Articolo metodologico

Valutazione rapida della citotossicità in vitro del recettore dell'antigene chimerico che esprime Jurkat mediante imaging fluorescente

DOI:

10.3791/65560

⸱

27 ottobre 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Radiation Oncology, University of Kansas Cancer Center, 2Department of Cancer Biology, University of Kansas Cancer Center, 3BioEngineering Program, University of Kansas, 4Department of Pathology and Laboratory Medicine, University of Kansas Medical Center, 5University of Kansas Cancer Center, 6Kansas Institute for Precision Medicine, University of Kansas Medical Center

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Un protocollo per valutare l'uccisione quantitativa delle cellule tumorali da parte delle cellule Jurkat che esprimono il recettore dell'antigene chimerico (CAR) mirato all'antigene tumorale singolo. Questo protocollo può essere utilizzato come piattaforma di screening per una rapida ottimizzazione dei costrutti di cerniera CAR prima della conferma nelle cellule T derivate dal sangue periferico.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le cellule T del recettore chimerico dell'antigene (CAR) sono all'avanguardia in oncologia. Una CAR è costituita da un dominio di targeting (di solito un frammento variabile a catena singola, scFv), con un linker intra-catena di accompagnamento, seguito da un dominio cerniera, transmembrana e costimolatorio. La modifica del linker intra-catena e del dominio della cerniera può avere un effetto significativo sull'uccisione mediata da CAR. Considerando le molte opzioni diverse per ogni parte di un costrutto CAR, esiste un gran numero di permutazioni. La produzione di celle CAR-T è un processo lungo e costoso e la realizzazione e il collaudo di molti costrutti richiede un notevole investimento in termini di tempo e materiali. Questo protocollo descrive una piattaforma per valutare rapidamente i costrutti CAR ottimizzati per cerniera nelle cellule Jurkat (CAR-J). Le cellule Jurkat sono una linea di cellule T immortalizzate con un elevato assorbimento di lentivirus, che consente un'efficiente trasduzione delle CAR. Qui, presentiamo una piattaforma per valutare rapidamente CAR-J utilizzando un imager fluorescente, seguito dalla conferma della citolisi nelle cellule T derivate da PBMC.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La terapia cellulare CAR-T si è dimostrata molto promettente nelle neoplasie ematologiche, come evidenziato dai 6 prodotti CAR-T approvati dalla FDA dal 2017, come riportato dal National Cancer Institute1. Ci sono numerose cellule CAR-T negli studi clinici per colpire i tumori solidi. La progettazione di nuovi bersagli CAR e l'ottimizzazione del costrutto CAR sono fondamentali per l'efficacia di una cellula CAR-T. La scelta del costrutto CAR ideale per ogni applicazione è essenziale per un targeting accurato degli antigeni associati al tumore (TAA), evitando al contempo bassi livelli di espressione di TAA nei tessuti normali2<....

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Protocollo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NOTA: Tutto il lavoro di coltura cellulare viene eseguito in una cabina di biosicurezza con camice da laboratorio, guanti e seguendo le tecniche asettiche standard.

1. Generazione di Jurkats che esprimono CAR (CAR-J)

  1. Acquista le celle Jurkat, clona E6-1 da ATCC. Scongelare 1 x 106 cellule in un pallone T-75 e coltivarle in un pallone T-75. Mantenerli in sospensione a 0,6 x 106 cellule per mL utilizzando terreni di trattamento Roswell Park Memorial Institute (RPMI) integrati con FBS al 10% in un incubatore a 37 °C con il 5% di CO2 .
  2. Piastra 1 x 105 cellule Jurka....

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Risultati

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

È stato valutato un intervallo di rapporto E:T compreso tra 1:8 e 8:1 per CAR-J1 a 72 ore, che ha come target l'EGFR sulle cellule TNBC MDA-MB-231. Le cellule Jurkat sono state trasdotte con lentivirus CAR con polibrene per generare cellule CAR-J come descritto nella fase 2. La citotossicità di CAR-J1 è aumentata significativamente con un rapporto E:T più elevato senza alcuna differenza nell'uccisione con un rapporto 1:8 (Figura 1). Più del 50% delle uccisioni è stato osservato a 4:1 E:T in .......

