Qui, presentiamo un metodo di purificazione di affinità di un enzima fibrinolitico da Sipunculus nudus che è semplice, economico ed efficiente.
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Articolo metodologico
Purificazione per affinità di un enzima fibrinolitico da Sipunculus nudus
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'enzima fibrinolitico di Sipunculus nudus (sFE) è un nuovo agente fibrinolitico che può sia attivare il plasminogeno in plasmina che degradare direttamente la fibrina, mostrando grandi vantaggi rispetto agli agenti trombolitici tradizionali. Tuttavia, a causa della mancanza di informazioni strutturali, tutti i programmi di purificazione per sFE si basano su purificazioni cromatografiche multifase, che sono troppo complicate e costose. Qui, un protocollo di purificazione di affinità di sFE viene sviluppato per la prima volta basato su una struttura cristallina di sFE; comprende la preparazione del campione grezzo e della colonna cromatografica di affinità della matrice lisina/arginina-agarosio, la purificazione dell'affinità e la caratterizzazione della sFE purificata. Seguendo questo protocollo, un lotto di sFE può essere purificato entro 1 giorno. Inoltre, la purezza e l'attività della sFE purificata aumentano rispettivamente al 92% e a 19.200 U/ml. Pertanto, questo è un approccio semplice, economico ed efficiente per la purificazione sFE. Lo sviluppo di questo protocollo è di grande importanza per l'ulteriore utilizzo di sFE e altri agenti simili.
Introduzione
La trombosi è una grave minaccia per la salute pubblica, soprattutto a seguito della pandemia globale di Covid-19 1,2. Clinicamente, molti attivatori del plasminogeno (PA), come l'attivatore del plasminogeno di tipo tissutale (tPA) e l'urochinasi (Regno Unito), sono stati ampiamente utilizzati come farmaci trombolitici. Le PA possono attivare il plasminogeno dei pazienti in plasmina attiva per degradare la fibrina. Pertanto, la loro efficienza trombolitica è fortemente limitata dallo stato del plasminogeno dei pazienti 3,4. Gli agenti fibrinolitici, come la plasmina metalloproteinasi e la plasmina serina, sono un altro tipo di farmaco trombolitico clinico che include anche enzimi fibrinolitici (FE) come la plasmina, che possono sciogliere direttamente i coaguli ma sono rapidamente inattivati da vari inibitori della plasmina5. Successivamente, è stato riportato un nuovo tipo di agente fibrinolitico che può dissolvere il trombo non solo attivando il plasminogeno in plasmina, ma anche degradando direttamente la fibrina 6-l'enzima fibrinolitico dall'antico verme delle arachidi Sipunculus nudus (sFE)6. Questa bifunzione conferisce a sFE altri vantaggi rispetto ai farmaci trombolitici tradizionali, specialmente in termini di stato anomalo del plasminogeno. Rispetto ad altri agenti fibrinolitici bifunzionali 7,8,9, sFE mostra diversi vantaggi, tra cui la sicurezza, rispetto agli agenti derivati non alimentari per lo sviluppo di farmaci, in particolare per i farmaci orali. Questo perché la biosicurezza e la biocompatibilità di Sipunculus nudus sono state ben stabilite10.
Analogamente agli altri agenti fibrinolitici naturali isolati da microrganismi, lombrichi e funghi, la purificazione di sFE da S. nudus è molto complicata e comprende più fasi, come l'omogeneizzazione dei tessuti, la precipitazione del solfato di ammonio, la desalinizzazione, la cromatografia a scambio anionico, la cromatografia di interazione idrofobica e la setacciatura molecolare10,11,12. Un tale sistema di purificazione non dipende solo da competenze competenti e materiali costosi, ma richiede anche diversi giorni per completare l'intera procedura. Pertanto, un semplice programma di purificazione di sFE è di grande importanza per l'ulteriore sviluppo di sFE. Fortunatamente, due cristalli di sFE (PDB: 8HZP; PDB: 8HZO) sono stati ottenuti con successo (vedere File supplementare 1 e File supplementare 2). Attraverso analisi strutturali ed esperimenti di docking molecolare, abbiamo scoperto che il nucleo catalitico di sFE potrebbe legarsi specificamente a bersagli contenenti residui di arginina o lisina.
