernono insulina sensibili al glucosio utilizzando hPSC funge da modello cellulare utile per studiare lo sviluppo e la funzione delle isole umane. Può anche essere utilizzato per testare potenziali candidati terapeutici per il trattamento del diabete in un ambiente controllato. Inoltre, le hPSC hanno il potenziale per produrre cellule delle isole pancreatiche geneticamente identiche al paziente, riducendo il rischio di rigetto immunitario dopo il trapianto ^2,4,7.

Negli ultimi anni, ci sono stati progressi significativi nel perfezionamento dei protocolli di coltura e differenziazione delle hPSC, con conseguente aumento dell’efficienza e della riproducibilità del processo di differenziazione verso la generazione di cellule β pancreatiche ^8,9.

Il seguente protocollo delinea le fasi essenziali della differenziazione diretta delle cellule β pancreatiche. Implica la regolazione di specifiche vie di segnalazione cellulare in punti temporali distinti. Si basa sul protocollo sviluppato da Sui L. et ^al.10 (2018) per la generazione di hPSC in cellule β pancreatiche. Il protocollo è stato adattato ai recenti aggiornamenti di Sui L. et ^al.11 (2021), poiché le ultime ricerche sottolineano l’importanza dell’utilizzo del trattamento con afidicolina (APH) per migliorare la differenziazione delle cellule β. L’attuale protocollo prevede l’aggiunta di APH al mezzo durante le fasi successive del processo. Inoltre, sono state apportate modifiche alla composizione del terreno durante le prime fasi di differenziazione rispetto al protocollo iniziale. Un cambiamento notevole è l’aggiunta del fattore di crescita dei cheratinociti (KGF) il giorno 6 e continuando fino al giorno 8. Il fattore di crescita dei cheratinociti (KGF) viene introdotto dal giorno 6 al giorno 8, che differisce leggermente dal protocollo iniziale¹⁰, in cui KGF non era incluso nel terreno di stadio 4.

Il primo ed essenziale passo nella generazione di cellule simili a cellule β è la differenziazione diretta delle hPSC nell’endoderma definitivo (DE), uno strato germinale primitivo che dà origine al rivestimento epiteliale di vari organi, incluso il pancreas. Dopo la formazione di DE, le cellule subiscono la differenziazione nel tubo intestinale primitivo, a cui segue la specificazione del destino dell’intestino anteriore posteriore. L’intestino anteriore posteriore si sviluppa quindi in cellule progenitrici pancreatiche, che hanno il potenziale per differenziarsi in tutti i tipi di cellule del pancreas, comprese le cellule endocrine ed esocrine. La fase successiva del processo coinvolge i progenitori endocrini pancreatici che danno origine alle cellule che secernono ormoni che si trovano nelle isole di Langerhans. Alla fine, il processo di differenziazione raggiunge la sua fase finale producendo cellule pancreatiche simili a cellule β pancreatiche^{completamente} funzionali ^9,10. È importante notare che questo processo è complesso e spesso richiede l’ottimizzazione delle condizioni di coltura, come fattori di crescita specifici e componenti della matrice extracellulare, per migliorare l’efficienza e la specificità del differenziamento ^9,10. Inoltre, la generazione di cellule β simili a cellule funzionali da hPSC in vitro è ancora una sfida importante. La ricerca in corso si concentra sul miglioramento dei protocolli di differenziamento e sul miglioramento della maturazione e della funzione delle cellule β risultanti⁹.

In questo protocollo, l’uso della dissociazione cellulare delicata durante la coltura e il passaggio delle hPSC è essenziale per mantenere la vitalità e la pluripotenza cellulare, migliorando significativamente l’efficienza del differenziamento in cellule β pancreatiche. Inoltre, ogni terreno specifico per stadio è stato meticolosamente ottimizzato seguendo il protocollo sviluppato da Sui L. et ^al.10 per promuovere un’elevata resa di cellule che secernono insulina in cluster che assomigliano molto all’isolotto umano.

