Articolo metodologico

Modellazione precoce della nicchia neurovascolare dell'organoide umano non guidato nella membrana corioallantoica dell'embrione permissivo del pulcino

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DOI:

10.3791/65710

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16 febbraio 2024

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1Instituto de Biología Celular y Neurociencias “Prof. E. De Robertis” (IBCN), CONICET - Universidad de Buenos Aires, 2Facultad de Medicina, Departamento de Biología Celular, Histología, Embriología y Genética, Universidad de Buenos Aires, 3Institute of Neurosciences, Pathology and Experimental Therapeutics Dept, University of Barcelona, 4Functional Neurogenomics Group, Neurodevelopmental Disorders, IDIBELL, L’Hospitalet de Llobregat, 5IBE, Institute of Evolutionary Biology (UPF-CSIC), Department of Medicine and Life Sciences, Universitat Pompeu Fabra, 6Institució Catalana de Recerca i Estudis Avançats (ICREA) and Universitat Pompeu Fabra, 7Center for Genomic Regulation (CRG), The Barcelona Institute of Science and Technology, 8BarcelonaBeta Brain Research Center, Pasqual Maragall Foundation, 9Instituto de Investigación en Biomedicina (IBioBA) – CONICET – Instituto Partner de la Sociedad Max Planck

In questo articolo

Sommario

Qui, presentiamo un protocollo per innestare organoidi cerebrali umani in più stadi di maturazione nella membrana corioallantoica (CAM) del pulcino. Gli organoidi cerebrali sono stati coltivati seguendo protocolli standardizzati non guidati.

Abstract

L'innesto di organoidi in tessuti vascolarizzati in animali modello, come la membrana corioallantoica (CAM) immunodeficiente di topo o di embrione di pulcino, si è dimostrata efficace per la modellizzazione della neovascolarizzazione. La CAM è una membrana extraembrionale riccamente vascolarizzata, che mostra una limitata immunoreattività, diventando così un eccellente modello di hosting per trapianti di cellule di origine umana.

Questo articolo descrive la strategia per innestare organoidi cerebrali umani differenziati a più stadi di maturazione nella CAM. La composizione cellulare degli organoidi cerebrali cambia nel tempo, riflettendo le pietre miliari dello sviluppo del cervello umano. Abbiamo innestato organoidi cerebrali nelle fasi di maturazione rilevanti: espansione neuroepiteliale (18 DIV), neurogenesi precoce (60 DIV) e gliogenesi precoce (180 DIV) nella CAM di embrioni di pollo del giorno embrionale (E)7. Gli organoidi cerebrali trapiantati sono stati raccolti 5 giorni dopo e le loro caratteristiche istologiche sono state analizzate.

Non sono stati rilevati segni istologici di neovascolarizzazione negli organoidi innestati o vasi sanguigni anomali adiacenti agli innesti. Inoltre, sono stati osservati notevoli cambiamenti nella composizione cellulare degli organoidi innestati, vale a dire, un aumento del numero di astrociti gliali fibrillari acidi positivi-reattivi. Tuttavia, i cambiamenti citoarchitettonici dipendevano dallo stadio di maturazione dell'organoide. Complessivamente, questi risultati suggeriscono che gli organoidi cerebrali possono crescere nella CAM e mostrano differenze nella citoarchitettura a seconda del loro stadio di maturazione all'innesto.

Introduzione

Gli organoidi cerebrali umani sono una tecnica emergente che ci permette di ricapitolare lo sviluppo precoce del cervello umano in vitro 1,2,3. Tuttavia, uno dei principali limiti di questo modello è la mancanza di vascolarizzazione, che svolge ruoli indispensabili non solo nell'omeostasi cerebrale ma anche nello sviluppo cerebrale4. Oltre alla fornitura di ossigeno e sostanze nutritive, l'accumulo di prove suggerisce che il sistema vascolare del cervello regola la differenziazione neurale, la migrazione e la sinaptogenesi durante lo sviluppo 5,6. Pertanto, c'è un urgente bisogno di stabilire modelli affidabili in grado di fornire la segnalazione vascolare mancante e la struttura agli organoidi cerebrali, migliorando la complessità della generazione di organoidi cerebrali umani7.

