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Articolo metodologico

Screening della modificazione degli istoni mediante cromatografia liquida, spettrometria di mobilità ionica intrappolata e spettrometria di massa a tempo di volo

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DOI:

10.3791/65589

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12 gennaio 2024

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1Department of Chemistry and Biochemistry, Florida International University, 2Bruker Daltonics Inc., 3Department of Biochemistry and Molecular Biophysics, Washington University School of Medicine, 4Biomolecular Sciences Institute, Florida International University

In questo articolo

Sommario

Un flusso di lavoro analitico basato sulla cromatografia liquida, sulla spettrometria di mobilità ionica intrappolata e sulla spettrometria di massa a tempo di volo (LC-TIMS-TOF MS/MS) per un'analisi "bottom-up" ad alta affidabilità e altamente riproducibile delle modificazioni istoniche e l'identificazione in base ai parametri principali (tempo di ritenzione [RT], sezione d'urto di collisione [CCS] e rapporto massa-carica [m/z] accurato).

Abstract

Le proteine istoniche sono molto abbondanti e conservate tra gli eucarioti e svolgono un ruolo importante nella regolazione genica come risultato di strutture note come modificazioni post-traduzionali (PTM). Identificare la posizione e la natura di ogni PTM o pattern di PTM in riferimento a fattori esterni o genetici consente di correlare statisticamente queste informazioni con risposte biologiche come la trascrizione, la replicazione o la riparazione del DNA. Nel presente lavoro, viene descritto un protocollo analitico ad alto rendimento per la rilevazione di PTM istonici da campioni biologici. L'uso della cromatografia liquida complementare, della spettrometria di mobilità ionica intrappolata e della spettrometria di massa a tempo di volo (LC-TIMS-ToF MS/MS) consente la separazione e l'assegnazione PTM delle modifiche biologicamente più rilevanti in un'unica analisi. L'approccio descritto sfrutta i recenti sviluppi nell'acquisizione di dati dipendenti (DDA) utilizzando l'accumulo parallelo nella trappola della mobilità, seguito dalla frammentazione sequenziale e dalla dissociazione indotta dalla collisione. I PTM istonici vengono assegnati con sicurezza in base al tempo di ritenzione, alla mobilità e al modello di frammentazione.

Introduzione

Nelle cellule eucariotiche, il DNA è impacchettato come cromatina in unità funzionali chiamate nucleosomi. Queste unità sono composte da un ottamero di quattro istoni centrali (due ciascuno di H2A, H2B, H3 e H4)1,2,3,4. Gli istoni sono tra le proteine più abbondanti e altamente conservate negli eucarioti, che sono in gran parte responsabili della regolazione genica5. Le modificazioni post-traduzionali degli istoni (PTM) svolgono un ruolo importante nella regolazione della dinamica della cromatina e nella gestione di vari processi biologici come la trascrizione, la replicazione e la riparazione del DNA6. I PTM si verificano principalmente sulla superficie accessibile delle regioni N-terminali degli istoni che sono in contatto con il DNA 3,7. Tuttavia, le modificazioni della coda e del core influenzano la struttura della cromatina, alterando le interazioni internucleosomiche e reclutando proteine specifiche 3,8.

Una sfida attuale durante la proteomica basata sulla cromatografia liquida-spettrometria di massa (LC-MS) è la potenziale co-eluizione degli analiti di interesse. Nel caso di analisi data-dependent (DDA), ciò si traduce nella potenziale perdita di diversi ioni precursori durante il processo di acquisizione MS/MS9. Gli strumenti a tempo di volo (ToF) acquisiscono spettri ad altissima frequenza 9,10 (fino a decine di kHz)11; questo li rende in grado di scansionare rapidamente gli ioni precursori totali all'interno di un campione complesso (MS1), promettendo così una sensibilità ottimale e velocità di sequenziamento MS/MS (fino a 100 Hz)9 e rendendoli ideali per l'analisi di campioni biologici10. Ciononostante, la sensibilità disponibile a queste elevate velocità di scansione è limitata dalla velocità MS/MS9. Per mitigare queste limitazioni è stata utilizzata l'aggiunta della spettrometria di mobilità ionica intrappolata (TIMS) in combinazione con uno spettrometro di massa a tempo di volo (qToF) a quadrupolo ortogonale. In TIMS, tutti gli ioni precursori sono accumulati in tandem ed eluiti in funzione della loro mobilità, piuttosto che selezionare singole masse precursori con un quadrupolo9. La frammentazione seriale ad accumulo parallela (PASEF) consente centinaia di eventi MS/MS al secondo senza alcuna perdita di sensibilità9.