Protocol

Prima di iniziare la differenziazione, si raccomanda di determinare il numero richiesto di organoidi simili a isole per scopi sperimentali. In una piastra a 6 pozzetti, un singolo pozzetto con una confluenza superiore all’80% è in genere costituito da 2-2,3 milioni di hPSC. Mentre una previsione accurata è difficile a causa delle variazioni nelle linee hPSC e nell’efficienza di differenziazione, una stima approssimativa è 1,5 volte il numero di pozzi iniziali. Una differenziazione diretta in modo efficace di solito produce da 1,6 a 2 milioni di cellule per pozzetto in piastre a sei pozzetti, comprendendo tutte le cellule all’interno dei cluster piuttosto che esclusivamente le cellule produttrici di insulina. Per un cluster di 50 μm, si può approssimare che contenga circa 10.000 cellule. La Tabella 1 fornisce un riepilogo della composizione del terreno utilizzato per ogni giorno/fase di differenziazione diretta sulla matrice e sul terreno di coltura delle cellule staminali, insieme al tampone di secrezione di insulina stimolato dal glucosio. 1. Differenziazione preventiva di cellule staminali pluripotenti umane passate in piastre a 6 pozzetti NOTA: L’appropriato passaggio di cellule staminali umane prima di differenziarsi in cellule simili a cellule β è un passo cruciale nello stabilire il processo sperimentale. Una diluizione errata del passaggio o un numero di celle di attacco errato possono compromettere l’efficienza e la fedeltà del differenziamento. Preparare il terreno di coltura delle cellule staminali, il rivestimento e le soluzioni di dissociazione (come specificato nella Tabella 1). 1-2 ore prima del passaggio, rivestire una piastra a sei pozzetti con una soluzione di rivestimento a freddo (1 mL per pozzetto) e incubare a 37 °C, 5% CO2 . Riscaldare un’aliquota di terreno di coltura di cellule staminali a temperatura ambiente (15 -25 °C) per 20 minuti. Aspirare il terreno di coltura staminale e aggiungere 1 mL di D-PBS privo di calcio/magnesio. Ripetere il passaggio 1.4. due volte.NOTA: D-PBS viene aggiunto per lavare le cellule e rimuovere il terreno e i composti precedenti. È importante notare che non è richiesto alcun periodo di tempo specifico per le fasi di lavaggio, poiché l’esposizione al D-PBS non danneggia le hPSC, prevenendo la rottura o il restringimento cellulare causato dall’osmosi. Aspirare il D-PBS, aggiungere 500 μL di soluzione di dissociazione per ogni pozzetto e lasciare riposare per 2-5 minuti a temperatura ambiente (15 – 25 °C). Mentre le cellule si dissociano, aspirare la soluzione di rivestimento della nuova piastra a 6 pozzetti e aggiungere 1-2 mL di D-PBS privo di calcio/magnesio a ciascun pozzetto. Controllare regolarmente il processo di dissociazione al microscopio invertito. Aspirare la soluzione di dissociazione quando l’80-90% delle cellule si è arrotondato ma è ancora aderente. Aggiungere 1 mL di terreno per cellule staminali contenente 10 μM di inibitore ROCK. Raccogliere le cellule dissociate in una provetta conica da 15 mL utilizzando puntali per pipette sterili filtrati da 1.000 μL e una pipetta P1000. Triturare lentamente la sospensione cellulare su e giù nella pipetta con un puntale filtrato per pipetta sterile da 1.000 μL per rompere le colonie, ma non superare le 10 volte. Aggiungere 1 mL del terreno di coltura contenente l’inibitore di ROCK per aiutare a staccare le hPSC rimanenti e trasferire la sospensione cellulare nella stessa provetta conica da 15 mL (1.10). Aspirare il D-PBS dalla piastra appena rivestita e aggiungere immediatamente la sospensione cellulare dalla provetta conica da 15 mL. Per garantire una crescita cellulare ottimale, seminare un intervallo di 2 x 105- 1 x 106 cellule vitali per pozzetto quando si utilizza una piastra a 6 pozzetti (da 1 su 10 a 1 su 50 spaccate).NOTA: Per il calcolo del volume, ogni pozzetto di una piastra a 6 pozzetti deve contenere 2 mL di terreno di coltura con cellule staminali con inibitore ROCK. Muovi rapidamente la piastra avanti e indietro e da un lato all’altro 5 – 10 volte. Posizionare la piastra a 37 °C, incubatrice al 5% di CO2 per 24 ore. Sostituire con terreno di coltura staminale fresco senza inibitore di ROCK il giorno successivo, e poi ogni 2 giorni fino a quando la confluenza delle hPSC non ha raggiunto l’80-95%. 