Tra i metodi proposti per la vascolarizzazione, si possono considerare due linee principali: l'innesto di organoidi in un organismo vivente e le tecnologie puramente in vitro che co-coltivano cellule endoteliali e cellule neurali 8,9,10,11,12. Il trapianto intracerebrale nei topi è costoso e richiede molto tempo, il che rende altre tecnologie rilevanti per modelli più semplici. Il test della membrana corioallantoica del pulcino (CAM) è stato ampiamente utilizzato per studiare l'angiogenesi 13,14,15. Nell'ultimo decennio, diversi gruppi hanno innestato con successo diversi tipi di organoidi, tra cui il rene16,17, il cuore18 e gli organoidi tumorali19,20, in CAM. Tuttavia, poco si sa sull'efficacia, la tossicità/rigetto, l'effetto fisiologico e i metodi per innestare organoidi cerebrali umani nella CAM. Un altro aspetto interessante e ancora inesplorato è la formazione di una barriera emato-encefalica chimerica (BBB) tra la CAM e l'interfaccia astrocitaria organoide. Precedenti lavori pionieristici hanno suggerito la fattibilità putativa della generazione di una BBB nella CAM mediante trapianto di astrociti e terreno condizionato da astrociti 21,22,23. Tuttavia, gli astrociti maturi sembrano non essere in grado di raggiungere questo24,25. Pertanto, la formazione indotta dagli astrociti della BBB rimane discutibile e il trapianto di organoidi cerebrali umani ci permetterebbe di far luce su questa controversia.

Questo articolo video descrive un protocollo per un trapianto di organoidi cerebrali umani in OVO in CAM che promuove la crescita, il miglioramento e la vascolarizzazione, ottenendo organoidi che comprendono elementi BBB istologicamente compatibili. Qui, presentiamo un protocollo che garantisce la sopravvivenza dell'embrione di pollo e riportiamo la permissività della CAM per sostenere la crescita degli organoidi cerebrali.

Protocollo

Gli embrioni di pollo bianco livornese (Gallus gallus) sono stati trattati seguendo la Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio dell'Institute of Laboratory Animals Resources, Commission of Life Sciences, National Research Council, USA, e gli esperimenti sono stati approvati dal Council for Care and Use of Experiment Animals dell'Università di Barcellona.

1. Preparazione di organoidi cerebrali non guidati

  1. Mantenere le cellule staminali embrionali umane (hESC) H9 in mTESR1 preriscaldate a temperatura ambiente (RT) sotto una confluenza del 70% in piastre a 6 pozzetti rivestite con Matrigel disciolto in DMEM (1:40) in un incubatore al 5% di CO2 a 37 °C.
    NOTA: Matrigel deve essere conservato in ghiaccio fino al suo utilizzo come rivestimento per prevenirne la polimerizzazione.
  2. Generare organoidi cerebrali seguendo il protocollo cerebrale non guidato 2.
    1. Dissociare le hESC H9 utilizzando 500 μL di soluzione di dissociazione cellulare e incubare per 3-5 minuti a 37 °C. Risospendere in mTESR1 contenente un inibitore ROCK Y27632 (concentrazione finale 50 μM) e seminare 9.000 cellule per pozzetto in una piastra a 96 pozzetti pretrattata a bassa adesione.
    2. Una volta che gli organoidi si sono aggregati in mTESR1 contenente un inibitore ROCK Y27632 (concentrazione finale 50 μM), trasferirli in mezzo di induzione per 5-6 giorni.
    3. Seguendo il protocollo26 degli organoidi cerebrali non guidati, trasferire gli organoidi ai mezzi di induzione neurale a ~ giorni 4-5.
    4. Una volta acquisite le dimensioni e l'anello neuroepitelio, trasferiscili in una goccia di Matrigel ghiacciata. Una volta che il Matrigel è stato polimerizzato, trasferire gli organoidi in una capsula di Petri a bassa adesione di 5 cm con 5 ml di terreno di maturazione preriscaldato.
    5. Dopo 4 giorni, mettere gli organoidi cerebrali sotto agitazione orbitale.
  3. Raccogliere gli organoidi per la raccolta in DPBS freschi immediatamente prima dell'innesto.