L'obiettivo principale di questo lavoro è stato quello di mostrare i recenti sviluppi della DDA utilizzando l'accumulo parallelo nella trappola della mobilità seguito dalla frammentazione sequenziale e dalla dissociazione indotta da collisione (CID). I PTM istonici sono stati assegnati con sicurezza in base ai loro tempi di ritenzione (RT), mobilità e modelli di frammentazione.

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Protocollo

NOTA: I campioni di istoni sono stati estratti utilizzando un metodo adattato da Bhanu et al. (2020)12.

1. Preparazione del campione

  1. Raccolta di cellule in coltura
    1. Quando le cellule sono confluenti all'80%, assicurarsi che siano vitali utilizzando l'esclusione del blu di tripano.
      NOTA: Per questi esperimenti è stata utilizzata una linea cellulare HeLa S3, ma questo metodo può essere applicato a qualsiasi cellula in coltura.
    2. Aspirare il terreno, quindi applicare 5 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) su ciascuna piastra.
    3. Agitare la/e piastra/e per risciacquare tutti i residui di fluido, quindi aspirare il PBS e applicare 5 mL di 1x PBS.
    4. Separare delicatamente le cellule dalla piastra raschiandole con un sollevatore cellulare monouso.
    5. Trasferire ciascuna sospensione cellulare in una provetta conica da 15 mL.
    6. Pellettare le cellule centrifugando a 800 x g per 5 min.
    7. Aspirare il PBS dal pellet della cella.
    8. Procedere all'estrazione degli istoni.
      NOTA: Congelare il pellet cellulare in azoto liquido se non può essere lavorato immediatamente. Conservare il pellet a -80 °C fino al momento di procedere.
  2. Estrazione di istoni
    1. Stimare il volume di ogni pellet cellulare e contrassegnare il menisco con un pennarello indelebile.
    2. Preparare una quantità sufficiente di tampone di isolamento nucleare (NIB; 15 mM Tris-HCl (pH 7,5), 15 mM NaCl, 60 mM KCl, 5 mM MgCl2, 1 mM CaCl2 e 250 mM saccarosio) per tutti i campioni. In alternativa, se è necessario processare molti campioni nel tempo, preparare il tampone alla rinfusa e conservarlo a 2-8 °C per un massimo di 6 mesi, oppure aliquotarlo e congelarlo a una temperatura compresa tra -15 °C e -25 °C a tempo indeterminato scongelando solo la quantità necessaria per ogni estrazione.
      NOTA: Il buffer deve rimanere libero durante la conservazione. Se il tampone assume un aspetto torbido o comunque anomalo in qualsiasi momento, scartare e preparare un tampone nuovo.
    3. Preparare 50 volte il volume dei pellet cellulari del tampone di lavaggio e aggiungere gli inibitori come segue (circa 10 mL di tampone di lavaggio per 2 campioni).
      1. Per preparare 10 mL di tampone di lavaggio, mescolare 10 mL di NIB, 30 μL di 200 mM di cloridrato di fluoruro di 4-(2-amminoetil)benzensulfonile [AEBSF], 10 μL di 1 M ditiotreitolo [DTT], 20 μL di microcistina 5 μM, 20 μL di butirrato di sodio 5 M.
    4. Rimuovere 1/5 del tampone di lavaggio per preparare il tampone di lisi (1/5 del volume dal tampone di lavaggio, alternativa allo 0,3% NP-40 o NP-40).
      NOTA: Non utilizzare Triton-X 100 al posto dell'alternativa NP-40 o NP-40, poiché potrebbe essere troppo abrasivo per alcuni tipi di cellule.
    5. Lavare accuratamente il pellet cellulare sospendendolo in 5 colonne di tampone di lavaggio e centrifugandolo a 800 x g per 5 minuti a 4 °C. Completare questo passaggio due volte, aspirando e scartando il surnatante tra un lavaggio e l'altro.
    6. Assicurarsi che il volume del pellet cellulare sia ancora contrassegnato con un pennarello indelebile. Risospendere in 10 volumi di tampone di lisi.
    7. Pipetta miscelare accuratamente ogni pellet per risospenderlo, quindi incubare per 15 minuti su ghiaccio.
    8. Dopo 15 min, centrifugare a 800 x g per 5 min a 4 °C.
    9. Aspirare ed eliminare il surnatante.
      NOTA: Il pellet deve ridursi a ≤ 1/2 della dimensione originale del pellet (come indicato dalla linea di marcatura). Se il pellet non si è ridotto a sufficienza, ripetere la procedura di lisi e includere una delicata fase di omogeneizzazione utilizzando un pestello per rompere le cellule.
    10. Una volta completata la lisi, risospendere il pellet in 500 μL di tampone di lavaggio, quindi centrifugare a 800 x g per 5 minuti a 4 °C. Aspirare ed eliminare il surnatante, quindi ripetere ancora una volta la fase di lavaggio per rimuovere tutte le tracce di NP-40.
      NOTA: A questo punto, il pellet è costituito da cromatina, che contiene istoni.
    11. Risospendere il pellet in 5 volumi (della dimensione originale del pellet della cella) di 0,4 N H2SO4.
    12. Incubare per 2 ore in cella frigorifera o in frigorifero utilizzando un agitatore.
    13. Dopo 2 ore, centrifugare il/i campione/i a 3400 x g per 5 minuti a 4 °C. Non gettare il surnatante.
    14. Trasferire il surnatante in nuove provette e aumentare il 100% di acido tricloroacetico (TCA) a 1/3 del volume del contenuto (la concentrazione finale di TCA sarà di circa il 20%).
    15. Capovolgere delicatamente la provetta e osservare che la soluzione limpida e incolore diventa bianca e/o torbida, indicando la precipitazione delle proteine.