Qui, è stato proposto per la prima volta un sistema di purificazione di affinità, basato sulla struttura cristallina di sFE. Seguendo questo protocollo, la sFE altamente pura e altamente attiva potrebbe essere purificata dagli estratti grezzi in un unico stadio di purificazione di affinità. Il protocollo sviluppato qui non è importante solo per la preparazione su larga scala di sFE, ma può anche essere applicato per la purificazione di altri agenti fibrinolitici.
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Protocollo
1. Preparazione
- Trattamento del campione
- Sezionare con cura S. nudus fresco (100 g) e raccogliere l'intestino e il suo fluido interno.
- Aggiungere 300 ml di tampone Tris-HCl (0,02 M, pH 7,4) per l'omogeneizzazione (1.000 rpm, 60 s).
- Congelare-scongelare l'omogenato 3x.
- Centrifugare il campione (10.956 × g, 0,5 h, 4 °C) e raccogliere il surnatante. Conservare il campione a 4 °C fino a un ulteriore utilizzo.
- Precipitazione proteica
- Mescolare il surnatante con una soluzione satura di solfato di ammonio (nove volumi) e lasciare riposare la miscela per 12 ore a 4 °C.
NOTA: il protocollo può essere messo in pausa qui e continuato in seguito. - Centrifugare (10,956 × g, 0,5 h, 4 °C) per ottenere il precipitato proteico; conservare a 4 °C per un uso successivo.
- Mescolare il surnatante con una soluzione satura di solfato di ammonio (nove volumi) e lasciare riposare la miscela per 12 ore a 4 °C.
- Risospensione proteica
- Risospendere il precipitato proteico con 30 mL di tampone Tris-HCl (0,02 M, pH 7,4). Conservare questa soluzione proteica grezza a 4 °C per un uso successivo.
2. Cromatografia di affinità
- Filtrazione della soluzione
- Filtrare la soluzione proteica grezza attraverso una membrana filtrante da 0,22 μm. Conservare questo campione a 4 °C per un uso successivo.
- Impacchettamento della colonna
- Imballare la colonna cromatografica di affinità arginina-agarosio e la colonna cromatografica di affinità matrice lisina-agarosio caricando una quantità appropriata di terreno di matrice lisina-agarosio e di terreno di matrice di arginina-agarosio in colonne cromatografiche vuote da 5 ml.
NOTA: La colonna può essere conservata a 2-8 °C, con la matrice immersa nel tampone di stoccaggio (20% di etanolo).
- Imballare la colonna cromatografica di affinità arginina-agarosio e la colonna cromatografica di affinità matrice lisina-agarosio caricando una quantità appropriata di terreno di matrice lisina-agarosio e di terreno di matrice di arginina-agarosio in colonne cromatografiche vuote da 5 ml.
- Purificazione per affinità
- Equilibrare la colonna cromatografica di affinità con ddH2O prima (1 mL/min, 10 volumi di colonna), seguita da tampone Tris-HCl (0,02 M, pH 8,0, 1 mL/min, 5 volumi di colonna).
- Caricare il campione della soluzione proteica sulla colonna preequilibrata (1 ml/min, 1/3 di volume della colonna).
NOTA: Il volume di carico del campione dipende dalla concentrazione di sFE. - Lavare la colonna con tampone Tris-HCl (0,02 M, pH 8,0, cinque volumi di colonna).
- Eluire la colonna con 0,15 M, 0,25 M, 0,35 M, 0,45 M, 0,55 M e 0,65 M NaCl (1 mL/min, cinque volumi di colonna) successivamente.
- Cercare il picco di eluizione che dovrebbe apparire nell'eluizione di NaCl 0,15 M, quindi raccogliere le frazioni in tubi da 5 ml.