2. Differenziazione diretta delle cellule β derivate da cellule staminali umane NOTA: Le hPSC possono essere utilizzate per il processo di differenziazione diretta in cellule β pancreatiche quando viene raggiunta una confluenza dell’80-95%. Giorno -1: Passaggio delle cellule Giorno -1 di differenziazione:1-2 ore prima del passaggio, rivestire una piastra a 6 pozzetti con una soluzione di rivestimento a freddo in un incubatore a 37 °C, 5% CO2 per 1 ora. Seguire i passaggi da 1.1 a 1.10 e procedere al conteggio delle celle. Caricare 10 μL della miscela cellulare, aggiungere un volume uguale di Trypan Blue e mescolare delicatamente. Calcola la concentrazione cellulare. Utilizzare 0,8 × 106 cellule/mL – 1,0 x 106 cellule/mL di terreno di coltura contenente 10 μM di inibitore ROCK per placcare la piastra rivestita a 6 pozzetti con 2 mL di terreno per pozzetto. Muovi rapidamente la piastra avanti e indietro, da un lato all’altro tre volte. Mettere la piastra in un’incubatrice a 37 °C, 5% di CO2 . Muovi rapidamente la piastra avanti e indietro e di nuovo da un lato all’altro 10 volte. Quindi incubare la piastra per 4 ore.NOTA: Assicurarsi che l’attacco massimo e la distribuzione uniforme delle cellule non disturbino le cellule spostando la piastra una volta posizionata nell’incubatrice. Aprire e chiudere l’incubatrice con molta attenzione. Posizionare il flacone di terreno basale per i giorni da 0 a 4 a 4 °C per scongelarlo durante la notte. Giorno 0NOTA: Le hPSC devono essere confluenti all’80 – 95%, non iniziare il processo di differenziazione all’endoderma definitivo sotto tale confluenza.Sul ghiaccio, scongelare sia il terreno basale per i giorni da 0 a 4 che gli integratori (vedere la tabella dei materiali). Preparare in due provette coniche solo il volume necessario da utilizzare il giorno 1 (2 mL per pozzetto di una piastra a 6 pozzetti) e, in una provetta separata, raddoppiare il volume per il giorno da 2,5 a 4 (2 x 2 mL per pozzetto di una piastra a 6 pozzetti). Conservare il giorno dal giorno 2.5 al giorno 4 medio a 4 °C. Scaldare un’aliquota del volume necessario del mezzo Giorno 1 e del mezzo di lavaggio 1 a bagnomaria a 37 °C per 5 minuti. Aspirare il terreno di trattamento delle cellule staminali e aggiungere 2 ml di terreno di lavaggio 1.NOTA: Il mezzo di lavaggio utilizzato nel protocollo è costituito dal terreno basale specifico per ogni giorno/fase, integrato con antibiotici all’1%. Le fasi di lavaggio del protocollo di differenziazione diretta prevedono solo l’aggiunta del mezzo di lavaggio designato (denominato “mezzo di lavaggio 1 o 2”, Tabella dei materiali) e la successiva aspirazione, seguendo la procedura descritta al punto 2.2.4. È importante ricordare che non esiste un periodo di tempo specifico indicato per queste fasi di lavaggio. Aspirare il terreno di lavaggio 1 e aggiungere immediatamente 2 ml del terreno del giorno 1 a lato del pozzetto. Incubare le cellule a 37 °C e 5% di CO2 per 24 ore. Giorno 1Preriscaldare un’aliquota del volume necessario di Giorni da 2,5 a 4 medio a bagnomaria a 37 °C per 5 minuti. Aspirare il terreno del giorno 1 e aggiungere immediatamente 2 ml del terreno del giorno da 2,5 a 4 a lato del pozzetto. Non lavare le celle. Riposizionare la piastra a 37 °C e 5% di CO2 per 36 ore. Giorni da 2.5 a 4Preriscaldare un’aliquota del volume rimanente del Day 2,5-4 medium a