      NOTA: Per le soluzioni con basse concentrazioni di istoni, la precipitazione proteica potrebbe non essere immediatamente evidente, ma il precipitato dovrebbe essere visibile dopo l'incubazione notturna.
    16. Incubare senza disturbi per una notte (12-18 ore) a 4 °C per far precipitare completamente le proteine istoniche.
    17. Il giorno seguente, centrifugare a 3400 x g per 5 minuti a 4 °C.
    18. Aspirare il surnatante, facendo attenzione a non toccare i lati della provetta con il puntale della pipetta. In questa fase, gli istoni si depositano principalmente come una pellicola attorno ai lati dei tubi.
    19. Aggiungere 500 μL di acetone ghiacciato + 0,1% di HCl (acetone acido) in ciascuna provetta, utilizzando una pipetta Pasteur in vetro, quindi capovolgere delicatamente la provetta o le provette più volte. Disporre i campioni in ordine (1, 2, 3, ecc.) mentre si esegue questa operazione, poiché qualsiasi acetone errante può rimuovere i segni sulle provette. Centrifugare a 3400 x g per 5 minuti a 4 °C e decantare delicatamente il surnatante.
    20. Ripetere questa fase di risciacquo con 500 μL di acetone ghiacciato al 100%, anche con una pipetta Pasteur in vetro. Centrifugare a 3400 x g per 5 minuti a 4 °C e decantare delicatamente il surnatante.
    21. Lasciare asciugare i tubi aperti a temperatura ambiente fino a quando l'acetone rimanente non sarà evaporato.
    22. Una volta asciutta, aggiungere 100 μL di acqua per spettrometria di massa (MS) a ciascuna provetta. Utilizzare questa gocciolina per tamponare tutti i lati del contenitore per risospendere l'intero film istonico. A tale scopo, pipettare la goccia sul lato della provetta e ruotarla durante il pipettaggio su e giù o erogare metà dei 100 μL e utilizzare la punta per mescolarla tutt'intorno. Una combinazione di entrambi i metodi funziona meglio. Gli istoni sono facilmente solubili in acqua e saranno nella soluzione.
    23. Dopo aver risospeso tutti i campioni, se rimane un solido bianco, sonicare in un bagno a temperatura ambiente per 5 minuti.
    24. Centrifugare a 800 x g per 5 min a 4 °C. Trasferire la soluzione limpida in provette fresche. Scartare il pellet insolubile rimanente.
    25. Eseguire una SDS-PAGE in condizioni di riduzione per verificare che l'estrazione sia pulita.
      NOTA: I gel possono essere utilizzati utilizzando qualsiasi concentrazione appropriata di poliacrilammide, purché sia in grado di differenziare le proteine nell'intervallo 10-20 kDa. Vedere la tabella dei materiali per i gel utilizzati in questo protocollo.
    26. Eseguire un test di concentrazione proteica (ad esempio, Bradford o BCA) per determinare la concentrazione proteica totale.
  3. Derivatizzazione chimica (propionilazione) dei residui di lisina
    1. Trasferire 20 μg di istoni (determinati dal test delle proteine) in una provetta pulita. Essiccare il campione fino a <5 μL utilizzando un concentratore sottovuoto, quindi risospendere utilizzando 20 μL di bicarbonato di ammonio 100 mM (NH4CO3) (soluzione ~1 μg/μL). Regolare il pH a ~8 utilizzando idrossido di ammonio, se necessario.
      ATTENZIONE: Non utilizzare idrossido di ammonio (NH4OH) per risospendere, ma solo per regolare il pH se necessario. In caso contrario, le proteine si denaturano e precipitano.
      NOTA: Per controllare il pH con una perdita minima di campione, utilizzare il puntale di una pipetta per immergere il campione e tamponare su una striscia di pH. Questa procedura di analisi sarà utile durante le restanti fasi di preparazione del campione.
    2. Preparare il reagente di propionilazione aggiungendo anidride propionica all'acetonitrile (ACN) in un rapporto 1:3 (v/v) (cioè, per produrre 40 μL di reagente, combinare 10 μL di anidride propionica con 30 μL di ACN).
      NOTA: Tradizionalmente, il metanolo o l'isopropanolo sono stati utilizzati nella preparazione di un reagente di propionilazione. Poiché la propionilazione è una reazione di formazione di ammide, è necessario un solvente non protonico, come l'acetonitrile, per prevenire prodotti collaterali e reazioni indesiderate, come l'estere metilpropionilico, che deriva dall'uso del metanolo. Preparare solo una quantità sufficiente di reagente di propionilazione per un massimo di 4 campioni alla volta, in modo che il reagente rimanga fresco. Utilizzare il reagente entro 1-2 minuti dalla preparazione. Quando il reagente si trova, l'anidride propionica reagirà con qualsiasi umidità ambientale e inizierà a formarsi acido acetico, che può modificare l'efficacia del reagente e cambierà il pH della soluzione istonica una volta aggiunto il reagente.
    3. Aggiungere il reagente di propionilazione a ciascun campione in un rapporto 1:4 (v/v) (cioè, per 20 μL di istoni, aggiungere 5 μL di reagente di propionilazione).
    4. Aggiungere rapidamente NH4OH 1:5 (v/v) (cioè aggiungere 4 μL per 20 μL della soluzione istonica) per ristabilire il pH della soluzione a ~8. Se il pH è ancora troppo basso, aggiungere 1-2 μL di NH4OH alla volta fino a raggiungere un pH di 8. In genere, un rapporto 1:5 (v/v) è adeguato.
