Il presente protocollo descrive un metodo di ibridazione in situ a fluorescenza dell'RNA per localizzare gli lncRNA in cellule di osteosarcoma umano.
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Articolo metodologico
Ibridazione in situ a fluorescenza dell'RNA per la localizzazione di RNA non codificante lungo in cellule di osteosarcoma umano
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Sono stati studiati gli importanti ruoli degli RNA lunghi non codificanti (lncRNA) nel cancro, come la regolazione della proliferazione, la transizione epiteliale-mesenchimale (EMT), la migrazione, l'infiltrazione e l'autofagia delle cellule tumorali. Il rilevamento della localizzazione degli lncRNA nelle cellule può fornire informazioni sulle loro funzioni. Progettando la sequenza della catena antisenso specifica per lncRNA seguita da marcatura con coloranti fluorescenti, è possibile applicare l'ibridazione in situ fluorescente dell'RNA (FISH) per rilevare la localizzazione cellulare degli lncRNA. Insieme allo sviluppo della microscopia, le tecniche RNA FISH ora consentono anche la visualizzazione degli lncRNA scarsamente espressi. Questo metodo non solo è in grado di rilevare la localizzazione dei soli lncRNA, ma anche di rilevare la colocalizzazione di altri RNA, DNA o proteine utilizzando l'immunofluorescenza bicolore o multicolore. Qui, abbiamo incluso la procedura operativa sperimentale dettagliata e le precauzioni di RNA FISH utilizzando il gene ospite 6 (SNHG6) dell'RNA nucleolare piccolo lncRNA in cellule di osteosarcoma umano (143B) come esempio, per fornire un riferimento per i ricercatori che desiderano eseguire esperimenti di RNA FISH, in particolare lncRNA FISH.
Introduzione
La nostra comprensione del genoma umano è stata notevolmente ampliata dai recenti progressi nella tecnologia dell'intero genoma. Circa il 93% del genoma umano può essere trascritto in RNA, ma solo il 2% degli RNA può essere tradotto in proteine; il restante 98% degli RNA che non hanno funzione di traduzione delle proteine sono chiamati RNA non codificanti (ncRNA)1. Come classe di RNA non codificanti (ncRNA), gli ncRNA lunghi (lncRNA), contenenti oltre 200 nucleotidi2, hanno attirato una crescente attenzione a causa del loro coinvolgimento in molti processi fisiologici e patologici delle cellule, come il differenziamento,....
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Protocollo
Vedere la Tabella dei materiali per i dettagli di tutti i materiali, i reagenti e gli strumenti utilizzati in questo protocollo. La Figura 1 mostra il protocollo generale per RNA FISH; La Tabella 1 contiene la composizione di tutte le soluzioni e la Tabella 2 contiene le sequenze di primer utilizzate in questo protocollo.
1. Preparazione della sonda
- Identificare e acquisire la sequenza FASTA di un lncRNA target di interesse, ad esempio, da GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/). Seguendo le indicazioni sul sito web, progettar....
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Risultati
Sono mostrate immagini rappresentative di SNHG6 FISH in cellule di osteosarcoma umano (Figura 2). Il controllo negativo viene trattato con la sonda Ctrl negativa; il controllo positivo viene trattato con la sonda U6 20. La sonda SNHG6 e la sonda U6 sono etichettate con Cy3, che emette fluorescenza rossa. Il DAPI è un colorante che colora il DNA, che emette fluorescenza blu. Questo risultato mostra che SNHG6 è localizzato principalmente nel citoplasma e questa informaz.......
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Discussione
Questo protocollo RNA FISH non solo è in grado di rilevare la localizzazione degli lncRNA nelle cellule, ma anche di rilevare la colocalizzazione di altri RNA, DNA o proteine nelle cellule, che possono essere utilizzati anche per rilevare la posizione degli lncRNA nei tessuti inclusi in paraffina. Tuttavia, il protocollo specifico in questi casi è diverso perché i tessuti inclusi in paraffina devono essere decerati21. Questa procedura sperimentale può essere applicata in piastre da 48 o 96 pozzett.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Ringraziamenti
Questo lavoro è supportato da sovvenzioni provenienti da (1) il National Key R&D Program of China (2020YFE0201600); (2) la National Nature Science Foundation (81973877 e 82174408); (3) Centro di innovazione collaborativa di Shanghai per la trasformazione industriale della preparazione alla MTC ospedaliera; (4) Progetti di ricerca nell'ambito del budget dell'Università di Medicina Tradizionale Cinese di Shanghai (2021LK047).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Contatore automatico di cellule | Shanghai Simo Biological Technology Co., Ltd | IC1000 | Conteggio delle cellule |
| Piastra per coltura cellulare-12 | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 3513, corning | Posizionare i vetrini coprioggetti nella piastra |
| Linea cellulare (143B) | Banca cellulare dell'Accademia cinese delle scienze | CRL-8303 | linea cellulare per cancro dell'osteosarcoma |
| Provetta da centrifuga (15 mL, 50 mL) | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 430790, Centrifuga Corning | le cellule |
| Vetrini coprioggetti | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | abs7026 | Le cellule vengono seminate sui vetrini coprioggetti |
| Cy3 label-SNHG6 Sonda DNA | Shanghai GenePharma Co., Ltd | A10005 | Rileva la posizione SNHG6 |
| DMEM media | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | LM-E1141 | Incubatore |
| a bagno secco per colture cellulariFornitore verificato - Haimen Kylin-Bell Lab Instruments Co., Ltd. | DKT200-2 | Incubazione a diverse alte temperature | |
| Etanolo 100% | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10009218 | disidratazione |
| Microscopio a fluorescenza | Shanghai Waihai Biotechnology Co., LTD | Olympus BX43 dotato di una fotocamera di Olympus U-TV0.5XC-3 (SN:5J01719),olympus | Observation and positioning |
| Incubator | Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., LTD | DHP-9051 | I campioni sono stati incubati a 37 ° C. |
| Supporto di montaggio | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | E675004 | Fissare i vetrini coprioggetti all'agitatore per vetrini |
| Haimen Kylin-Bell Lab Instruments Co., Ltd. | TS-8S | Campione di lavaggio | |
| Vetrino | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 188105 | I vetrini coprioggetti vengono posizionati sul vetrino |
| Triton X-100 | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A600198 | Membrana permeabile e membrana nucleare |
| Tripsina (0,25%) | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 25200056, Gibco | trattamento con tripsina delle cellule |
| Tween-20 | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A600560 | detersivo |
Riferimenti
- Djebali, S., et al. Landscape of transcription in human cells. Nature. 489 (7414), 101-108 (2012).
- Li, C. H., Chen, Y. Insight into the role of long noncoding RNA in cancer development and progression. International Review of Cell and Molecular B....
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Ristampe e permessi