bagnomaria a 37 °C per 5 min. Aspirare il terreno e aggiungere immediatamente 2 ml di terreno appena preparato da Days 2.5 a 4 a lato del pozzetto. Riposizionare la piastra a 37 °C e 5% di CO2 per 36 ore. Giorno 4NOTA: In questa fase, l’espressione dei marcatori endodermici definitivi è al suo massimo e le cellule possono avviare la differenziazione primitiva del tubo intestinale.Preparare un’aliquota del volume necessario del terreno di trattamento per lo stadio intestinale primitivo del giorno 4 (2 mL per pozzetto di una piastra a sei pozzetti) e riscaldarlo a temperatura ambiente (15 °C -25 °C) per 20 min. Aspirare i giorni da 2,5 a 4 medium e aggiungere 2 mL di medium 1. Aspirare il mezzo di lavaggio 1 e aggiungere immediatamente 2 ml di stadio intestinale primitivo del giorno 4 sul lato del pozzetto. Riposizionare la piastra a 37 °C e 5% di CO2 per 48 ore. Giorni da 6 a 8NOTA: In questa fase, le cellule iniziano un’ulteriore differenziazione sul destino dell’intestino anteriore posteriore.Preparare il volume necessario di terreno di s. intestino anteriore posteriore dei giorni da 6 a 8 (2 mL per pozzetto di una piastra da 6 pozzetti) e riscaldare il terreno a temperatura ambiente (15 °C -25 °C) per 20 minuti. Aspirare il terreno del giorno 4 e aggiungere immediatamente 2 ml di terreno dell’intestino anteriore posteriore dei giorni da 6 a 8 a lato del pozzetto. Posizionare la piastra in un’incubatrice a 37 °C contenente il 5% di CO2 per 48 ore. Giorni da 8 a 12NOTA: Le cellule sono pronte per essere differenziate dai progenitori pancreatici.Preparare il volume necessario di terreno di stoccaggio dei progenitori pancreatici da 8 a 12 giorni (2 mL per pozzetto di una piastra da 6 pozzetti) e riscaldare il terreno a temperatura ambiente (15 °C -25 °C) per 20 minuti. Aspirare il terreno da 6 a 8 giorni e aggiungere immediatamente 2 ml di terreno dell’intestino anteriore posteriore dei giorni da 6 a 8 a lato del pozzetto. Porre la piastra in un’incubatrice a 37 °C contenente il 5% di CO2 per 48 ore. Giorno 12: Esecuzione del passaggio di clusteringNOTA: In questa fase, le cellule formano un monostrato denso e verranno trasferite alla coltura cellulare 3D per formare cluster. Questo passaggio è cruciale per la differenziazione per migliorare la somiglianza strutturale delle cellule simili a β con le isole umane native, ma migliora anche la loro somiglianza funzionale sia a livello cellulare che a livello di cluster11 (Figura 1).Trattare una piastra a 6 pozzetti contenente micropozzetti da 400 μm (come specificato nella tabella dei materiali: Human Stem Cell-Derived β-cells Directed Differentiation, Day 12) con 2 mL di soluzione di risciacquo antiaderente a temperatura ambiente (15 °C – 25 °C).NOTA: Il micropozzetto impedisce alle cellule di attaccarsi al fondo del pozzetto e facilita la formazione meccanica di cluster 3D. Piastra da centrifugare a 1.300 x g per 5 min. Verificare la presenza di eventuali bolle al microscopio invertito. Se non si osservano bolle, aspirare la soluzione di risciacquo antiaderente e aggiungere immediatamente 2 mL di mezzo di lavaggio 2 (Tabella dei materiali). Ripetere il passaggio 1.8.3. due volte. Preparare il volume necessario del terreno di coltura e riscaldarlo a temperatura ambiente (15 -25 °C) per 20 min. Assicurarsi che due pozzetti di una piastra a 6 pozzetti entrino in un pozzetto della piastra a 6 pozzetti da 400 μm con 4 mL del terreno di grappolo. Aspirare il terreno progenitore pancreatico e aggiungere tampone di dissociazione (0,5 mL per pozzetto). Incubare a temperatura ambiente (15 °C – 25 °C) per 2-5 min. Controllare regolarmente il processo di dissociazione al microscopio invertito e aspirare il tampone di dissociazione quando la maggior parte delle cellule si è arrotondata ma è ancora aderente. Aspirare il tampone di