2. Mantenimento dell'uovo, attivazione dello sviluppo e puntura del guscio d'uovo

  1. Conservare gli ovuli fecondati (al giorno 0) in un'incubatrice a 18 °C fino al momento dell'uso.
    NOTA: A questa temperatura non si sviluppano, rimanendo allo stesso stadio di maturazione.
  2. Quando necessario per l'uso, incubarli a 38 °C e 60% di umidità relativa con rotazione a dondolo morbido con un angolo di 45 °C.
  3. Il giorno 1, pulisci la superficie del guscio d'uovo con etanolo al 70% e asciugalo con un tovagliolo di carta per sterilizzarlo.
  4. Posizionare una benda adesiva di carta chirurgica, di seguito denominata "benda", sopra l'uovo, coprendo la camera d'aria dell'uovo.
    NOTA: Ciò impedirà alla polvere del guscio d'uovo di cadere nel CAM dove si blocca.
  5. Eseguire la perforazione della camera d'aria, di seguito denominata foro della camera d'aria (ACH), con un ago sterile da 21 G x 11/2'', perforando delicatamente il guscio d'uovo. Aprire l'ACH sulla punta superiore dell'uovo per evitare di disturbare il CAM, che a questo punto giace separato dal guscio.
  6. Per trovare la posizione migliore per forare l'ACH, utilizzare una lampada per determinare la superficie più sottile del guscio d'uovo sulla punta superiore dell'uovo. La trasmissione diretta del fascio di luce indica la posizione migliore per forare.
  7. Coprire l'ACH con una nuova benda per proteggere l'embrione dall'ambiente esterno e rimettere l'ovulo nell'incubatrice.
  8. Da questo momento in poi, cessare la rotazione nell'incubatrice e mantenere le uova in posizione verticale con la finestra in alto.
    NOTA: Questo faciliterà lo sviluppo dell'embrione e il CAM diventa disponibile nella parte superiore con una camera d'aria tra l'embrione e il guscio dell'uovo, consentendo il successivo innesto.
  9. Aprire l'ACH dal giorno 1 al giorno 4. La vitalità aumenta il giorno 4 (3 giorni prima del giorno dell'innesto).

3. Innesto di organoidi cerebrali

  1. Eseguire l'innesto il giorno 7 quando la CAM è ben sviluppata e vascolarizzata, coprendo l'ovulo su tutto l'embrione.
  2. Rimuovere la benda e pulire la superficie del guscio d'uovo con etanolo al 70% per sterilizzare il guscio d'uovo, prima di allargare con cura l'ACH in una finestra di innesto.
  3. Posizionare una nuova benda più grande che copra l'estensione oltre la finestra di innesto finale per evitare che frammenti di guscio d'uovo cadano nel CAM durante l'allargamento della finestra di innesto.
    NOTA: Questa finestra più grande è necessaria per selezionare la migliore posizione di innesto e per il successivo innesto.
  4. Ingrandire la finestra di innesto forando delicatamente il guscio d'uovo fino a raggiungere un diametro di circa 2 cm. Rimuovere delicatamente i bordi della finestra del guscio d'uovo con una pinzetta fino a quando la finestra non viene ingrandita. Rimuovere la polvere rimanente e i pezzi di guscio d'uovo che rimarranno attaccati alla benda staccando delicatamente la benda.
  5. Posizionare l'organoide con una pipetta automatica P200. Tagliare le punte con forbici sterili e affilate per allargare l'apertura in base alle dimensioni dell'organoide e prevenire danni all'organoide o utilizzare punte sterili di trasferimento di ampio calibro. Raccogliere l'organoide in un volume massimo di 50 μL di PBS e trasferirlo direttamente nel CAM, su un lato opposto alla posizione dell'embrione.
  6. Assicurarsi che la posizione dell'innesto sia distante dal tuorlo per evitarne la rottura durante la raccolta e, preferibilmente, posizionarlo vicino a un vaso sanguigno.
  7. Posizionare una goccia di 7 μL di Matrigel intorno all'organoide dopo aver posizionato l'organoide sul CAM.
    NOTA: Ciò impedirà all'organoide di muoversi intorno alla membrana.
  8. Chiudere la finestra utilizzando un piccolo pezzo di parafilm adatto alle dimensioni esatte della finestra e fissarlo al guscio con una benda adesiva.
    NOTA: È importante coprire completamente la finestra con il parafilm per evitare che l'embrione si secchi e consentire lo scambio di gas. Delimitare adeguatamente l'estensione della copertura della finestra, evitando di superare la finestra, in quanto potrebbe ostacolare lo scambio gassoso necessario per il corretto sviluppo dell'embrione27.