- Concentrare il campione di eluizione utilizzando un filtro ultracentrifugo da 3 kD (3.944 × g, 1,5 h, 4 °C). Conservare questo campione a -80 °C per un uso successivo.
3. Valutazione della purezza
- Preparazione gel per elettroforesi su gel di sodio dodecil-solfato poliacrilammide (SDS-PAGE)
- Preparare il gel SDS-PAGE secondo il metodo Laemml utilizzando gel concentrato al 5% e gel di separazione al 12%13.
- Elettroforesi
- Mescolare il campione (15 μL) con 5 tampone di carico proteico SDS-PAGE (1/4 di volume), riscaldare in acqua bollente per 5 minuti, caricare sul gel SDS-PAGE e far funzionare il gel a 80 V, 60 mA per 1,5 ore.
- Analisi
- Dopo l'elettroforesi, colorare il gel con un Silver Stain Kit, secondo il protocollo del produttore, e osservare il gel colorato utilizzando un sistema di imaging a chemiluminescenza.
- Analizzare la purezza della proteina bersaglio utilizzando la seguente formula: purezza della proteina bersaglio = valore di intensità della proteina bersaglio/valore di intensità della proteina totale.
4. Valutazione dell'attività fibrinolitica
- Preparazione della piastra di fibrina
- Preparare la soluzione di fibrinogeno mescolando 25 mg di fibrinogeno con 1,25 ml di soluzione fisiologica.
- Preparare la soluzione di trombina mescolando completamente 100 U di trombina con 1,05 ml di soluzione salina fisiologica.
- Preparare la soluzione di agarosio aggiungendo 0,5 g di agarosio a 22,5 ml di tampone Tris-HCl (0,02 mol/L, pH 7,4). Mescolare e riscaldare la soluzione di agarosio a 100 °C fino a completa dissoluzione.
- Raffreddare la soluzione di agarosio fino a circa 50 °C e aggiungere la soluzione di fibrinogeno. Quindi, aggiungere immediatamente la soluzione di trombina, mescolarli rapidamente e versarli in un piatto di coltura da 60 mm.
- Caricamento
- Perforare i pozzetti da 3 mm sulle piastre di fibrina preparate usando una piralide sterile e riempire i pozzetti con campioni da 10 μL.
- Analisi
- Dopo 18 ore di incubazione a 37 °C, misurare l'attività fibrinolitica calcolando la dimensione delle loro zone degradanti. Attività fibrinolitica = (dimensione della zona del campione/dimensione della zona dell'urochinasi) x 100 U. Dimensione della zona = diametro x diametro.
NOTA: Tampone fisiologico salino, proteina grezza (campione ottenuto nella fase 1.3.1 del protocollo) e urochinasi sono stati utilizzati rispettivamente per il controllo bianco, negativo e positivo. Rispetto all'urochinasi, abbiamo scoperto che l'attività fibrinolitica della sFE purificata era ~ 19.200 U / ml.
- Dopo 18 ore di incubazione a 37 °C, misurare l'attività fibrinolitica calcolando la dimensione delle loro zone degradanti. Attività fibrinolitica = (dimensione della zona del campione/dimensione della zona dell'urochinasi) x 100 U. Dimensione della zona = diametro x diametro.
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Risultati
Seguendo questo protocollo, sono stati estratti lisati di tessuto grezzo, sono state costruite colonne cromatografiche di affinità matrice arginina-agarosio e matrice lisina-agarosio, è stata ottenuta sFE purificata e la purezza e l'attività fibrinolitica della sFE purificata sono state misurate rispettivamente da SDS-PAGE e piastre di fibrina.
Dopo la centrifugazione, il surnatante raccolto era un liquido viscoso marrone chiaro. Le precipitazioni sono iniziate quando questo surnatante è stato...