dissociazione e aggiungere immediatamente 1 mL di terreno di coltura a ciascun pozzetto. Dissociare le cellule pipettando delicatamente verso l’alto e verso il basso sei volte utilizzando una pipetta P1000 e puntali filtranti da 1.000 μL. Trasferire le cellule e la miscela di terreno di coltura in una provetta conica da 50 ml. Aggiungere 1 mL del terreno di raccolta per raccogliere tutte le cellule rimanenti. Aggiungere il terreno di coltura al volume totale necessario in modo che ogni pozzetto della piastra per micropozzetti contenga 4 mL di terreno di miscelazione/cellule. Aspirare il mezzo di lavaggio 2 dalla piastra a 6 pozzetti per micropozzetti e trasferire la sospensione cellulare. Incubare la piastra a 37 °C per 24 ore. Giorno 13: Manipolazione delle cellule dopo il clustering e cambio dei loro terreni dal giorno 13 in poi.NOTA: i cluster sono altamente sensibili e richiedono un’attenta manipolazione per garantirne l’integrità e la vitalità nei giorni successivi. Pertanto, è fondamentale monitorare attentamente i cluster durante il periodo post-clustering dopo il giorno 12. La valutazione e gli aggiustamenti regolari sono essenziali per promuovere risultati positivi nel processo sperimentale.Preparare il volume necessario del terreno del giorno 13 (2 ml per pozzetto di una piastra da 6 pozzetti) e in una provetta conica separata da 50 ml per il terreno progenitore endocrino pancreatico del giorno 15-20. Raccogliere lentamente i cluster dalla piastra a 6 pozzetti in una provetta conica da 50 mL utilizzando una pipetta p1000 e puntali filtrati da 1.000 μL. Aggiungere 1 mL di terreno del giorno 13 per raccogliere i cluster rimanenti e trasferire i cluster nella provetta. Lasciare che le cellule si solidifichino naturalmente per gravità sul fondo del tubo conico per 5 minuti. Aspirare quanto più surnatante possibile dalla provetta senza disturbare i cluster cellulari. I puntali delle pipette non devono toccare né aspirare i cluster, ma solo il surnatante. Aggiungere il volume necessario del terreno del giorno 13 in base a quanto segue: 1 pozzetto di micropozzetti La piastra a 6 pozzetti va in tre pozzetti di una piastra a 6 pozzetti a basso attacco (2 mL di terreno per pozzetto). Pipettare delicatamente verso l’alto e verso il basso, evitando di aspirare i cluster. Trasferire la sospensione su una piastra a 6 pozzetti a bassissima aderenza. Muovi rapidamente la piastra avanti e indietro, da un lato all’altro sei volte. Incubare la piastra a 37 °C per 48 ore. Eseguire le modifiche del fluido in tutte le fasi successive fino alla fine della differenziazione come descritto in questa sezione 2.9. Giorni da 15 a 20Passare al terreno di coltura dello stadio di progenitore endocrino pancreatico ogni 48 ore fino al giorno 21 di differenziazione raccogliendo la sospensione cellulare in una provetta conica da 50 mL e seguendo i passaggi da 2.9.4 a 2.9.10 per il giorno 13. Giorni da 21 a 27NOTA: In questa fase, i cluster si differenziano in cellule β pancreatiche.Preparare il terreno pancreatico per lo stadio β cellulare. Cambiare il mezzo a giorni alterni come descritto per i giorni da 15 a 21.NOTA: Dopo il giorno 25, gli organoidi simili a isole possono essere sottoposti ad analisi per confermare che sono completamente funzionali. 