    5. Incubare i campioni a temperatura ambiente per 15 minuti senza disturbi.
    6. Ripetere la reazione di propionilazione per non più di 3-4 campioni per lotto di reagente di propionilazione per garantire una formazione di acido minima.
    7. Ripetere le fasi 1.3.2-1.3.5 della procedura di propionilazione. Un secondo ciclo di propionilazione assicura che il >95% delle lisine disponibili sia derivatizzato.
    8. Essiccare i campioni fino a <5 μL utilizzando un concentratore sottovuoto. Questo farà evaporare qualsiasi reagente di propionilazione non reagito, prodotti acidi e gas di ammoniaca rilasciati dall'NH4OH. Se i campioni si asciugano completamente, va bene, poiché non si verificano perdite significative di campioni.
      NOTA: Spostare l'aria nella bombola di anidride propionica con gas argon prima della conservazione per evitare la formazione di acido acetico a causa del contatto con l'umidità ambientale rimasta nella bottiglia.
  4. Digestione proteolitica con tripsina
    1. Risospendere gli istoni in 100 mM NH4HCO3 per ottenere un volume di 20 μL, ottenendo una concentrazione ottimale di 1 μg/μL.
      NOTA: Le soluzioni campione con concentrazioni inferiori a 1 μg/μL comporteranno una diminuzione dell'efficienza della tripsina.
    2. Aggiungere tripsina ai campioni istonici in un rapporto 1:10 (wt/wt) (cioè, aggiungere 2 μL di soluzione 1 μg/μL di tripsina a 20 μg di istoni).
    3. Reazioni di incubazione a 37 °C per 6-8 h. In alternativa, incubare per una notte (12-18 h) a temperatura ambiente.
    4. Interrompere la digestione congelando a -80 °C per almeno 1 ora.
      NOTA: Non utilizzare acido per spegnere la reazione di digestione, poiché ciò causerebbe un calo indesiderato del pH a questo punto della procedura. Il campione può essere conservato a -80 °C fino al momento di procedere (punto di arresto intermedio).
  5. Derivatizzazione chimica (propionilazione) di N-terminali peptidici
    1. Essiccare i campioni a <5 μL utilizzando un concentratore sottovuoto.
    2. Risospendere i campioni fino a 20 μL (1 μg/μL) utilizzando 100 mM NH4HCO3.
    3. Ripetere la propionilazione come prima (passaggio 1.3).
      NOTA: È normale che i campioni impieghino più tempo ad asciugarsi in questa fase a causa di un rapporto acquoso/fase organica più elevato.
  6. Dissalazione del campione con punte di fase
    1. Risospendere o diluire i campioni con 50 μL di acqua di grado MS + 0,1% TFA.
    2. Utilizzando un detorsolatore per campioni da 11 G, perforare 5 dischi di materiale C18 da un disco di estrazione in fase solida (perforare tutti e 5 i dischi prima di trasferirli al puntale della pipetta). Inserire e assicurarsi che i dischi siano incastrati in modo sicuro e uniforme sul fondo di un puntale per pipette da 200 μL (Figura 1).
      NOTA: Utilizzare un detorsolatore da 15 G se si esegue la desalinizzazione di oltre 25 μg di campione attraverso una punta a stadio singolo.
    3. Utilizzare un adattatore per centrifuga per tenere in posizione le punte dello stage in provette per microcentrifuga da 1,5 mL o 2 mL.
      NOTA: Per le seguenti fasi di centrifugazione, utilizzare un giro lento (400-500 x g) a 4 °C, per 1-2 minuti alla volta; i solventi normalmente passano attraverso la resina in meno di 1 minuto, a seconda di quanto strettamente il materiale C18 è impacchettato nelle punte.
    4. Risciacquare la resina centrifugando con 50 μL di acetonitrile al 100% per attivare il materiale C18 e rimuovere potenziali contaminanti.
      NOTA: Potrebbe essere più facile caricare le soluzioni sui puntali dello stage utilizzando i puntali per pipette a caricamento di gel. Una volta attivato il materiale C18 , è importante non lasciare che la resina si asciughi per tutta la durata della procedura di dissalazione.
    5. Equilibrare il materiale del disco con 80 μL di acqua di grado MS + 0,1% di TFA mediante centrifugazione.
    6. Acidificare il campione a pH 4 o inferiore utilizzando acido acetico glaciale. Controllare il pH con le strisce pH come prima per ridurre al minimo la perdita di campione.
    7. Caricare l'intero campione sul disco di resina mediante centrifugazione lenta.
    8. Lavare il campione con 80 μL di acqua di grado MS + 0,1% TFA mediante centrifugazione.
    9. Emulsionare il campione in una provetta pulita da 1,5 mL lavando 70 μL di acetonitrile al 75% e acido acetico allo 0,5% mediante centrifugazione lenta. È possibile utilizzare un tempo di centrifugazione aggiuntivo per garantire che l'intero volume del campione venga eluito dalla punta dello stage. Va bene se la resina si asciuga con il tempo di centrifugazione aggiuntivo, poiché non è più necessaria dopo l'eluizione del campione.
    10. Asciugare completamente ogni campione in un concentratore sottovuoto.
      NOTA: I campioni possono essere conservati a -80 °C fino al momento di procedere (punto di arresto intermedio).
    11. Per l'analisi LC-MS/MS, ricostituire i campioni in un volume di solvente A (acido formico allo 0,1%) dal protocollo di cromatografia liquida (LC) che fornisce la concentrazione finale di 0,4 μg/μL (cioè, sciogliere 20 μg di istoni in 50 μL di solvente A).

