Qui, presentiamo un metodo di purificazione di affinità di un enzima fibrinolitico da Sipunculus nudus che è semplice, economico ed efficiente.
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Articolo metodologico
Purificazione per affinità di un enzima fibrinolitico da Sipunculus nudus
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'enzima fibrinolitico di Sipunculus nudus (sFE) è un nuovo agente fibrinolitico che può sia attivare il plasminogeno in plasmina che degradare direttamente la fibrina, mostrando grandi vantaggi rispetto agli agenti trombolitici tradizionali. Tuttavia, a causa della mancanza di informazioni strutturali, tutti i programmi di purificazione per sFE si basano su purificazioni cromatografiche multifase, che sono troppo complicate e costose. Qui, un protocollo di purificazione di affinità di sFE viene sviluppato per la prima volta basato su una struttura cristallina di sFE; comprende la preparazione del campione grezzo e della colonna cromatografica di affinità della matrice lisina/arginina-agarosio, la purificazione dell'affinità e la caratterizzazione della sFE purificata. Seguendo questo protocollo, un lotto di sFE può essere purificato entro 1 giorno. Inoltre, la purezza e l'attività della sFE purificata aumentano rispettivamente al 92% e a 19.200 U/ml. Pertanto, questo è un approccio semplice, economico ed efficiente per la purificazione sFE. Lo sviluppo di questo protocollo è di grande importanza per l'ulteriore utilizzo di sFE e altri agenti simili.
Introduzione
La trombosi è una grave minaccia per la salute pubblica, soprattutto a seguito della pandemia globale di Covid-19 1,2. Clinicamente, molti attivatori del plasminogeno (PA), come l'attivatore del plasminogeno di tipo tissutale (tPA) e l'urochinasi (Regno Unito), sono stati ampiamente utilizzati come farmaci trombolitici. Le PA possono attivare il plasminogeno dei pazienti in plasmina attiva per degradare la fibrina. Pertanto, la loro efficienza trombolitica è fortemente limitata dallo stato del plasminogeno dei pazienti 3,4. Gli agenti fibrinolitici, co....
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Protocollo
1. Preparazione
- Trattamento del campione
- Sezionare con cura S. nudus fresco (100 g) e raccogliere l'intestino e il suo fluido interno.
- Aggiungere 300 ml di tampone Tris-HCl (0,02 M, pH 7,4) per l'omogeneizzazione (1.000 rpm, 60 s).
- Congelare-scongelare l'omogenato 3x.
- Centrifugare il campione (10.956 × g, 0,5 h, 4 °C) e raccogliere il surnatante. Conservare il campione a 4 °C fino a un ulteriore utilizzo.
- Precipitazione proteica
- Mescolare il surnatante con una soluzione satura di solfato di ammonio (nove volumi) e lasciare riposare la miscela per 12 ore a ....
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Risultati
Seguendo questo protocollo, sono stati estratti lisati di tessuto grezzo, sono state costruite colonne cromatografiche di affinità matrice arginina-agarosio e matrice lisina-agarosio, è stata ottenuta sFE purificata e la purezza e l'attività fibrinolitica della sFE purificata sono state misurate rispettivamente da SDS-PAGE e piastre di fibrina.
Dopo la centrifugazione, il surnatante raccolto era un liquido viscoso marrone chiaro. Le precipitazioni sono iniziate quando questo surnatante è stato.......
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Discussione
A causa dell'indisponibilità dell'esatta sequenza genica di sFE, la sFE attualmente utilizzata è stata estratta da S. nudus14 fresco. Inoltre, le procedure di purificazione di sFE riportate in letteratura erano complicate e costose, in quanto basate su alcune caratteristiche generali di sFE, come il peso molecolare, il punto isoelettrico, la forza ionica e la polarità15,16. Nessun protocollo di purificazione di affinità di sFE è s.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.
