Articolo metodologico

Screening della sensibilità ai farmaci sferoidi nelle linee cellulari staminali di glioma

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DOI:

10.3791/65655

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2 febbraio 2024

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1Division of Oncology, Children’s Hospital of Philadelphia, 2Department of Pediatrics, Perelman School of Medicine at the University of Pennsylvania, 3School of Medicine, University of Pennsylvania

In questo articolo

Sommario

Gli screening in vitro della sensibilità ai farmaci sono strumenti importanti per scoprire combinazioni di farmaci antitumorali. Le cellule coltivate in sfere attivano diverse vie di segnalazione e sono considerate più rappresentative dei modelli in vivo rispetto alle linee cellulari monostrato. Questo protocollo descrive un metodo per lo screening farmacologico in vitro per linee sferoidi.

Abstract

Gli screening in vitro della sensibilità ai farmaci sono strumenti importanti per la scoperta di terapie combinate di farmaci antitumorali. Tipicamente, questi screening farmacologici in vitro vengono eseguiti su cellule coltivate in un monostrato. Tuttavia, questi modelli bidimensionali (2D) sono considerati meno accurati rispetto ai modelli tridimensionali (3D) di cellule sferoidali; Ciò è particolarmente vero per le linee di cellule staminali di glioma. Le cellule coltivate in sfere attivano diverse vie di segnalazione e sono considerate più rappresentative dei modelli in vivo rispetto alle linee cellulari monostrato. Questo protocollo descrive un metodo per lo screening farmacologico in vitro di linee sferoidali; Come esempio vengono utilizzate linee di cellule staminali di glioma umano e di topo. Questo protocollo descrive un saggio 3D di sensibilità e sinergia dei farmaci sferoidi che può essere utilizzato per determinare se un farmaco o una combinazione di farmaci induce la morte cellulare e se due farmaci si sinergizzano. Le linee di cellule staminali di glioma vengono modificate per esprimere RFP. Le celle sono placcate in 96 piastre a fondo rotondo a pozzetto a basso attacco e le sfere possono formarsi durante la notte. Vengono aggiunti farmaci e la crescita viene monitorata misurando il segnale RFP nel tempo utilizzando il sistema di imaging dal vivo Incucyte, un microscopio a fluorescenza incorporato nell'incubatore di coltura tissutale. La concentrazione inibitoria semimassima (IC50), la dose letale mediana (LD50) e il punteggio di sinergia vengono successivamente calcolati per valutare la sensibilità ai farmaci da soli o in combinazione. La natura tridimensionale di questo test fornisce una riflessione più accurata della crescita tumorale, del comportamento e della sensibilità ai farmaci in vivo, costituendo così la base per ulteriori indagini precliniche.

Introduzione

Il glioblastoma è una neoplasia cerebrale devastante di alto grado con una sopravvivenza globale a cinque annidel 5% 1. I gliomi di alto grado (HGG) come il glioblastoma rappresentano la principale causa di mortalità correlata al cancro nella popolazione pediatrica2 e sono uno dei tumori più recalcitranti da trattare anche negli adulti3. Nonostante i significativi progressi nella nostra comprensione dei driver molecolari dell'HGG, le opzioni di trattamentorimangono limitate, sottolineando la necessità di metodi di screening farmacologico che prevedano in modo più accurato le sensibilità terapeutiche in clinica.

Le colture cellulari 3D sono state utilizzate principalmente per la modellazione del comportamento cellulare fisiologicamente rilevante4. Inoltre, l'architettura 3D del microambiente tumorale può essere ricapitolata in vitro stabilendo saggi di crescita 3D5. La crescita degli sferoidi attiva anche diverse vie di segnalazione ed è quindi considerata più rappresentativa dei modelli in vivo 6,7 rispetto alla coltura 2D. Le cellule staminali pediatriche HGG e le nostre linee di cellule staminali di glioma NF1 di topo crescono naturalmente come neurosfere e hanno utilizzato queste linee cellulari di glioma NF1 di topo in uno screening farmacologico a media produttività8. Le linee pediatriche qui utilizzate sono derivate da HGG pediatriche emisferiche, della linea mediana e cerebellari e sono state acquisite e completamente caratterizzate dal Children's Brain Tumor Network (profili di mutazione e espressione genica)9. Queste linee sono state modificate per esprimere una proteina fluorescente rossa nucleare (RFP), che consente il monitoraggio della proliferazione e della sopravvivenza utilizzando il sistema di imaging live Incucyte. L'intensità del segnale RFP è rappresentativa del numero di celle presenti. Potrebbero essere utilizzati anche altri fluorofori, come la proteina fluorescente verde (GFP).

