Diagnosi rapida basata sulla reazione a catena della polimerasi quantitativa (qPCR) dell'infezione da Helicobacter pylori e della resistenza agli antibiotici

H. pylori è un batterio gram-negativo a forma di spirale, altamente mobile, che vive principalmente nella regione del piloro dello stomaco¹. È un agente patogeno comune che infetta quasi il 50% della popolazione mondiale². La maggior parte delle persone con infezione da H. pylori non ha manifestazioni cliniche e la maggior parte sviluppa diverse malattie dopo diversi anni di infezione, tra cui gastrite cronica, ulcere peptiche, ulcere gastriche e cancro gastrico³. In diversi studi basati su diverse popolazioni, l'efficacia dell'eliminazione di H. pylori per prevenire il cancro allo stomaco e le lesioni precancerose è stata dimostrata ^4,5. Pertanto, l'Agenzia internazionale per la ricerca sul cancro dell'Organizzazione mondiale della sanità (OMS) ha consigliato l'eradicazione di H. pylori come misura preventiva⁶.

L'uso di metodi non invasivi per identificare l'infezione da H. pylori è una componente chiave del trattamento per la maggior parte delle persone con dispepsia asintomatica. Il test del respiro dell'urea (UBT), il test dell'antigene fecale H. pylori (SAT) e il test sierologico sono tecniche non invasive popolari. Tra queste, l'UBT è la procedura meno intrusiva e più accurata disponibile. UBT utilizza l'ureasi, abbondantemente presente in H. pylori, per idrolizzare l'urea marcata isotopicamente in ammoniaca e anidride carbonica (13C o 14C). Al contrario, il saggio immunocromatografico (ICA)⁷ è conveniente, semplice e non invasivo per il campionamento. Tuttavia, l'accuratezza del test è influenzata da diversi fattori, come la qualità del campione di feci, la temperatura e l'intervallo tra la raccolta del campione e il test. Un altro test basato sulla risposta immunitaria è il test degli anticorpi sierici H. pylori , che rileva gli anticorpi nel siero di un paziente. Tuttavia, questo test non è adatto per l'analisi post-trattamento poiché gli anticorpi rimangono a lungo dopo che i batteri sono stati eliminati⁸. Un altro grande svantaggio è che questi metodi diagnosticano solo l'infezione da H. pylori e non consentono test di resistenza ai farmaci per guidare il trattamento basato sulla sensibilità.

Per i metodi di test invasivi, il tessuto bioptico gastrico deve essere prelevato mediante endoscopia e quindi sottoposto a istologia, test rapido dell'ureasi e coltura batterica. Questi metodi di test sono anche molto limitati a causa di diversi fattori. Attualmente, queste tecniche sono limitate ai pazienti anziani, ai pazienti ad alto rischio di malattia precancerosa o maligna e ai pazienti che hanno fallito la terapia di prima linea per la malattia da reflusso gastroesofageo o l'infezione da H. pylori ⁹. In secondo luogo, a causa delle caratteristiche di crescita uniche di H. pylori, il tasso di successo della coltura batterica raggiunge solo il 50%¹⁰. Pertanto, i metodi di rilevamento molecolare offrono nuove speranze per superare le elevate esigenze dei metodi di rilevamento invasivi e guidare il trattamento basato sulla sensibilità. Tra i metodi di rilevamento molecolare, la PCR quantitativa si è evoluta enormemente negli ultimi anni. La qPCR, a differenza della PCR tradizionale, non richiede elettroforesi su gel e quantifica accuratamente il DNA/RNA nei campioni aggiungendo primer e sonde nella fase di ricottura. I kit qPCR per il rilevamento dell'infezione da H. pylori e della resistenza ai farmaci sono ora disponibili in commercio. Tuttavia, ogni metodo ha i suoi limiti; Pertanto, la diagnosi clinica e il trattamento di un paziente devono essere considerati in combinazione con i sintomi, i segni, la storia, altri test di laboratorio e la risposta al trattamento.

Attualmente, il metodo principale di trattamento delle infezioni da H.pylori sta assumendo antibiotici, ma ultimamente sta diventando sempre più difficile trattare queste infezioni a causa dell'aumento della resistenza agli antibiotici. Successivamente, un calo significativo dell'efficacia del trattamento con H. pylori è stato osservato a livello globale, rendendo l'eradicazione di H. pylori un importante problema di salute pubblica¹¹.