3. Colorazione dei cluster di cellule β pancreatiche NOTA: Eseguire questo passaggio per studiare la valutazione funzionale dei cluster dopo la differenziazione Raccogliere da cinque a dieci cluster in una provetta per microcentrifuga da 1,5 mL al termine della differenziazione. Fissare i cluster di cellule con 200 μL di PFA al 4% per 15 minuti a temperatura ambiente. Aggiungere 1 mL di PBS ai cluster e rimuovere il PBS con un puntale per pipette da 1.000 μL senza disturbare i cluster. Aggiungere 200 μL di saccarosio al 30% ai grappoli e incubare per una notte a 4 °C. Trasferire i grappoli in un criostampo, rimuovere il saccarosio in eccesso, aggiungere una goccia di terreno O.C.T. e mescolare i grappoli con il terreno OCT. Congelare il criostampo su ghiaccio secco e conservare a -80 °C. Tagliare sezioni di 5 μm dal blocco congelato su vetrini da microscopio utilizzando un microtomo/criostato. Conservare i vetrini a -80 °C in congelatore fino alla colorazione. Il giorno della colorazione, estrarre i vetrini dal congelatore a -80 °C. Rimuovere con cautela il ghiaccio intorno alle sezioni del criostampo. Cluster di cellule circolari su vetrini con una penna idrofobica. Reidratare i vetrini in un barattolo colorante contenente PBS per 15 minuti. Aggiungere metanolo freddo nel barattolo per colorare i vetrini e posizionare il barattolo con i vetrini a -20 °C per 10 min. Immergere i vetrini in un barattolo di PBS. Ripetere il passaggio 3.14 tre volte.NOTA: Utilizzare questo metodo per tutte le seguenti fasi di lavaggio. Rimuovere il PBS dai vetrini e coprire immediatamente con 100 μL di soluzione bloccante con il 2-5% di BSA in PBS-T. Aggiungere la soluzione bloccante a ciascun vetrino e coprire con pellicola di paraffina. Incubare per 1 ora a temperatura ambiente (15 -25 °C). Diluire gli anticorpi primari nella soluzione bloccante utilizzando i rapporti forniti nella sezione Reagenti e soluzioni. Rimuovere la soluzione bloccante dai vetrini. Aggiungere immediatamente gli anticorpi diluiti e coprire i vetrini con parafilm per evitare che il vetrino si asciughi. Incubare una notte a 4 °C. Il giorno seguente lavare i vetrini 3 – 5 volte con PBS-T. Preparare gli anticorpi secondari diluiti e la colorazione del DNA. Rimuovere il PBS-T in eccesso dai vetrini. Aggiungere gli anticorpi secondari diluiti e la colorazione del DNA. Incubare per 45 minuti a temperatura ambiente (15 -25 °C). Lavare i vetrini 3 – 5 volte con PBS-T. Rimuovere l’eventuale liquido dai vetrini. Aggiungere una goccia di terreno di montaggio istologico a ciascuna sezione. Coprire il vetrino con una copertura di vetro. Scatta foto di vetrini colorati utilizzando un microscopio a fluorescenza. 4. GSIS (test di secrezione di insulina stimolata dal glucosio) Preparare tre diverse soluzioni: soluzione KREBS a basso contenuto di glucosio, soluzione KREBS ad alto contenuto di glucosio e soluzione KREBS a basso contenuto di glucosio con KCl. Riscaldare tutte le soluzioni a bagnomaria a 37 °C. Selezionare con cura circa 10-15 cluster di dimensioni simili utilizzando un puntale per pipette da 1000 μL e trasferirli in una provetta da 1,5 mL insieme a una piccola quantità di terreno differenziato per evitare che i cluster si secchino.NOTA: I cluster devono essere visibili ad occhio nudo, ma in caso contrario, posizionare la piastra contenente i cluster differenziati sotto un microscopio invertito per selezionare i cluster e trasferirli in una provetta da 1,5 mL. Posizionare la provetta con i grappoli e il terreno su una griglia per provette e attendere che le provette affondino sul fondo della provetta. Aspirare lentamente il surnatante utilizzando una pipetta da 200 μL e aggiungere 200 μL di soluzione KREBS a basso contenuto di glucosio. Incubare le isole nella soluzione a basso contenuto di glucosio per 1 ora a 37 °C.NOTA: Per garantire una valutazione accurata del numero di cluster e della coerenza negli esperimenti, si consiglia di verificare la presenza di tutti i cluster nella soluzione durante il trasferimento, poiché tendono ad aderire alla provetta. Rimuovere la provetta dall’incubatore e aspirare lentamente 200 μL di soluzione KREBS senza aspirare alcun cluster. Aggiungere 200 μL di soluzione KREBS a basso contenuto di glucosio e incubare per 30 minuti a 37 °C. Aspirare il volume di 200 μL di soluzione KREBS a basso contenuto di glucosio in una provetta da 500 