La chemioterapia combinata per la leucemia linfoblastica acuta infantile, i linfomi, le neoplasie epiteliali e molti altri tumori è un modo efficace per eradicare i tumori e prevenire la resistenza ai farmaci ai singoli agenti10,11. Tuttavia, ci sono informazioni limitate su quali agenti combinare per ottenere sensibilità terapeutiche nell'HGG, incoraggiando l'uso di modelli di sferoidi più accurati nei test farmacologici in vitro.

Protocollo

Tutte le procedure del protocollo sono state approvate dal Children's Hospital of Philadelphia Institutional Review Board (IRB).

1. 3D placcatura di celle sferoidi

  1. Preparare i terreni di base delle cellule staminali del glioma: per creare i terreni di base, aggiungere 50 ml di integratore di proliferazione e 5 ml di una soluzione 100x di penicillina-streptomicina (10.000 U/mL) al terreno basale (500 ml). Per produrre terreni di coltura con cellule staminali di glioma, aggiungere il fattore di crescita epidermico (EGF) e il fattore di crescita dei fibroblasti basici (bFGF) a una concentrazione finale di 20 ng/mL e 10 ng/mL, rispettivamente, secondo la descrizione del produttore.
    NOTA: I terreni di coltura con cellule staminali di glioma possono essere utilizzati per 1 settimana se conservati a 4 °C.
  2. Dissociare le cellule che esprimono RFP:
    NOTA: In questo esempio, viene utilizzata la linea di cellule staminali NF1 HGG di topo 5746.
    1. Trasferire le sfere di glioma in una provetta conica da 15 ml e centrifugare le sfere di glioma in una centrifuga (150 x g per 5 minuti). Rimuovere il surnatante e aggiungere 300 μl di accutasi alle sfere dissociate (incubare per 5 minuti a 37 °C).
    2. Aggiungere 1 mL di terreno di coltura con cellule staminali di glioma e disgregare le sfere mediante pipettaggio delicato. Centrifugare le cellule dissociate per 5 minuti a 150 x g, aspirare il surnatante e sciogliere il pellet in 1 mL di terreno di coltura di cellule staminali di glioma.
  3. Misurare la concentrazione di cellule utilizzando un contatore di cellule o un emocitometro. Quando si utilizza un contatore di cellule a fluorescenza, aggiungere 18 μl di sospensione cellulare a 2 μl di colorazione di arancio acridina/ioduro di propidio. Caricare 12 μl di questa sospensione in un emocitometro per contare il numero di cellule vive/morte presenti nella sospensione.
  4. Diluire le cellule a una concentrazione finale di 2.000 cellule per 100 μL di terreno di coltura staminale del glioma.
    NOTA: Le modifiche alla concentrazione cellulare possono dipendere dalla linea cellulare e possono essere regolate di conseguenza.
  5. Utilizzando una pipetta multicanale, erogare 100 μl di sospensione cellulare (2.000 cellule per 100 μl) in ciascun pozzetto di una piastra di attacco inferiore rotonda a fondo basso a 96 pozzetti mediante pipettaggio inverso.
    NOTA: Utilizzare piastre di fissaggio basse a fondo tondo; Queste piastre stimoleranno la formazione di una singola sfera di glioma in ogni pozzetto. Il pipettaggio inverso evita la formazione di bolle, che interferiscono con l'acquisizione delle immagini del sistema di analisi delle cellule vive.
  6. Centrifugare le piastre a 150 x g per 5 min.
    NOTA: La centrifugazione è un passaggio fondamentale per avviare la formazione della neurosfera 3D.
  7. Incubare durante la notte per consentire la formazione di una singola sfera in ogni pozzetto.