Claritromicina e levofloxacina sono i due antibiotici ad ampio spettro usati per trattare le infezioni causate da H.pylori, ma diversi studi hanno riportato una diffusa resistenza contro questi due farmaci negli isolati di H.pylori. A2143G, A2142G e A2142C sono tre delle numerose mutazioni puntiformi trovate nel gene rRNA 2.9 kb 23S che provocano la resistenza alla claritromicina impedendo al macrolide di legarsi. Allo stesso tempo, i loci di mutazione del gene di resistenza alla levofloxacina sono localizzati principalmente nei sei siti di mutazione (A260T, C261A, T261G, G271A, G271T, A272G) del gene gyrA ¹². La scoperta di questi meccanismi di resistenza basati su mutazioni genetiche ha portato a un graduale spostamento nella rilevazione di H. pylori attraverso studi basati sulla cultura ai test molecolari.

Nel complesso, vi è un'urgente necessità clinica di un metodo diagnostico non invasivo, efficace e simultaneo per il rilevamento delle infezioni da H. pylori e della resistenza ai farmaci. Abbiamo adottato un test combinato di stringa e un metodo qPCR per superare le difficoltà di campionamento e raggiungere l'obiettivo della rilevazione simultanea dell'infezione da H. pylori e della resistenza ai farmaci utilizzando diverse sonde primer.

Il presente studio è stato condotto in conformità con le considerazioni etiche stabilite dal comitato etico del Guangdong Provincial People's Hospital, Southern Medical University, Guangzhou, Cina (numero di approvazione: KY-Q-2022-384-02). I pazienti di età compresa tra 18 e 60 anni sono stati inclusi in questo studio. I pazienti che assumevano antibiotici, farmaci antibatterici cinesi, farmaci come inibitori della pompa protonica (PPI) o antagonisti del recettore H 2, ecc., Entro₂ settimane prima del test non sono stati inclusi in questo studio. Anche i pazienti che avevano ricevuto un trattamento contro H.pylori negli ultimi 3 mesi sono stati esclusi da questo studio. Anche quelli con gravi problemi cardiaci, epatici, renali, neuropatia grave o malattia mentale non sono stati autorizzati a partecipare a questo studio. Non c'erano donne incinte e madri che allattavano incluse in questo studio. I dettagli delle forniture (reagenti, prodotti chimici, attrezzature e software) utilizzati in questo studio sono riportati nella tabella dei materiali.

1. Test di stringa per il campionamento del fluido gastrico

1. Chiedere al paziente di digiunare durante la notte prima della raccolta del campione.
2. Il giorno dopo, apri il kit di test della stringa, prendi la capsula e tieni premuto il cappio alla fine della stringa.
3. Fissare la corda sulla guancia del paziente e chiedere loro di posizionare la capsula sulla lingua vicino alla parte posteriore della gola e ingoiarlo con un sorso d'acqua.
4. Lasciare che la capsula venga sciolta nello stomaco del paziente, esponendo così la corda all'interno della capsula per assorbire il muco gastrico.
5. Chiedere a un assistente addestrato di estrarre la corda con attenzione 1 ora dopo che il paziente ha ingerito la capsula.
6. Tagliare l'estremità inferiore della corda (40 cm) imbevuta del liquido gastrico, inserirla nella soluzione di conservazione del campione TSE (Tris / soluzione salina / EDTA) e quindi inviarla al laboratorio clinico a temperatura ambiente (RT) per la successiva rilevazione di H. pylori e la determinazione dei profili di resistenza agli antibiotici mediante qPCR.