4. Raccolta di organoidi trapiantati

  1. Raccogliere gli organoidi innestati e il CAM circostante il 12° giorno di sviluppo del pollo, corrispondente a 38 Hamburger e Hamilton stadio di sviluppo (HH38)28, 5 giorni dopo l'innesto. In questa fase, la CAM è completamente differenziata con la vascolarizzazione matura mentre i germi delle piume coprono le ali e la palpebra superiore dell'embrione.
  2. Dopo aver rimosso la benda adesiva, allargare ulteriormente la finestra per facilitare la raccolta del campione utilizzando forbici e pinzette sottili.
  3. Visualizzare l'organoide con l'aiuto di una microscopia di dissezione binoculare, se necessario, seguita da una fase di prefissazione di 2 minuti con paraformaldeide (PFA) al 4% per aiutare la raccolta di organoidi e CAM.
  4. Raccogli una sezione di 1,5 cm2 del CAM contenente l'organoide.
  5. Fissaggio del campione
    1. Lavare i campioni con 1x PBS e fissarli con PFA al 4% (in PBS, pH 7,2) per 30 minuti a 4 °C. Quindi, lavare i campioni per 3 x 5 minuti in PBS.
    2. Conservare i campioni a 4 °C in PBS con azoturo di sodio o crioproteggerli direttamente in saccarosio-PBS al 30% per una notte a 4 °C.
    3. Dopo la crioprotezione, incorporare i campioni in un composto a temperatura di taglio ottimale (OCT) e conservarli a -20 °C fino al sezionamento. Tagliare fette di tessuto spesse 20 μm utilizzando un criostato e raccoglierle su vetrini xilanizzati. Conservare i vetrini a -20 °C fino a quando non vengono utilizzati per la colorazione.

5. Immunofluorescenza

  1. Rimuovere l'OCT dalle sezioni con una soluzione PBS con Triton X-100 allo 0,1% (PBS-T) per 10 minuti a temperatura ambiente (RT).
  2. Trattare le sezioni con una soluzione bloccante (BS) con una soluzione PBS-T 0,01% di siero d'asina al 2% e al 3% per 1 ora a RT.
  3. Diluire l'anticorpo primario selezionato (vedere la tabella dei materiali) in BS e incubare i campioni per una notte a 4 °C.
  4. Il giorno successivo, lavare i campioni 3 x 10 min in 1x PBS a RT.
  5. Diluire l'anticorpo secondario in BS e incubare per 2 ore a RT (vedere la tabella dei materiali).
  6. Incubare i campioni per 10 minuti con 4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) per marcare i nuclei cellulari a RT, diluito in PBS-T a una diluizione 1:1.000.
  7. Montare le guide con il mezzo di montaggio e coprire con vetrini coprioggetti.
  8. Scatta tutte le immagini utilizzando un microscopio a fluorescenza a campo largo a 2,5, 10, 20 e 40x.
  9. Conservare le fette a 4 °C.

6. Colorazione con ematossilina ed eosina (H&E)

NOTA: Per dimostrare che l'innesto ha funzionato, eseguire la colorazione H&E.

  1. Rimuovere l'OCT con PBS-T 0,1% per 10 minuti a RT.
  2. Eseguire la disidratazione seriale in cappa come segue: 10 min in acqua distillata (DW), 45 s in ematossilina, 1 min in DW, 20 s in PBS, 2 x 30 s in EtOH al 70%, 2 x 30 s in EtOH all'80%, 2 x 30 s in EtOH al 96%, 30 s in eosina, 2 x 15 s in EtOH al 96%, 2 x 15 s in 100% EtOH, 1 min in xilolo-100% ETOH, 1 min in xilolo, 1 min in xilolo (fresco).
  3. Montare i vetrini coprioggetti con un mezzo di montaggio a base di xilene.