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Qui abbiamo proposto un metodo rapido per valutare in modo efficiente l'attività citolitica target-specifica indotta dall'espressione di CAR nelle cellule Jurkat. Tutti i costrutti CAR hanno lo stesso scFv ma diversi domini cerniera e transmembrana che hanno dimostrato di influenzare la potenza delle cellule CAR-T13. Un'ulteriore valutazione dell'uccisione non specifica da parte di queste CAR-J è stata effettuata coltivandole con cellule knock out dell'antigene (KO). Ciò dimostra che l'uccisione è.......

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MDA-MB-231 è stato un gentile regalo del Dr. Shane Stecklein. Gli autori riconoscono il finanziamento da parte dell'Università del Kansas Cancer Center per condurre questa ricerca.

....

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Provetta conica da 15 mL (sterile)Midwest Scientific#C15BQualsiasi provetta
conica da 50 mL (sterile)Thermo Scientific339652Qualsiasi simile funzionerà
Piastra a 96 pozzetti Black/ClearFalcon353219Celligo ha un elenco di piastre compatibili
Celigo 4 Channel Imaging CytomenterNexcelcom Bioscience200-BFFL-5CQualsiasi simile funzionerà
Celigo SoftwareNexcelcom BioscienceVersione 5.3.0.0Qualsiasi simile funzionerà
Incubatore per colture cellulariThermo ScientificHeraCell 160iQualsiasi simile funzionerà
Boccette trattate per colture cellulari (T75, varie dimensioni, sterili)TPP90076Qualsiasi simile funzionerà
CFSETonbo 13-0850-U500Qualsiasi simile funzionerà
Cytek Muse Cell AnalyzerCytek0500-3115Qualsiasi simile funzionerà
DMEMGibco11995-040Qualsiasi simile funzionerà
FBSGemini bio-products900-108Qualsiasi simile funzionerà
Citometro a flussoCytek, BD, eccAurora, LSR II, eccQualsiasi simile funzionerà
FlowJo SortwareBecton Dickinson & Azienda Versione 10.7.1Qualsiasi simile funzionerà
Fluorobrite DMEMGibcoA18967-01Qualsiasi simile funzionerà
GraphPad SoftwareGraphPadVersione 9.3.1 (471)Qualsiasi simile funzionerà
Multichanel PipetteThermo ScientificFinnpipette F2Qualsiasi simile funzionerà
PBSGibco10010-031Qualsiasi simile funzionerà
PenStrepGibco15070-063Qualsiasi simile funzionerà
Puntali per pipette (sterili, filtrati, 1 mL, varie dimensioni)Pr1maPR-1250RK-FL, eccQualsiasi simile funzionerà
Pipettatori Thermo ScientificFinnpipette F2Qualsiasi simile funzionerà
Propidium IodideInvitrogenP1304MPQualsiasi simile funzionerà
RPMICorning10-041-cvQualsiasi simile funzionerà
Pipette sierologiche AidDrummond Scientific4-000-105Qualsiasi simile funzionerà
Pipette sierologiche (sterili, varie dimensioni)Pr1maPR-SERO-25, eccQualsiasi simile funzionerà
Piruvato di sodioCorning25-000-CIQualsiasi simile funzionerà
Serbatoi steriliMidwest ScientificRESE-2000Qualsiasi simile funzionerà
Centrifuga da tavoloEppendorf5810RQualsiasi simile funzionerà

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mitra, A. From bench to bedside: the history and progress of CAR T cell therapy. Front Immunol. 14, 1188049(2023).
  2. Labanieh, L., Mackall, C. L. CAR immune cells: design principles, resistance and the next generation. Nature. 614, 635-648 (2023).<....

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Ristampe e permessi

Richiedi il permesso di riutilizzare il testo o le figure di questo articolo JoVE

Richiedi permesso

Tag

Cellule CAR Tcellule Jurkatscreening ad alta produttivittargeting di EGFRmodifica del dominio hingecellule T derivate da PBMCpiastra a 96 pozzetticolorazione con ioduro di propidio

Articoli correlati