μL e conservarla immediatamente a -80 °C per le misurazioni dell’insulina. Ripetere l’operazione per trattamenti separati. Per lavare i cluster, aggiungere 200 μL di soluzione di KREBS senza glucosio nella provetta contenente i cluster. Lasciare che i grappoli si depositino sul fondo della provetta e rimuovere con cautela il surnatante senza disturbare i grappoli. Aggiungere 200 μL di soluzione KREBS ad alto contenuto di glucosio e incubare per 30 minuti a 37 °C. Aspirare 200 μL di KREBS ad alto contenuto di glucosio in una provetta da 500 μL e conservarla immediatamente a -80 °C per la misurazione dell’insulina. Ripetere l’operazione per trattamenti separati. Per lavare i cluster, aggiungere 200 μL di soluzione di KREBS senza glucosio nella provetta contenente i cluster. Lasciare che i grappoli si depositino sul fondo della provetta e rimuovere con cautela il surnatante senza disturbare i grappoli. Aggiungere 200 μL di soluzione di KCl KREBS e ripetere per trattamenti separati. Incubare per 30 minuti a 37 °C. Aspirare 200 μL di soluzione di KCl KREBS in una provetta da 500 μL e conservarla immediatamente a -80 °C per le misurazioni dell’insulina. Ripetere l’operazione per altri trattamenti. Aggiungere 50 μL di acqua ultrapura e procedere alla misurazione del contenuto totale di insulina. Aggiungere 150 μL di soluzione di etanolo acido alla provetta con isole e acqua ultrapura. Conservare i campioni a 4 °C per una notte (12 – 15 h). Il giorno seguente, vorticare ogni campione. Eseguire la sonicazione con un sonicatore elettrico impostato al 20% di potenza per 1 s per garantire la lisi completa del tessuto dell’isolotto.NOTA: Ripetere il passaggio 4.21 fino a quando non sono visibili cluster rimanenti. Centrifugare tutti i campioni a 10.000 × g per 10 minuti e conservare il surnatante. Misurare la concentrazione di DNA utilizzando uno spettrofotometro a nanogocce, che può quindi essere utilizzato per normalizzare le misurazioni dell’insulina.

Representative Results

Il protocollo descritto in questo articolo offre un approccio altamente efficiente per differenziare le cellule β-like dalle hPSC10. Questo processo utilizza un sistema di coltura 2D facilmente scalabile, che ne consente l’uso in vari contesti sperimentali, come la differenziazione dell’apprendimento, progetti e laboratori più piccoli e test pilota per valutare il potenziale di una linea di iPSC per la differenziazione. È essenziale caratterizzare le proprietà funzi…

Discussion

Il successo della differenziazione delle hPSC in cellule β pancreatiche dipende dall’ottimizzazione di tutti gli aspetti della coltura e del passaggio di routine delle hPSC selezionate. Ciò include la garanzia che la linea cellulare abbia un cariotipo normale, sia negativa per l’infezione da micoplasma e sia priva di genomi plasmidici o vettori virali. Inoltre, quando si utilizzano le hiPSC, è importante evitare di utilizzare i primi passaggi, che sono ancora in fase di riprogrammazione, per esperimenti pilota. Questi…

Materials

1.5 mL TubeOne Microcentrifuge Tube	Starlabs	S1615-5500
6-well Cell culture plate	ThermoFisher Scientific	165218
AggreWell 400 6-well plate	STEMCELL Technologies	34425
Anti-Glucagon	Sigma-aldrich	G2654-100UL
Anti-Insulin	Dako	A0564
Anti-NKX6.1	Novus Biologicals	NBP1-49672SS
Anti-PDX1	Abcam	ab84987
Aphidicolin	Sigma-Aldrich	A4487
B-27 Supplement (50X), serum free	Thermo Fisher Scientific	17504044
Bovine Serum Albumin, fatty acid free	Sigma-Aldrich	A3803-100G
Calcium chloride dihydrate	Sigma-Aldrich	C3306
Calcium/Magnesium free D-PBS	Thermo Fisher Scientific	14190144
Cyclopamine-KAAD	Calbiochem	239804
D-(+)-Glucose,BioXtra	Sigma-Aldrich	G7528
Disodium hydrogen phosphate, anhydrous	Sigma-Aldrich	94046-100ML-
DMEM plus GlutaMAX	Thermo Fisher Scientific	10566016	For Washing Medium 2: DMEM plus GlutaMAX 1% PS.