Risultati

Selezione del programma di maturazione dell'embrione per il trapianto
L'esperimento inizia a D0 quando le uova fecondate vengono incubate a 38 °C e al 60% di umidità relativa. La membrana corioallantoica (CAM) è una membrana extraembrionale altamente vascolarizzata che si sviluppa dopo l'incubazione dell'uovo. È formato dalla fusione dell'allantoide e del corion. A D1, dopo 24 ore di incubazione, la camera d'aria viene perforata per evitare che il CAM si attacchi alla membrana del guscio interno. La foratura della camera d'aria in D1 migliora la qualità della camera d'aria rispetto alla foratura nelle fasi successive (D4). Il CAM continua a crescere fino a D12 quando avvolge l'intero contenuto dell'uovo e aderisce saldamente alla membrana interna del guscio (Figura 1). Il foro praticato in D7 è allargato per facilitare la raccolta del campione. D7 è il momento ottimale per l'innesto, quando la CAM raggiunge la maturità e copre il sacco vitellino e la superficie dell'embrione. In questa fase, il foro della camera d'aria viene allargato e gli organoidi vengono trasferiti nel CAM con l'aiuto di una pipetta automatica.

Innesto di organoidi cerebrali
Durante la maturazione intrinseca degli organoidi cerebrali in vitro, la loro composizione cellulare cambia da progenitori neurali a neuroni maturi e cellule gliali. La neurovascolarizzazione e la neurogenesi sono processi di sviluppo intrecciati e interdipendenti nei vertebrati e la segnalazione che porta a questo crosstalk dipende fortemente dallo stadio di maturazione della controparte neurale29. I progenitori neurali sono la principale fonte di fattori proangiogenici nel cervello in via di sviluppo 29,30. Al contrario, neuroni e astrociti supportano la neoangiogenesi negli stadi maturi e nell'età adulta attraverso la secrezione del fattore di crescita dell'endotelio vascolare31,32. Questi cambiamenti nella citoarchitettura cerebrale, che si riflettono anche negli organoidi cerebrali, potrebbero portare a cambiamenti differenziali nell'integrazione e nella risposta all'innesto di CAM, a seconda dello stadio di maturazione degli organoidi cerebrali. Pertanto, abbiamo innestato organoidi cerebrali al 13° giorno di differenziazione in vitro (DIV), quando le cellule neuroepiteliali e la glia radiale si espandono; a DIV 37, all'inizio della neurogenesi; a DIV 60, quando la neurogenesi è robusta e neuroni di identità diverse sono terminalmente differenziati; e a DIV 120, quando una pletora di neuroni maturi popola l'organoide, generando una rete neuronale ben sviluppata e anche l'astrogenesi è diffusa.

In tutti i casi, i campioni sono stati raccolti dopo 5 giorni di incubazione in ovo (DIO). Per evitare distorsioni dovute all'effetto batch negli organoidi cerebrali, tutti i confronti tra organoidi trapiantati e non trapiantati sono stati eseguiti nello stesso lotto in modo a coppie. Gli organoidi sono stati derivati da almeno due esperimenti indipendenti per punto temporale e un totale di sei differenziazioni indipendenti. L'innesto di più stadi di maturazione è stato eseguito in parallelo in ogni esperimento di innesto. Dopo l'innesto, gli organoidi hanno continuato il processo di maturazione adiacente ai vasi CAM senza alcuna evidenza di infiltrazione di vasi sanguigni nell'organoide (Figura 2).

La sopravvivenza degli organoidi all'innesto varia dall'80% negli organoidi più giovani e scende a ~66% negli organoidi maturi dopo 5 giorni dall'innesto, suggerendo che la permissività e la plasticità dell'innesto di organoidi potrebbero cambiare nel tempo (Tabella 1). La vitalità degli organoidi è stata determinata dalla presenza di nuclei picnotici nelle colorazioni H&E. Il numero di nuclei picnotici era simile tra gli organoidi di controllo trapiantati e non trapiantati (Figura 3), suggerendo che la CAM è permissiva per sostenere l'organoide vivo dopo il trapianto. Inoltre, non è stato rilevato alcun rilascio istologico o emogenico al CAM e gli embrioni rimangono vivi, suggerendo che né la procedura di innesto né l'organoide interrompono l'integrità del CAM o influenzano in modo significativo lo sviluppo embrionale.