2. Interfaccia software TIMS

  1. Selezionare la scheda Instrument (Strumento ) e passare a Operate (verificare che il nome dello strumento venga evidenziato in verde) (Figura 2).
  2. Verificare i parametri TIMS (Figura 2).
  3. Verificare le impostazioni MS (inizio e fine scansione, polarità degli ioni, modalità di scansione) (Figura 2).
  4. Verificare le impostazioni TIMS (modalità, inizio e fine mobilità, tempo di rampa, tempo di accumulo, ciclo di lavoro, velocità di rampa, velocità MS, media MS e calibrazione automatica) (Figura 2).
  5. Andare alla scheda Source (Sorgente ) e attivare l'opzione siringa (Hamilton 500 μL) solo per la fase di calibrazione TuneMix (Figura 3)13.
  6. Vai alla scheda Calibrazione , fai clic su m/z, seleziona Modalità di calibrazione e scegli la modalità (Q avanzato, in generale), zoom (+0,01%) STD Dev (0,24) e fai clic su Calibra; quando viene raggiunto un punteggio del 100%, accettare (Figura 4).
  7. Vai alla scheda mobilità e ripeti il processo di calibrazione (modalità lineare, generalmente), intervallo di rilevamento (+5%), larghezza (0.1 Da), STD Dev (0.1855), quindi fai clic su calibra; quando si ottiene un punteggio ≥ 98,5%, accettare (Figura 5).
  8. Vai al metodo e seleziona il metodo da utilizzare; per questo esempio, è stato selezionato Proteomic_/2023-01-19-CF/20230119-Hela Control histone_prep_pasefDIA_1-24_1_451.d/451.m-TimsControl (Figura 5).