2. Aggiunta di farmaci per il saggio di sinergia (Figura 1)

  1. Assicurarsi che ogni pozzetto della piastra a 96 pozzetti riceva una concentrazione specifica di entrambi i farmaci 1 e 2. Crea una griglia in cui ogni concentrazione di farmaco 1 viene combinata con ogni concentrazione di farmaco 2 in duplicato.
  2. Effettuare una diluizione seriale dei due farmaci per i quali verrà determinata la sinergia (5 diluizioni del farmaco 1 e 7 diluizioni del farmaco 2) utilizzando i terreni delle cellule staminali del glioma (Figura 1A).
    NOTA: In questo studio viene utilizzata una serie di diluizioni seriali al 50%; Tuttavia, è possibile utilizzare qualsiasi serie di diluizione.
    1. La serie di diluizione dovrebbe essere 7 volte più concentrata della concentrazione finale desiderata in ciascun pozzetto. Ad esempio, se la concentrazione finale più alta per il farmaco 1 è 1 μM, effettuare la prima concentrazione della serie di diluizione per il farmaco 1, 7 μM (1 mL, provetta B o I nella Figura 1A).
    2. Aggiungere 500 μl di terreno di coltura con cellule staminali di glioma a ciascuna provetta aggiuntiva della serie di diluizione (provette C-H e J-M, come mostrato nella Figura 1).
    3. Per creare la serie di diluizione, aspirare 500 μl della miscela di farmaci dalla provetta B o dalla provetta I e aggiungerla alla provetta successiva nella serie di diluizioni rispettivamente nella provetta C o nella provetta J (contenente 500 μl di terreno di coltura con cellule staminali di glioma). Mescolare bene e ripetere l'operazione con la provetta successiva della serie di diluizione. Effettuare un controllo DMSO (Tubo A) e assicurarsi che la concentrazione di DMSO sia la stessa in tutte le condizioni.
      NOTA: È possibile apportare modifiche alle concentrazioni dei farmaci e alle serie di diluizione. Assicurati di elencare le concentrazioni corrette del farmaco nel file supplementare 1 se la serie di diluizioni viene modificata.
  3. A ciascun pozzetto delle piastre da 96 pozzetti, aggiungere 20 μL di farmaco 1 e 20 μL di farmaco 2 mediante pipettaggio inverso, come mostrato nella Figura 1B, per un volume finale di 140 μL per pozzetto; Le combinazioni di farmaci sono valutate in duplice copia. Se si utilizza l'analisi a valle fornita per IC50 e LD50, utilizzare il layout del farmaco come mostrato nella Figura 1B.
    1. In questo test, viene misurato anche l'effetto di ciascun farmaco da solo (senza che l'altro farmaco sia presente). Assicurarsi di aggiungere 20 μl di terreno di controllo DMSO (provetta A nella Figura 1B) a quei singoli pozzetti di farmaco per portare il volume finale di ciascun pozzetto a 140 μl.
    2. Assicurarsi che i pozzetti non contengano bolle, poiché ciò influirà sull'imaging.
      NOTA: È possibile apportare modifiche al volume finale; Tuttavia, assicurarsi di regolare le concentrazioni di cui al punto 2.2.
  4. Posiziona le piastre nell'imager live e monitora la crescita di ciascuna sfera in ogni pozzetto utilizzando il modulo sferoide, l'impostazione della sfera singola, l'imaging sia in campo chiaro che RFP con ingrandimento 4x.
  5. Monitorare le piastre per 72 ore, visualizzando ogni pozzetto della piastra a un intervallo di tempo regolare, in genere 2 ore.
    NOTA: Carica una mappa delle piastre corretta; ciò garantirà un'adeguata analisi a valle (Figura 1C).

