Qui, presentiamo un protocollo per innestare organoidi cerebrali umani in più stadi di maturazione nella membrana corioallantoica (CAM) del pulcino. Gli organoidi cerebrali sono stati coltivati seguendo protocolli standardizzati non guidati.
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Articolo metodologico
Modellazione precoce della nicchia neurovascolare dell'organoide umano non guidato nella membrana corioallantoica dell'embrione permissivo del pulcino
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'innesto di organoidi in tessuti vascolarizzati in animali modello, come la membrana corioallantoica (CAM) immunodeficiente di topo o di embrione di pulcino, si è dimostrata efficace per la modellizzazione della neovascolarizzazione. La CAM è una membrana extraembrionale riccamente vascolarizzata, che mostra una limitata immunoreattività, diventando così un eccellente modello di hosting per trapianti di cellule di origine umana.
Questo articolo descrive la strategia per innestare organoidi cerebrali umani differenziati a più stadi di maturazione nella CAM. La composizione cellulare degli organoidi cerebrali cambia nel tempo, riflettendo le pietre miliari dello sviluppo del cervello umano. Abbiamo innestato organoidi cerebrali nelle fasi di maturazione rilevanti: espansione neuroepiteliale (18 DIV), neurogenesi precoce (60 DIV) e gliogenesi precoce (180 DIV) nella CAM di embrioni di pollo del giorno embrionale (E)7. Gli organoidi cerebrali trapiantati sono stati raccolti 5 giorni dopo e le loro caratteristiche istologiche sono state analizzate.
Non sono stati rilevati segni istologici di neovascolarizzazione negli organoidi innestati o vasi sanguigni anomali adiacenti agli innesti. Inoltre, sono stati osservati notevoli cambiamenti nella composizione cellulare degli organoidi innestati, vale a dire, un aumento del numero di astrociti gliali fibrillari acidi positivi-reattivi. Tuttavia, i cambiamenti citoarchitettonici dipendevano dallo stadio di maturazione dell'organoide. Complessivamente, questi risultati suggeriscono che gli organoidi cerebrali possono crescere nella CAM e mostrano differenze nella citoarchitettura a seconda del loro stadio di maturazione all'innesto.
Introduzione
Gli organoidi cerebrali umani sono una tecnica emergente che ci permette di ricapitolare lo sviluppo precoce del cervello umano in vitro 1,2,3. Tuttavia, uno dei principali limiti di questo modello è la mancanza di vascolarizzazione, che svolge ruoli indispensabili non solo nell'omeostasi cerebrale ma anche nello sviluppo cerebrale4. Oltre alla fornitura di ossigeno e sostanze nutritive, l'accumulo di prove suggerisce che il sistema vascolare del cervello regola la differenziazione neurale, la migrazione e la sinaptogenesi durante lo sviluppo<....
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Protocollo
Gli embrioni di pollo bianco livornese (Gallus gallus) sono stati trattati seguendo la Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio dell'Institute of Laboratory Animals Resources, Commission of Life Sciences, National Research Council, USA, e gli esperimenti sono stati approvati dal Council for Care and Use of Experiment Animals dell'Università di Barcellona.
1. Preparazione di organoidi cerebrali non guidati
- Mantenere le cellule staminali embrionali umane (hESC) H9 in mTESR1 preriscaldate a temperatura ambiente (RT) sotto una confluenza del 70% in piastre a 6 pozzetti rivestite con Matrigel dis....
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Risultati
Selezione del programma di maturazione dell'embrione per il trapianto
L'esperimento inizia a D0 quando le uova fecondate vengono incubate a 38 °C e al 60% di umidità relativa. La membrana corioallantoica (CAM) è una membrana extraembrionale altamente vascolarizzata che si sviluppa dopo l'incubazione dell'uovo. È formato dalla fusione dell'allantoide e del corion. A D1, dopo 24 ore di incubazione, la camera d'aria viene perforata per evitare che il CAM si attacchi alla membrana del guscio interno. La f.......
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Discussione
In questo studio, descriviamo un protocollo dettagliato con numerosi passaggi chiave che forniscono una crescita e uno sviluppo favorevoli degli organoidi cerebrali umani dopo l'innesto senza perturbare la sopravvivenza degli embrioni di pollo. Si consiglia l'uso di aghi sterili per perforare la camera d'aria dell'uovo dopo 24 ore di incubazione (giorno 1). Inoltre, abbiamo anche provato a fare la puntura al giorno 4 (dopo aver controllato attraverso il guscio d'uovo con la luce per testare lo sviluppo della vascolarizza.......
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Dichiarazioni
Gli autori non segnalano alcun conflitto di interessi.
Ringraziamenti
Ringraziamo il Dott. Alcántara e il Dott. Ortega dell'UB e il resto dei membri del laboratorio del Dott. Acosta per le approfondite discussioni. S.A. è professore assistente presso la Generalitat de Catalunya dell'Universitat de Barcelona.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Anti-TUBB3 [Tuj1], mouse | BioLegend | 801201 | 1:1.000 |
| Anti-GFAP, coniglio | GeneTex | GTX108711 | 1:500 |
| Anti-coniglio AlexaFluor 488, capra. | Invitrogen | A-21206 | 1:1.000 |
| Anti-topo AlexaFluor 594, capra | Jackson ImmunoResearch | 715-585-150 | 1:500 |
| Uova fecondate di pollo bianco livornese (Gallus gallus) | Granja Gibert (Cambrils, Spagna) | ||
| DAPI | Invitrogen | D1306 | 1:10.000 |
| DPX | Sigma | 100579 | mezzo di montaggio a base di xilene |
| Soluzione di dissociazione delicata | CreativeBiolabs | ITS-0622-YT187 | soluzione di dissociazione cellulare |
| Matrigel | BD Biosciences | 356234 | |
| Terreni di montaggio Mowiol 4-88 | Merk | 81381 | |
| Tovagliolo di carta, | Sigma-Aldrich | Z188956 | |
| ROCK di laboratorio Y27632 | Millipore | SCM075 | 10 nM |
| Forbici chirurgiche a punta affilata | VWR | 470106-340 | |
| Vetrini per microscopio ad adesione Superfrost Plus | Epredia | J1800AMNZ |
Riferimenti
- Camp, J. G., et al. Human cerebral organoids recapitulate gene expression programs of fetal neocortex development. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (51), 15672-15677 (2015).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in....
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Ristampe e permessi