3. LC-TIMS-PASEF-ToF MS/MS

  1. Utilizzare le tipiche condizioni operative nESI: tensione capillare di 4500 V, offset della piastra terminale di 800 V, pressione del nebulizzatore di 3,0 bar, gas secco di 10,0 L/min, riscaldatore a secco di 200 °C e portata di iniezione di 50 μL/min.
  2. Utilizzare le impostazioni tipiche di MS: energia di collisione di 6 eV, RF di collisione di 1200 Vpp, tempo di trasferimento di 75 μs, memorizzazione pre-impulso di 5 μs.
  3. Determinare il flusso di gas alla deriva utilizzando la differenza di pressione tra l'imbuto di ingresso P1 e l'imbuto di uscita P2. La frammentazione seriale ad accumulo parallela (PASEF) si verifica nella cella TIMS, accumulando tutti gli ioni precursori contemporaneamente piuttosto che individualmente. Gli ioni precursori vengono quindi rilasciati in picchi ionici stretti rispetto ai picchi normalmente molto più ampi (circa 50 volte più corti), aumentando il rapporto segnale/rumore pur separando i peptidi co-eluiti attraverso la mobilità14.
  4. Sviluppare un metodo LC-TIMS-TOF MS/MS per l'analisi di peptidi istonici proteolitici. Accoppiare un cromatografo liquido ad alte prestazioni (HPLC) dotato di una colonna C18 (300 Å, 5 μm, 4,6 mm x 250 mm) con uno strumento commerciale TIMS-TOF MS con tecnologia proprietaria PASEF.
    NOTA: Questa dimensione della colonna è stata determinata per fornire una buona separazione sia ad alto che a basso pH per le miscele peptidiche, sulla base dei lavori pubblicati in precedenza 15,16,17.
    1. Impostare il volume di iniezione su 20 μL (8 μg) di campione e una portata di 0,4 mL/min.
    2. Eseguire un gradiente LC non lineare di 60 minuti utilizzando acqua con acido formico allo 0,1% (solvente A) e acetonitrile con acido formico allo 0,1% (solvente B). Impostare la pendenza: 10% B per 2,7 min, poi al 20% B in 5,3 min, 28% B in 4 min, 35% B in altri 18 min, al 40% B in 13 min e al 100% B in altri 2 min. Dopo aver mantenuto il 100% B per 5 minuti, abbassare la concentrazione al 10% B in 5 minuti e mantenere la concentrazione per gli ultimi 5 minuti.
  5. Verificare l'eluizione del campione dall'HPLC nel TIMS-TOF tramite ionizzazione nano-elettrospray (nESI) in modalità di ionizzazione positiva.

4. Analisi dei dati

  1. Identificare le sequenze peptidiche e i siti di modificazione.
    1. Preparare un elenco teorico di peptidi utilizzando ProteinProspector [https://prospector.ucsf.edu/prospector/cgi-bin/msform.cgi?form=msdigest] con lo strumento MS-digest.
      1. Eseguire una digestione teorica prendendo in considerazione le condizioni del digerito (enzima utilizzato), i tipi di PTM ricercati (ad esempio, mono-, di- o trimetilazione), l'intervallo di dimensioni dei peptidi ricercati, nonché l'intervallo di rilevamento della massa e il numero potenziale di scissioni mancate.
  2. Analizzare manualmente i dati acquisiti in base ai peptidi teorici (Figura 6)12.
    1. Si cercano le masse a diversi stati di carica (da +1 a +4) per ogni peptide teorico.
    2. Dopo l'identificazione iniziale di ogni m/z, selezionare il picco e confermare il MS/MS utilizzando un elenco teorico di ioni di frammentazione basato sulla sequenza peptidica, compresi i PTM.
      NOTA: Se la mobilità del peptide identificato era nota in precedenza, anche questo è confermato.
  3. Calcola le abbondanze relative di vari PTM e riporta ogni modifica come percentuale della sequenza peptidica specificata.
    1. L'abbondanza relativa di ogni PTM rilevato viene calcolata utilizzando la seguente equazione:
      Abbondanza relativa = Area di PTM/Area totale di PTM e PTM non modificati per un dato peptide

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Risultati

Un flusso di lavoro proteomico bottom-up (Figura 7) prevede in genere quanto segue: estrazione delle proteine target da un campione grezzo, seguita dalla quantificazione della concentrazione delle proteine e quindi frazionamento, di solito mediante elettroforesi su gel o cromatografia liquida. Dopo il frazionamento, le proteine vengono digerite utilizzando un enzima proteolitico (spesso tripsina) e, infine, l'analisi spettrometrica di massa dei peptidi risultanti e l'identificazione delle pr...