3. Calcolo di IC50, LD50 e punteggio di sinergia (Figura 2 e Figura 3)

  1. Analizza l'intensità della RFP per ogni pozzetto e ogni punto temporale utilizzando il software live imager. I parametri di analisi utilizzati sono elencati nei file supplementari (File supplementare 2).
    NOTA: A seconda delle preferenze, è possibile utilizzare diversi parametri di analisi.
  2. Esportare i dati RFP come intensità RFP integrata totale rossa per ciascun pozzo, assicurandosi di esportare i dati grezzi non raggruppati (Figura 2A).
    NOTA: Se si utilizza il modello fornito (File supplementare 1) per calcolare IC50 e LD50, è essenziale attenersi al punto 3.2
  3. Determinare la media e la deviazione standard per ciascuna combinazione di farmaci di (1) la variazione della piega rispetto al solo DMSO (per questo calcolo, i valori di 0 h non sono necessari) e (2) il Log2 della variazione della riduzione rispetto a 0 h incollando i dati grezzi nel foglio excel fornito (Figura 2B e vedere l'esempio nel File supplementare 1).
  4. Regolare la concentrazione massima dei farmaci 1 e 2 nel foglio di calcolo (Figura 2B).
    NOTA: Assicurarsi di regolare le concentrazioni dei farmaci 1 e 2; in caso contrario, verranno calcolati valori LD50 e IC50 errati.
  5. Calcola i valori IC50 utilizzando un'applicazione software di analisi dei dati appropriata (qui viene utilizzato GraphPad). Per il calcolo del valore IC50, utilizzare la variazione media della piega e la variazione della piega della deviazione standard rispetto al DMSO determinato solo nel passaggio 3.4 e copiare le tabelle IC50 dei farmaci 1 e 2 nel software di analisi dei dati (Log(inibitore) vs. risposta normalizzata, pendenza variabile) (Figura 3A).
    1. Utilizzare solo i dati dei pozzi a cui è stato aggiunto un singolo composto per i calcoli IC50. Utilizzare i valori di concentrazione del farmaco Log nel software di analisi dei dati, che vengono calcolati automaticamente nel foglio di calcolo fornito.
  6. Calcola il punteggio di sinergia:
    1. Utilizza la variazione media della piega rispetto al DMSO solo di ogni combinazione per calcolare il punteggio di sinergia utilizzando un pacchetto software o un sito web. Ad esempio, https://synergyfinder.fimm.fi/ 12 (parametri: adattamento della curva LL4, metodo ZIP per il calcolo del punteggio di sinergia). Il File supplementare 1 calcola automaticamente i valori necessari per creare la tabella di input delle sinergie che può essere caricata su SynergyFinder (Figura 3B). Un esempio della tabella di input delle sinergie è fornito nel File supplementare 3.
      NOTA: Un punteggio superiore a 10 denota sinergia, uno inferiore a -10 denota antagonismo e un valore compreso tra -10 e 10 mostra effetti additivi.
  7. Calcola il punteggio LD50:
    1. Per ogni concentrazione di farmaco 1, calcolare la LD50 del farmaco 2. Il file supplementare calcola automaticamente il valore Log2 e la deviazione standard per ogni concentrazione (Figura 3C).
    2. Inserire la media e la deviazione standard della variazione della piega Log2 rispetto a 0 h, nonché il numero di repliche nel software di analisi dei dati (in questo studio, 2,) e calcolare il valore LD50 e la deviazione standard LD50 determinando la concentrazione a -1 (Log2 = -1 rappresenta il valore log2 per il quale il 50% del segnale viene perso rispetto a 0 h). In questi calcoli, utilizzare il modello di parametri Log(inibitore) rispetto alla risposta, pendenza variabile 4.
      NOTA: Il software di analisi dei dati non calcola automaticamente la concentrazione del farmaco corrispondente a un valore log2 = -1; tuttavia, questo valore può essere aggiunto ai calcoli riportati dal software di analisi dei dati come equazione definita dall'utente (Figura 3C). Assicurati di utilizzare i valori di concentrazione del log nel software di analisi dei dati, che vengono calcolati automaticamente nel foglio di calcolo fornito. Il file supplementare 4 mostra i pannelli IC50 e LD50 nel software GraphPad.

Risultati

Ad esempio, è stata valutata la sinergia di Trametinib (inibitore di MEK) e GDC-0941 (inibitore di PI3K), che inibiscono due vie effettrici a valle di RAS nella linea di cellule staminali di glioma di topo 5746 (espressione di RFP) (Figura 4). La Figura 4A mostra la stessa sfera a 0 h e 72 h trattata con una combinazione di Trametinib e GDC-0941. Queste immagini sono state esportate direttamente dal software live imager. IC50 e LD50 sono stati calcolati come descritto in GraphPad (Figura 4B, D), la sinergia è stata calcolata utilizzando SynergyFinder (Figura 4C). La Figura 4B mostra l'output per i calcoli IC50; I valori di LogIC50, Hillslope e IC50 sono mostrati per entrambi i farmaci, così come l'intervallo di confidenza del 95% e la bontà dell'adattamento. La Figura 4C mostra la curva dose-risposta per ciascun farmaco da solo (concentrazione del farmaco rispetto alla percentuale di inibizione), una matrice codificata a colori che mostra la percentuale di inibizione della crescita per ciascuna combinazione di farmaci e un grafico 3D del punteggio di sinergia tra i due farmaci, in questo caso, il punteggio di sinergia è 22,356. La Figura 4D mostra l'output per i valori di LD50 dei farmaci da soli o in combinazione. Di importanza sono i valori LogLD50 e LD50 e i rispettivi intervalli di confidenza del 95%. Come previsto, le LD50 per Trametinib sono inferiori con concentrazioni di GDC-0941 più basse. È importante ricordare che LD50 è un marcatore di morte cellulare e denota il 50% di morte cellulare rispetto al punto di partenza del test.