Ringraziamenti
Questa ricerca è stata finanziata dall'Ufficio per la scienza e la tecnologia della città di Xiamen (3502Z20227197) e dall'Ufficio per la scienza e la tecnologia della provincia del Fujian (n. 2019J01070, n. 2021Y0027).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 30% Acrilammide-Bisacrilammide (29:1) | Biosharp | ||
| 2-Mercaptoetanolo | Solarbio | ||
| Agarosio G-10 | Biowest | ||
| Persolfato di ammonio | SINOPHARM | ||
| Solfato di ammonio | SINOPHARM | ||
| Arginina-Sefarosio 4B | Solarbio | Matrice di arginina-agarosio | |
| Bromoxylenol Blue (BPB) | Solarbio | ||
| Fast Silver Stain Kit | Beyotime | ||
| Fibrinogeno | Merck | ||
| Glicina | Solarbio | ||
| Acido cloridrico | SINOPHARM | ||
| Kinase | RHAWN | ||
| Lisina-Sefarosio 4B | Solarbio | di lisina-agarosio | |
| N,N,N',N'-Tetrametiletilendiammina (TEMED) | Sigma-Aldrich | ||
| Prestained Color Protein Marker (10-170 kD) | Beyotime | ||
| Cloruro di sodio | SINOPHARM | ||
| Dodecil solfonato di sodio (SDS) | Sigma-Aldrich | ||
| Idrossido di | sodioSINOPHARM | ||
| Trombina | Meilunbio | ||
| Tris (Idrossimetil) Amminometano | Solarbio | ||
| Tris (Idrossimetil) Amminometano cloridrato | Solarbio | ||
| Equipment | |||
| AKT Sistema di purificazione delle proteine puro | GE | ||
| Sterilizzatore automatico a vapore a pressione verticale MLS-3750 | SANYO | ||
| Sistema di imaging a chemiluminescenza | GE | ||
| Pompa a flusso costante BT-100 | QITE Incubatore | ||
| temperatura costante | JINGHONG | ||
| Centrifuga refrigerata da tavolo 3-30KS Forno di | |||
| DHG DGG-9140AD | SENXIN | ||
| Omogeneizzatore elettrico in vetro DY89-II | SCIENTZ | ||
| Bilancia analitica elettronica | DENVER | ||
| Bagno d'acqua elettrotermostatico DK-S12 | SENXIN | ||
| Agitatore di decolorazione orizzontale | Kylin-Bell | ||
| Macchina per il ghiaccio AF 103 | Scotsman | ||
| KQ-500E Pulitore ad ultrasuoni | Agitatore magnetico ShuMei | ||
| Centrifuga | |||
| refrigerata H1650-W | Cence | ||
| Forno a microonde | Galanz | ||
| Milli-Q Riferimento | Millipore | ||
| Pipettore | Thermo Fisher Scientific | ||
| Misuratore di pH da tavolo | di precisione Sartorious | ||
| Oscillatore a vortice di piccole dimensioni | Kylin-Bell | ||
| Bio-Rad | |||
| Materiale di consumo 200 | |||
| µ L Provetta PCR (200 µ L) | Axygene | ||
| (1,5 mL) | Biosharp | ||
| (5 mL) | Biosharp | ||
| (50 mL) | Provetta | ||
| (7 mL) | Biosharp | ||
| (60 mm) | Membrana | ||
| (0,22 &; micro); m) | Millex GP | ||
| Parafilm Bemis | |||
| (1 mL | Puntale per pipetta KIRGEN | ||
| (10 &; micro; L) | Axygene | ||
| (200 &; micro; L) | Axygene | ||
| filtrante ultra centrifuga TZAKZY | |||
| (4 mL 3 KDa) | |||
Riferimenti
- Rosell, A., et al. Patients with COVID-19 have elevated levels of circulating extracellular vesicle tissue factor activity that is associated with severity and mortality-brief report. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 41 (2), 878-882 (2021).
- Schultz, N. H., et al.
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Ristampe e permessi