2. Estrazione del DNA

1. Posizionare le provette di raccolta per il trasporto dei campioni su una griglia per provette, opportunamente etichettata, e farle vortice per 10 secondi.
2. Capovolgere più volte la piastra a 32 pozzetti (kit di estrazione o purificazione degli acidi nucleici) per risospendere le sfere magnetiche. Dopo un breve vortice per 10 s, rimuovere con attenzione la sigillatura del foglio di alluminio dalla piastra.
3. Trasferire 200 μL di liquido gastrico da ciascun campione e dal DNA di H. pylori come controllo positivo nei pozzetti separati.
4. Posizionare la piastra a 32 pozzetti nella fessura di campionamento corrispondente della macchina per l'estrazione automatica del DNA.
5. Dopo l'estrazione e la conferma del DNA, iniziare il test di resistenza agli antibiotici per claritromicina e levofloxacina attraverso qPCR sui campioni positivi.
6. Posizionare il liquido gastrico in eccesso e i campioni di DNA estratti a -20 °C per la conservazione a lungo termine e l'uso futuro.
7. Eseguire tutti questi passaggi in un armadio di biosicurezza per evitare qualsiasi contaminazione.

3. qPCR per la rilevazione di H. pylori e resistenza agli antibiotici (claritromicina e levofloxacina)

1. Eseguire la qPCR per la rilevazione di H. pylori e delle sospette mutazioni di resistenza agli antibiotici nel suo genoma.
   1. Scongelare la miscela di reazione qPCR (kit di rilevamento dell'acido nucleico H. pylori ) sul ghiaccio e mescolarla sfiorando e ruotando per evitare qualsiasi perdita di reagente.
   2. Per ogni campione su una piastra a 32 pozzetti, mescolare 20 μL di miscela di reazione PCR (premiscela di reazione di genotipizzazione [contenente l'enzima Taq, il trifosfato desossiribonucleoside, il tampone di reazione e il cloruro di magnesio], con primer diretti e inversi di ureA e una sonda ureA ) e 5 μL del DNA estratto.
   3. Eseguire la piastra qPCR a 32 pozzetti sulla macchina qPCR. Programmare il termociclatore: la miscela di reazione verrà prima fatta reagire sequenzialmente a 42 °C e 95 °C (entrambi per un ciclo) per 2 minuti ciascuno; quindi, 40 cicli a 95 °C, denaturazione per 10 s, e ricottura ed estensione a 58 °C per 45 s.
   4. Impostare l'acquisizione del segnale di fluorescenza su FAM (H. pylori) e l'acquisizione dei dati sul periodo di estensione dell'amplificazione. Una volta completata la reazione, salvare i dati per l'analisi dei risultati futuri.
   5. Analizza i dati utilizzando un software specifico per qPCR, poiché lo strumento selezionerà automaticamente le soglie di base.
   6. Se il risultato del test per H. pylori è positivo, la macchina avvierà automaticamente i test di resistenza ai farmaci sul campione. Sostituire il kit di reagenti con reagenti di rilevamento per le mutazioni del gene 23S rRNA e del gene gyrA nel kit H. Pylori (qPCR).
      NOTA: Il kit di reagenti (reagenti di rilevamento per il gene 23S rRNA e mutazioni del gene gyrA in Helicobacter pylori [qPCR]) include la miscela di reazione PCR (premiscela di reazione genotipizzante [contenente l'enzima Taq, desossiribonucleoside trifosfato, tampone di reazione, cloruro di magnesio], primer e sonde). Tutti i prodotti di controllo qualità negativi sono acqua sterile e purificata. Il prodotto di controllo qualità positivo nel kit di rilevamento dell'acido nucleico di H. pylori è costituito da perle standard di H. pylori inattivate (ATCC 43504). I prodotti di controllo della qualità H. pylori-positivi e deboli positivi nel kit (reagenti di rilevamento per il gene 23S rRNA e mutazioni del gene gyrA in H. pylori) sono il DNA del ceppo inattivato di H. pylori contenente il gene bersaglio e il gene mutante. Allo stesso modo, in base alla situazione reale, tutti gli standard diagnostici, compresa la presenza di infezione da H. pylori o la resistenza ai farmaci, sono impostati su CT ≤ 35 e hanno una tipica curva a forma di S. La concentrazione del controllo di qualità debole è 1,0 x 10³ copie / ml, mentre la concentrazione del controllo di qualità forte è 1,0 x 10⁸ copie / mL.