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Figura 1: Impostazione di una piastra a 96 pozzetti con sinergia a 2 farmaci. (A) Rappresentazione schematica della serie di diluizione 1/2 dei farmaci 1 e 2. Le concentrazioni di farmaco devono essere 7 volte superiori alla concentrazione finale in ciascun pozzetto. (B) Immagine del punto 0 h di una piastra a 96 pozzetti con 5746 sfere RFP. Ad ogni riga viene aggiunta la serie di diluizioni del farmaco 1 come indicato per un totale di 7 diluizioni e un controllo DMSO. La serie di diluizioni Drug 2 viene aggiunta ogni volta a 2 colonne come indicato per un totale di 5 diluizioni e un controllo DMSO. (C) Esempio della mappa delle lastre caricata nel software live imager. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 2: Esportazione dei dati acquisiti. (A) Dopo 72 ore di misurazioni, l'intensità totale dell'oggetto rosso integrato viene esportata per ogni pozzo e per ogni punto temporale. Il raggruppamento è impostato su Nessuno. Per le opzioni di esportazione (a destra), scegliere Organizza per repliche e Destinazione negli Appunti. (B) Incollare i dati esportati nella cella indicata del foglio di calcolo (File supplementare 1). Aggiornare la concentrazione più alta per ogni farmaco come indicato. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 3: Elaborazione dei dati acquisiti. (A) Tabelle di input IC50 che possono essere copiate nel software di analisi dei dati per l'analisi (File supplementare 4, pannello IC50). Queste tabelle vengono generate automaticamente nel file supplementare 1. (B) È possibile generare una tabella di input di sinergia per il programma SynergyFinder copiando la tabella di fattibilità nel file supplementare 3. Questo file viene caricato su https://synergyfinder.fimm.fi/ con le selezioni indicate. Il punteggio e la matrice di sinergia vengono calcolati automaticamente. (C) Tabelle di input LD50 che possono essere copiate nel software di analisi dei dati (File supplementare 4, pannello LD50) per l'analisi. Queste tabelle vengono generate automaticamente nel file supplementare 1. La parte inferiore mostra come l'LD50 è stato aggiunto ai valori riportati nel software di analisi dei dati. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 4: Esempio di risultati di uno studio sinergico di Trametinib e GDC-0941 in 5746 sfere di cellule staminali di glioma. (A) Immagine a 0 h e 72 h dopo il trattamento di una sfera RFP 5746 trattata con 10 nM di Trametinib e 1000 nM GDC-0941. (B) Output dei calcoli IC50 che mostrano il valore IC50 e la deviazione standard dell'IC50. (C) Output del programma SynergyFinder. A sinistra: curve di inibizione, al centro: tabella delle percentuali di inibizione, a destra: mappa di sinergia che mostra che Trametinib e GDC-0941 hanno un punteggio di sinergia di 22,3. (D) Output dei calcoli della LD50, che mostra i valori della LD50 e la deviazione standard calcolata sulla LD50. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

File supplementare 1: Parametri utilizzati per analizzare il segnale RFP nell'incucitato. Clicca qui per scaricare questo file.

File supplementare 2: foglio di calcolo in cui vengono elaborati i dati generati e vengono generate le tabelle di input per GraphPad e SynergyFinder. Clicca qui per scaricare questo file.

File supplementare 3: Foglio di calcolo della tabella di input di SynergyFinder. Clicca qui per scaricare questo file.

File supplementare 4: File GraphPad per calcolare i valori IC50 e LD50 Fare clic qui per scaricare questo file.