DMEM/F-12 (Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12)	Thermo Fisher Scientific	10565-018
Epredi SuperFrost Plus Adhesion slides	Thermo Fisher Scientific	10149870
Ethanol	VWR	20821.33
Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher Scientific	10270098
Gamma-Secretase Inhibitor XX	Thermo Fisher Scientific	J64904
Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement	Thermo Fisher Scientific	A1413302	Geltrex 1:1 into cold DMEM/F-12 medium to provide a final dilution of 1:100.
Goat Anti-Guinea pig, Alexa Fluor 555	Thermo Fisher Scientific	A-21435
Goat Anti-Guinea pig, Alexa Fluor 647	Abcam	ab150187
Goat anti-Mouse Secondary Antibody, Alexa Fluor 633	Thermo Fisher Scientific	A-21052
Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 568	Thermo Fisher Scientific	A-11011
Heparin	Sigma-Aldrich	H3149
HEPES buffer	Sigma-Aldrich	H3375-500G
Hoechst 33342, Trihydrochloride	Thermo Fisher Scientific	H1399
Human FGF-7 (KGF) Recombinant Protein	Thermo Fisher Scientific	PHG0094
Hydrogen chloride	Sigma-Aldrich	295426
ImmEdge Hydrophobic Barrier PAP Pen	Agar Scientific	AGG4582
LDN193189	Sigma-Aldrich	SML0559-5MG
Magnesium chloride hexahydrate	Sigma-Aldrich	M9272-500G
OCT Compound 118 mL	Agar Scientific	AGR1180
PBS Tablets, Phosphate Buffered Saline, Fisher BioReagents	Thermo Fisher Scientific	7647-14-5
Penicillin-Streptomycin (PS)	Thermo Fisher Scientific,	15070-063
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	7447-40-7
Recombinant Human EGF Protein	R&D Systems	236-EG-200
Rectangular cover glasses, 22×50 mm	VWR	631-0137
RepSox (Hydrochloride)	STEMCELL Technologies	72394
RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement	Thermo Fisher Scientific	61870036	For Washing Medium 1: RPMI 1640 plus GlutaMAX 1% PS.
Shandon Immu-mount	Thermo Fisher Scientific	9990402
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S6014-500G
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S3014
Sodium dihydrogen phosphate anhydrous	Sigma-Aldrich	7558-80-7
STEMdiff Endoderm	STEMCELL Technologies	5110
StemFlex Medium	Thermo Fisher Scientific	A3349401	Thaw the StemFlex Supplement overnight at 4°C, transfer any residual liquid of the supplement bottle to StemFlex Basal Medium.
Stemolecule All-Trans Retinoic Acid	Reprocell	04-0021
Thyroid Tormone 3 (T3)	Sigma-Aldrich	T6397
Trypan Blue Solution, 0.4%	ThermoFisher Scientific	15250061
TrypL Express Enzyme (1X)	Thermo Fisher Scientific	12604013
TWEEN 20	Sigma-Aldrich	P2287-500ML
Ultra-Low Adherent Plate for Suspension Culture	Thermo Fisher Scientific	38071
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water	Thermo Fisher Scientific	10977015
Y-27632 (Dihydrochloride)	STEMCELL Technologies	72302
Zinc Sulfate	Sigma-Aldrich	Z4750