Rilevazione dell'infezione da H. pylori e della resistenza agli antibiotici nel liquido dello stomaco mediante qPCR
Abbiamo eseguito qPCR per la rilevazione dell'infezione da H. pylori amplificando il gene ureA e determinato il suo profilo di resistenza agli antibiotici prendendo di mira le mutazioni puntiformi nel gene 23S rRNA e nel gene gyrA (Tabella 1). I valori CT di controllo di qualità in tutti e tre i gruppi degli esperimenti qPCR erano all'interno dell'intervallo raccomandato, indicando che i campioni erano tutti in uno stato normale al momento dell'esperimento e che i risultati del test erano affidabili. In questo studio, sono stati selezionati cinque campioni con risultati di test diversi (S1-S5) per caratterizzare l'affidabilità del protocollo sperimentale. S1 rappresenta un ceppo rappresentativo di H. pylori senza infezione, mentre i campioni S2-S5 sono quelli infetti da H. pylori con risultati di resistenza diversi (Figura 1). Abbiamo impostato il sistema per non eseguire ulteriori test di resistenza con i campioni non infetti da H. pylori, quindi il campione S1 non è entrato nel test di resistenza dopo che il test del sistema ha mostrato un risultato negativo per H. pylori. In termini di campioni positivi per l'infezione da H. pylori, i valori CT S2 erano tutti all'interno dell'intervallo di rilevamento, indicando che il campione era H. pylori-positivo e mostrava una doppia resistenza alla claritromicina e alla levofloxacina, e ai medici è stato raccomandato di scegliere altri metodi per il trattamento a loro discrezione. I valori di TC S3 erano all'interno dell'intervallo di rilevamento per l'infezione da H. pylori e il test di resistenza alla levofloxacina, mentre nessun valore CT è stato rilevato nel test di resistenza alla claritromicina, indicando che il campione S3 proveniva da un paziente resistente alla levofloxacina. Allo stesso modo, il valore CT del campione S4 era all'interno dell'intervallo di rilevamento per l'infezione da H. pylori e la resistenza alla claritromicina, mentre nessun valore CT è stato rilevato per la resistenza alla levofloxacina, indicando che questo paziente era resistente alla claritromicina, ed è stato raccomandato di assumere levofloxacina per il trattamento. Infine, il test del campione S5 ha mostrato valori CT all'interno dell'intervallo di rilevamento solo per il rilevamento dell'infezione da H. pylori, indicando che questo paziente era sensibile a entrambi gli antibiotici e poteva essere trattato con uno dei due farmaci. Rispetto al metodo di coltura batterica, che rileva anche l'infezione da H. pylori e la resistenza ai farmaci, questo metodo è sicuro ed efficace nel rilevare l'infezione da H. pylori e la resistenza ai farmaci senza causare danni al paziente e può essere utilizzato per guidare il medico nella formulazione di un piano di trattamento appropriato.

Figura 1: Rilevazione di H. pylori e della sua resistenza agli antibiotici nel liquido dello stomaco mediante qPCR.
(A) Amplificazione PCR quantitativa dell'infezione da H. pylori , (B) rilevazione della resistenza alla claritromicina e (C) rilevazione della resistenza alla levofloxacina. "S" sta per campione. "S1" è un campione che è risultato negativo per l'infezione da H. pylori ed è stato anche testato per la resistenza agli antibiotici; "S2" è un campione infetto da H. pylori con resistenza sia alla claritromicina che alla levofloxacina; "S3" è anche un campione positivo a H. pylori, ma è sensibile alla claritromicina e resistente alla levofloxacina; "S4" è anche un campione positivo a H. pylori, ma è resistente alla claritromicina e sensibile alla levofloxacina; "S5" è un campione positivo a H. pylori, ma è suscettibile sia alla claritromicina che alla levofloxacina. La concentrazione del controllo di qualità debole è 1,0 x 103 copie / ml, mentre la concentrazione del controllo di qualità forte è 1,0 x 108 copie / mL. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Tabella 1: Tabella che mostra i risultati della qPCR del rilevamento dell'infezione da H. pylori e della resistenza alla claritromicina e alla levofloxacina. Questa tabella presenta i risultati qualitativi per l'infezione da H. pylori , la rilevazione di mutazioni del gene rRNA 23S che mostrano che l'isolato è resistente alla claritromicina e la rilevazione di mutazioni del gene gyrA che mostrano che l'isolato è resistente alla levofloxacina. +/−, risultato qualitativo; +, risultato positivo; −, risultato negativo.

Nessuno.