Discussione

Questo protocollo descrive i saggi 3D di screening farmacologico che sono stati efficacemente utilizzati per valutare le vulnerabilità ai farmaci in modelli sferoidi di glioma8. Questo sistema di analisi 3D degli sferoidi è stato specificamente progettato per consentire un'indagine preclinica più accurata delle chemioterapie combinatorie per le linee cellulari di glioma coltivate in sfere. Per l'HGG, questo metodo fornisce un quadro di riferimento per identificare le potenziali vulnerabilità ai farmaci per questa malattia devastante. Tuttavia, le potenziali applicazioni di questo sistema non si limitano al glioma e questo protocollo può essere utilizzato per valutare nuove terapie in modelli 3D di varie altre condizioni.

L'obiettivo di questo studio è migliorare la prevedibilità degli screening farmacologici in vitro per dare priorità a quelle combinazioni di farmaci che hanno la più alta probabilità di successo negli studi preclinici e, infine, in clinica. Soprattutto nel glioma, l'identificazione di potenti combinazioni di farmaci utilizzando screening farmacologici in vitro che si traducono bene in clinica è rimasta limitata. Ciò è in parte dovuto all'uso di linee cellulari di glioma cresciute con siero meno ideali13, all'uso di saggi monostrato 2D4 e a un focus sui valori IC50 (crescita ridotta del 50%) anziché su LD50 (50% in meno di cellule rispetto all'inizio del test)14. I saggi in vitro di crescita sferoidale delle cellule staminali del glioma vengono utilizzati per dare priorità alle combinazioni di farmaci da valutare nei nostri modelli preclinici. Nella nostra prioritizzazione delle combinazioni di farmaci, vengono prese in considerazione alcune misure: 1) bassi valori di LD50, un focus sulla morte cellulare piuttosto che sulla ridotta proliferazione aumenta il potenziale di successo; 2) Idealmente, questi valori di LD50 sono inferiori al valore Cmax, la concentrazione sierica massima che può essere raggiunta in sicurezza durante gli studi farmacocinetici sui farmaci per gli studi clinici, se disponibile; 3) Un alto punteggio di sinergia, se entrambi i farmaci lavorano in sinergia, ciò indica una cooperazione meccanicistica tra i due farmaci. Sebbene quest'ultimo punto non sia necessario per identificare potenti combinazioni di farmaci, la sinergia può migliorare l'efficacia dei farmaci senza aumentare la tossicità dei farmaci.

È importante sottolineare che le valutazioni in vitro della sensibilità ai farmaci rimangono uno strumento importante per scoprire nuove terapie o combinazioni di farmaci in grado di ridurre i tumori. Il protocollo qui presentato ci consente di determinare la sensibilità e la sinergia dei farmaci con un sistema di saggio di crescita sferoidale 3D che può essere utilizzato per dare priorità alle combinazioni di farmaci da valutare nei modelli preclinici.

Il protocollo prevede diversi passaggi critici. Stiamo misurando la crescita di singole colonie in ogni pozzetto di una piastra a 96 pozzetti. L'uso di piastre a pozzetto a fondo tondo a basso attacco è fondamentale per garantire che le cellule non si attacchino al pozzetto e che la formazione della sfera sia stimolata. Il pozzetto inferiore rotondo assicura che la singola sfera si trovi sempre nello stesso punto della piastra a 96 pozzetti.

Dopo aver galvanizzato le celle, le piastre devono essere centrifugate per garantire che tutte le celle piatte si uniscano nel punto più basso del pozzetto del fondo rotondo e che si formi un'unica sfera 3D. Il volume totale di ciascun pozzetto deve essere di 140 μl. Ciò garantirà le corrette concentrazioni finali dei rispettivi farmaci in ciascun pozzetto.

Quando si pipetta nella piastra a 96 pozzetti, utilizzare la tecnica del pipettaggio inverso, che riduce il rischio di generare bolle d'aria nei pozzetti. Le bolle d'aria impediscono all'imager in tempo reale di visualizzare correttamente ogni pozzetto e l'intensità della fluorescenza non sarà corretta, influenzando l'analisi a valle dei risultati.

Il layout delle targhe e i fogli di calcolo forniti sono specifici per il protocollo descritto. Se ci si discosta dalla placcatura, verranno calcolati i valori IC50 e LD50 errati. Il foglio di calcolo calcola automaticamente le diluizioni quando viene fornita la concentrazione più alta. Per ogni esperimento, aggiornare la concentrazione più alta, altrimenti verranno calcolati valori IC50 e LD50 errati.