Composizione cellulare in organoidi cerebrali trapiantati
Gli organoidi cerebrali non guidati hanno una marcata variabilità cellulare inter- e intraorganoide. Tuttavia, sono prevalentemente neurali, generando onde di progenitori, neuroni e astrociti a un ritmo sequenziale 2,26. Successivamente, abbiamo valutato se l'innesto altera la composizione neurale negli organoidi cerebrali. Gli organoidi più giovani (13 DIV + 5 DIO: 18 giorni) non mostrano differenze rispetto ai loro organoidi di controllo non innestati in presenza di neuroni (TUBB3+). Nelle fasi di maturazione successive (60 DIV +5 DIO: 65 giorni e 120 DIV + 5 DIO: 125 giorni), la proporzione di neuroni (TUBB3+) è drasticamente diminuita rispetto a quella degli organoidi non innestati (Figura 4). Negli organoidi non innestati maturati per 60 DIV, i neuroni sono ampiamente diffusi intorno agli organoidi.

In particolare, il numero e la localizzazione degli astrociti gliali fibrillari acidic protein-positive (GFAP+) hanno evidenziato un aumento rispetto a quelli osservati nei controlli non trapiantati. Inoltre, questi astrociti GFAP+ hanno acquisito una localizzazione inaspettata nella parte esterna dell'organoide. In 18 DIV, organoidi liberi (non innestati), si possono vedere pochi astrociti e non è stato possibile rilevare alcuna distribuzione strutturale; al contrario, appaiono distribuiti in modo omogeneo in tutto l'organoide (Figura 3).

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Figura 1: Cronologia della configurazione del test CAM per il trapianto di organoidi. (A) Applicazione di bendaggio adesivo in carta chirurgica sulla parte superiore dell'ovulo. (B) Fare un foro nel guscio con un ago sopra la benda adesiva. (C) Aprire la finestra del guscio d'uovo, vista dall'alto, pronto per il trapianto di un (D) organoide cerebrale umano (giorno 60). Barra di scala = 100 μm. (E) Visualizzazione dell'organoide innestato al CAM dopo 5 giorni di incubazione in ovo . (F) Segni distintivi dello sviluppo degli organoidi cerebrali dal giorno 0 al giorno 120. La freccia indica la posizione dell'organoide. Abbreviazione: CAM = membrana corioallantoica. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 2: Colorazione dell'ematossilina e dell'eosina di organoidi innestati nella membrana corioallantoica. (A) 13 DIV + 5 DIO organoidi; (B) 37 DIV + 5 DIO organoidi; (C) 60 DIV + 5 DIO organoidi; e (D) 120 DIV + 5 DIO organoidi; I quadrati rossi segnano l'organoide. Barra della scala = 500 μm. Abbreviazioni: DIV = giorno in vitro; DIO = giorno in ovo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 3: Immunocitochimica degli organoidi a diversi stadi di sviluppo. GFAP è stato utilizzato per la colorazione e DAPI per i nuclei. Barra della scala = 100 μm. (A,B) Immagini dello stesso organoide innestato 13 DIV + 5 DIO in cui gli astrociti sono visti intorno al bordo dell'organoide. (C) Immagine di 18 organoidi liberi DIV in cui gli astrociti sono appena visibili. La differenza tra organoidi liberi e innestati è molto evidente. (D,E) Immagini di 37 organoidi innestati DIV + 5 DIO in cui si possono vedere pochi astrociti. (F) Immagine di 42 DIV organoid libero. Le frecce gialle indicano la posizione degli astrociti. Abbreviazioni: DIV = giorno in vitro; DIO = giorno in ovo; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindolo; GFAP = proteina acida fibrillare gliale. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-4
Figura 4: Immunocitochimica di 120 organoidi DIV. TUBB3 è stato utilizzato per colorare i neuroni e DAPI per i nuclei. Barra della scala = 100 μm; le immagini sono state scattate a 20x. (A) Un organoide innestato da 120 DIV +5 DIO in cui si possono vedere pochi neuroni. (B) Un organoide libero da 125 DIV con abbondanza di neuroni. L'asterisco indica la posizione dell'organoide mentre la linea tratteggiata rappresenta il limite tra l'organoide e la CAM (determinato dall'analisi istologica). Abbreviazioni: DIV = giorno in vitro; DIO = giorno in ovo; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindolo; CAM = membrana corioallantoica. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Organoidi13 DIV37 DIV60 DIV120 DIV
Vivo6 (75%)10 (83%)6 (66%)6 (66%)
Morto2 (25%)2 (16%)3 (34%)3 (34%)

Tabella 1: Tassi di sopravvivenza embrionale dopo innesto di organoidi CAM. Abbreviazioni: DIV = giorno in vitro; DIO = giorno in ovo; CAM = membrana corioallantoica.