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Discussione

Gli istoni sono proteine di base che regolano la struttura della cromatina interagendo con il DNA sotto forma di ottameri costituiti dai quattro istoni principali (due ciascuno di H2A, H2B, H3 e H4)20. Gli istoni contengono numerosi residui di lisina e arginina, che vengono prontamente modificati, portando a PTM estesi che alterano la chimica della cromatina influenzando la funzione degli istoni o legandosi ad altre proteine cellulari21. I PTM possono suscitare risposte bio...

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Dichiarazioni

Melvin A. Park e Matthew Willetts sono dipendenti della Bruker Daltonics Inc., il produttore dello strumento timsTOF.

Ringraziamenti

Questo materiale si basa sul lavoro sostenuto dalla National Science Foundation nell'ambito della sovvenzione n. HRD-1547798 e Grant No. HRD-2111661. Queste sovvenzioni NSF sono state assegnate alla Florida International University nell'ambito del programma CREST (Centers of Research Excellence in Science and Technology). Questo è il contributo numero 1672 dell'Institute of Environment, un programma preminente presso la Florida International University. Un ulteriore sostegno è stato fornito dal National Institute of Health nell'ambito della sovvenzione n. R21AI135469 a Francisco Fernandez-Lima e Grant No. R01HD106051 a Benjamin A. Garcia, così come dalla National Science Foundation nell'ambito della sovvenzione n. CHE-2127882 a Benjamin A. Garcia. Gli autori desiderano riconoscere il supporto iniziale del Dr. Mario Gomez Hernandez durante gli sviluppi iniziali del metodo.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
-80 ° C Congelatore
1x soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), pH 7,4Thermo Fisher Scientific10010023
Puntali per pipette da 1 mLThermo Fisher Scientific94060710Finntip Flex 1000 μ Puntali a L, non sterili, non filtrati, in rack Provette
microcentrifuga da 1,5 mLThermo Fisher Scientific14-282-300Utilizzare queste provette per l'elaborazione semplice e sicura di volumi di campione fino a 1,5 mL
10 &; L Puntali per pipetteThermo Fisher Scientific94060100Finntip Flex, 10 &; L, non sterile, non filtrato, travasato
10% NP-40Thermo Fisher Scientific28324NP-40 Surfact-Amps Soluzione detergente
10x Dulbecco' s PBS senza Ca2+/Mg2+(Mediatech)MT21031CM
15 mL Provette conicheCorning352196Falcon Conical Centrifuge Tubes
200 &; L Puntali per pipette con caricamentoThermo Fisher Scientific02-707-138Fisherbrand  Punte per il caricamento del gel, 1– 200 μ L
200 µ L Puntali per pipetteThermo Fisher Scientific94060310Finntip Flex 200μ Puntali a L, non sterili, non filtrati, in rack
2x Laemmli Sample BufferBio-Rad1610737Tampone premiscelato per campioni proteici SDS-PAGE
50 mL Provette conicheCorning352070Falcon Conical Centrifuge Piastra
fondo piatto a 96 pozzettiThermo Fisher Scientific 12565501
piastra a 96 pozzetti, V-Bottom 600 μ LAxygenP-DW-500-CS
AcetoneSigma Aldrich179124reagente ACS, ≥ 99,5%
acetonitrile (ACN)Thermo Fisher ScientificA998HPLC, Fisher Chemical
Acetonitrile con 0,1% di acido formico (v/v), LC/MS GradeThermo Fisher ScientificLS120Optima LC/MS Grade, Thermo Scientific
AEBSFThermo Fisher Scientific328110500AEBSF cloridrato, 98%
bicarbonato di ammonio, NH4HCO3Sigma Aldrich09830BioUltra, ≥ Soluzione
), NH4OHSigma AldrichAX1303Soddisfa le specifiche ACS, soddisfa le specifiche dei reagenti per il test delle monografie USP/NF GR ACS
Argon (Ar)AirgasAR HP 300
BEH C18 Colonna HPLCWaters186003625XBridge Peptide BEH C18, 300 Å, 5 µ m, 4,6 mm X 250 mm, 1K– 15K
Albumina sierica bovina (BSA)Sigma AldrichA7906Frazione di shock termico, pH 7, ≥ 98%