Graphpad utilizza le concentrazioni logaritmiche per calcolare i valori IC50 e LD50. Queste concentrazioni logaritmiche vengono calcolate automaticamente nel foglio di calcolo fornito e possono essere copiate direttamente nel software. Il mancato utilizzo di concentrazioni logaritmiche comporterà valori IC50 e LD50 errati.

Stiamo usando linee cellulari che crescono naturalmente come sfere. Si possono forzare le cellule aderenti in una sfera usando questo protocollo; Tuttavia, non è garantito che saranno in grado di proliferare. Il numero di cellule piastrate in ciascun pozzetto può dipendere dalla linea cellulare e fare affidamento sulle caratteristiche di crescita uniche delle singole linee cellulari, che possono essere facilmente regolate. Le curve di diluizione proposte sono solo suggerimenti. È possibile apportare modifiche alle concentrazioni dei farmaci e alle serie di diluizione. Tuttavia, è importante elencare le corrette concentrazioni di farmaco nel file supplementare 1 se la serie di diluizione viene modificata; in caso contrario, i valori IC50 e LD50 calcolati non saranno corretti. Si può scegliere di utilizzare una diversa disposizione delle piastre; Ad esempio, utilizzare solo una replica anziché due. A tale scopo, l'utente deve aggiornare il foglio di calcolo in modo che rifletta questa modifica.

Dopo la placcatura, in rare occasioni si formano più sfere 3D in un unico pozzetto. In tal caso, la ripetizione della fase di centrifugazione (150 x g) provoca la fusione di queste sfere in un'unica sfera. Se viene commesso un errore di placcatura, con conseguente diversa disposizione delle piastre, il foglio di calcolo fornito può essere modificato per riflettere la nuova mappa delle piastre. Se un punto dati è un valore anomalo e deve essere rimosso dall'analisi, il foglio di calcolo fornito può essere aggiornato.

Il limite principale di questo sistema è che utilizza linee cellulari cresciute naturalmente come sfere e non linee aderenti cresciute in monostrati. Se le linee cellulari non sono in grado di formare sfere, è necessario utilizzare i tradizionali saggi di proliferazione 2D. Il vantaggio dell'utilizzo di saggi di crescita 3D simili a organoidi come questo rispetto ai monostrati 2D convenzionali è che l'architettura e le vie di segnalazione attivate riflettono più accuratamente quelle osservate nei modelli in vivo di malattie umane, sottolineando il potenziale traduzionale e l'applicabilità di questi metodi.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Provette per centrifugazione da 15 mLCELLTREAT229411Provette da centrifuga in polipropilene da 15 mL, piastra sterile
96 pozzettiS-bioMS9096UZPiastra di fissaggio ultrabassa a fondo tondo a 96 pozzetti
AccutaseSTEMCELL Technologies7922Soluzione per il distacco cellulare
Acridina Colorazione di ioduro di arancio/propidioLogos BiosystemsF23001Vivo/morto colorante per conta cellulare
bFGFSTEMCELL Technologies78003.2bFGF ricombinante umano
Loghi BiosystemsL20001LUNA-FL Contatore di cellule a doppia fluorescenza
CentrifugaEppendorf5810RCentrifugazione di cellule e piastre
DMSOPierce20688solvente per composti
EGFSTEMCELL Tecnologie78006.2Provette Eppendorf EGF ricombinanti
umane Costar07-200-534Provette per microcentrifuga
ExcelMicrosoftMicrosoft excel
GDC-0941SelleckchemS1065Farmaco 1
GraphPadGraphPadGraphPad Prism 9IC50 e LD50
BiosystemsLGBD10008Luna PhotonSlide
IncucyteSartoriusS3incorporato nell'incubatore per colture tissutali che visualizza ogni pozzetto a intervalli di tempo specifici.
Software per incucitiSartoriusIncucyte 2022BAnalisi dei dati di proliferazione
MediaSTEMCELL Technologies5702Kit di proliferazione NeuroCult (Topo e Ratto) contenente terreno basale e integratore per la crescita
Penicillina-Streptomicina Gibco15140122Antibiotici da aggiungere ai terreni
TrametinibSelleckchemS2673Farmaco 2
a Contatore di cellule Calcolo dei loghi degli emocitometri Microscopio a fluorescenza

Riferimenti

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