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Discussione
A causa dell'indisponibilità dell'esatta sequenza genica di sFE, la sFE attualmente utilizzata è stata estratta da S. nudus14 fresco. Inoltre, le procedure di purificazione di sFE riportate in letteratura erano complicate e costose, in quanto basate su alcune caratteristiche generali di sFE, come il peso molecolare, il punto isoelettrico, la forza ionica e la polarità15,16. Nessun protocollo di purificazione di affinità di sFE è s...
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.
Ringraziamenti
Questa ricerca è stata finanziata dall'Ufficio per la scienza e la tecnologia della città di Xiamen (3502Z20227197) e dall'Ufficio per la scienza e la tecnologia della provincia del Fujian (n. 2019J01070, n. 2021Y0027).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 30% Acrilammide-Bisacrilammide (29:1) | Biosharp | ||
| 2-Mercaptoetanolo | Solarbio | ||
| Agarosio G-10 | Biowest | ||
| Persolfato di ammonio | SINOPHARM | ||
| Solfato di ammonio | SINOPHARM | ||
| Arginina-Sefarosio 4B | Solarbio | Matrice di arginina-agarosio | |
| Bromoxylenol Blue (BPB) | Solarbio | ||
| Fast Silver Stain Kit | Beyotime | ||
| Fibrinogeno | Merck | ||
| Glicina | Solarbio | ||
| Acido cloridrico | SINOPHARM | ||
| Kinase | RHAWN | ||
| Lisina-Sefarosio 4B | Solarbio | di lisina-agarosio | |
| N,N,N',N'-Tetrametiletilendiammina (TEMED) | Sigma-Aldrich | ||
| Prestained Color Protein Marker (10-170 kD) | Beyotime | ||
| Cloruro di sodio | SINOPHARM | ||
| Dodecil solfonato di sodio (SDS) | Sigma-Aldrich | ||
| Idrossido di | sodioSINOPHARM | ||
| Trombina | Meilunbio | ||
| Tris (Idrossimetil) Amminometano | Solarbio | ||
| Tris (Idrossimetil) Amminometano cloridrato | Solarbio | ||
| Equipment | |||
| AKT Sistema di purificazione delle proteine puro | GE | ||
| Sterilizzatore automatico a vapore a pressione verticale MLS-3750 | SANYO | ||
| Sistema di imaging a chemiluminescenza | GE | ||
| Pompa a flusso costante BT-100 | QITE Incubatore | ||
| temperatura costante | JINGHONG | ||
| Centrifuga refrigerata da tavolo 3-30KS Forno di | |||
| DHG DGG-9140AD | SENXIN | ||
| Omogeneizzatore elettrico in vetro DY89-II | SCIENTZ | ||
| Bilancia analitica elettronica | DENVER | ||
| Bagno d'acqua elettrotermostatico DK-S12 | SENXIN | ||
| Agitatore di decolorazione orizzontale | Kylin-Bell | ||
| Macchina per il ghiaccio AF 103 | Scotsman | ||
| KQ-500E Pulitore ad ultrasuoni | Agitatore magnetico ShuMei | ||
| Centrifuga | |||
| refrigerata H1650-W | Cence | ||
| Forno a microonde | Galanz | ||
| Milli-Q Riferimento | Millipore | ||
| Pipettore | Thermo Fisher Scientific | ||
| Misuratore di pH da tavolo | di precisione Sartorious | ||
| Oscillatore a vortice di piccole dimensioni | Kylin-Bell | ||
| Bio-Rad | |||
| Materiale di consumo 200 | |||
| µ L Provetta PCR (200 µ L) | Axygene | ||
| (1,5 mL) | Biosharp | ||
| (5 mL) | Biosharp | ||
| (50 mL) | Provetta | ||
| (7 mL) | Biosharp | ||
| (60 mm) | Membrana | ||
| (0,22 &; micro); m) | Millex GP | ||
| Parafilm Bemis | |||
| (1 mL | Puntale per pipetta KIRGEN | ||
| (10 &; micro; L) | Axygene | ||
| (200 &; micro; L) | Axygene | ||
| filtrante ultra centrifuga TZAKZY | |||
| (4 mL 3 KDa) | |||
Riferimenti
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