Cloruro di calcio, CaCl2Sigma AldrichC4901Anidro, polvere, ≥ 97%
Tampone di dissociazione cellulareThermo Fisher Scientific13151014
Wafer di incisione in ceramicaRestek20116
Compass DataAnalysis 6.0Bruker Datonics
Compass HyStar 6.2Bruker Daltonics
Compass IsotopePatternBruker Daltonics
Compass timsControl 4.1Bruker Daltonics
Coomassie Brilliant Blue R-250Bio-Rad1610436
pozzetto profondo, micropiastra a 96 pozzetti, 2,0 mlThermo Fisher Scientific89237526
sollevatori cellulari monousoThermo Fisher Scientific  08100240Fisherbrand Sollevatori di cellule; I sollevatori monouso rimuovono rapidamente gli strati cellulari
Pestelli monouso per pelletThermo Fisher Scientific12-141-363Fisherbrand  pestelli a pellet; Risospendere pellet di proteine e DNA o macinare i tessuti molli in provette da microcentrifuga
Ditiotreitolo (DTT)Thermo Fisher ScientificP23251 M
Acido formico (FA)Sigma Aldrich695076reagente ACS, ≥ 96%
Capillare in silice fusa 75 μ m ID x 363 μ m OD(Molex (Polymicro)TSP075375
Acido acetico glacialeThermo Fisher ScientificA38SAcido acetico, glaciale (certificato ACS), Fisher Chemical
Glass Pasteur PipetteSigma AldrichBR747725-1000EA
Cromatografo liquido ad alte prestazioni  ShimadzuShimadzu Prominence 20 HPLC UFLC System
Acido cloridrico, HClSigma Aldrich258148reagente ACS, 37%
Hypercarb 30-40 μ m Carbonio 150– 300 & Aring;Thermo Fisher Scientific60106-402
Cartuccia HypersepThermo Fisher Scientific60109-404
Standard di calibrazione LC/MS, per ESI-ToFAgilentG1969-85000TuningMix
Cloruro di magnesio, MgCl2Sigma AldrichM8266Anidro, ≥ 98%
Metanolo, per HPLCThermo Fisher ScientificA454Optima per HPLC, Fisher Chemical   
Adattatori per provette per microcentrifugaGL Sciences501021514
MicrocistinaThermo Fisher Scientific50-200-8727Enzo Life Sciences  Fiala per campioni Microcystin-LA
MS, LaPhaPack, Snap, 12 mm x 32 mmLEAP PAL PartsLAP.11190933
NanodropThermo Fisher Modelloscientifico: ND3300
Azoto (N2)AirgasNI UHP300
PEAKS Studio X+Soluzioni bioinformatiche
Strisce indicatrici di pH, InstachekMicro Essential ModelloJR-113: cloruro di potassio Hydrion
ACS KClSigma AldrichP391199,0%; 100,5%
Cella di iniezione a pressioneProssimo avanzamento  modello: PC77
Anidride propionicaSigma Aldrich8.00608Per
refrigerata di sintesi (700– 18.000 x g)NuAire, modello: NuwindNU-C200V
Reprosil-Pur 120 C18-AQ 3 μ m, 3 gESI Source Solutionsr13.aq.0003
SDS-PAGE GelsBio-Rad4569035Qualsiasi gel di poliacrilammide prefabbricato kD, 8,6 cm & volte; 6,7 cm (W & volte; L), per l'uso con celle di elettroforesi Mini-PROTEAN
Butirrato di sodioThermo Fisher ScientificA11079.0698+%
cloruro di sodio, reagente NaClSigma AldrichS9888ACS, ≥ Disco SPE 99,0%,
C18VWR76333-134Disco SPE Empiro, C18, CDS Analytical, 90 mm x 0,5 mm, 12 &; m
Pompa per vuoto SpeedVac+ e rotore a piastreModello Savant: SC210A
SaccarosioMillipore1.07651adatto per microbiologia
Acido solforico, H2SO4 Sigma Aldrich33974199.999%
TIMS-ToF Spettrometromassa Bruker Daltonicsmodello Tims tof ms
Soluzione di acido tricloroacetico, TCASigma AldrichT06996.1 
N Acido trifluoroacetico (TFA)Sigma Aldrich302031Adatto per HPLC, ≥ 99,0%
Triversa NanomateAdvionmodello: TR263
TripsinaProteasi, grado MS ThermoFisher Scientific90057
Rotatore di tubiThermo Fisher Scientific88881001
Vortex MixerThermo Fisher Scientific 88880017
con acido formico allo 0,1% (v/v), grado LC/MSThermo Fisher ScientificLS118Optima LC/MS Grade, Thermo Scientific 
privi di origine animale per gel a di idrossido di ammonio al 99,5% (T da laboratorio, reagente, centrifuga di Thermo Fisher Scientific

Riferimenti

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