Discussione

In questo studio, descriviamo un protocollo dettagliato con numerosi passaggi chiave che forniscono una crescita e uno sviluppo favorevoli degli organoidi cerebrali umani dopo l'innesto senza perturbare la sopravvivenza degli embrioni di pollo. Si consiglia l'uso di aghi sterili per perforare la camera d'aria dell'uovo dopo 24 ore di incubazione (giorno 1). Inoltre, abbiamo anche provato a fare la puntura al giorno 4 (dopo aver controllato attraverso il guscio d'uovo con la luce per testare lo sviluppo della vascolarizzazione per essere sicuri che stavamo lavorando solo con embrioni sani). Tuttavia, ciò ha comportato un declino della vitalità embrionale a causa della vicinanza dei vasi CAM al guscio dell'uovo. Va notato che l'applicazione di troppa forza può provocare la rottura del guscio d'uovo con il conseguente danneggiamento della vascolarizzazione CAM. L'uso di una sorgente luminosa per rilevare le aree assottigliate del guscio dell'uovo è stato utile per fare fori smussati e contemporaneamente prevenire la penetrazione eccessiva e il passaggio attraverso l'uovo, portando all'invasione del CAM.

Anche se la rotazione delle uova sembra obbligatoria per il corretto sviluppo degli embrioni di pollo durante l'incubazione, è necessario evitarla dopo aver perforato la camera d'aria. La rimozione dell'albumina non era giustificata per questo modello, né lo era l'aggiunta di PBS per evitare la disidratazione dell'ovulo. Inoltre, l'uso di una soluzione di etanolo al 70% deve essere fatto con saggezza, con particolare attenzione ad asciugare la soluzione di etanolo rimanente sul guscio per preservare la vitalità embrionale. Un altro punto critico è la dimensione del foro del guscio d'uovo utilizzato per l'attecchimento, che richiede l'equilibratura del foro più piccolo possibile che consenta il comfort della manipolazione dell'innesto. La selezione dello stadio embrionale per gli innesti (E7) è stata guidata dallo stadio di maturazione del CAM e dalla sua relativa dimensione, favorendo l'integrazione del trapianto. Tuttavia, nell'eventuale caso in cui gli organoidi trapiantati richiedano una maturazione ovoidale più lunga, l'innesto può essere eseguito al giorno E5.5/6. La variabilità degli organoidi cerebrali è controllata per garantire la vitalità sperimentale. Gli organoidi della stessa età presentano dimensioni simili ed è importante notare che, indipendentemente dall'età degli organoidi, sono stati tutti incubati per 5 giorni dopo il trapianto. Inoltre, per coerenza, gli organoidi di controllo sono stati scelti meticolosamente per corrispondere alle dimensioni esatte delle loro controparti innestate. Un altro aspetto tecnico, rilevante per sostenere la sopravvivenza sia degli organoidi innestati che dell'embrione, è la chiusura del foro di innesto con un pezzo quadrato di parafilm, per mantenere un ambiente ovo controllato.

Contrariamente alle nostre ipotesi iniziali, gli organoidi giovani sono sopravvissuti meglio dopo il processo di innesto e l'integrazione CAM rispetto a quelli più vecchi. Abbiamo ipotizzato che gli organoidi più giovani siano più plastici a causa della loro presenza arricchita nei progenitori in fase iniziale33, mentre i neuroni maturi richiedono un ambiente neuronale permissivo per il loro mantenimento. Inoltre, sono stati rilevati cambiamenti citoarchitettonici nei primi innesti di organoidi cerebrali (D18) nella distribuzione degli astrociti. In particolare, abbiamo rilevato che gli astrociti si differenziano in questa fase iniziale solo quando vengono innestati e si distribuiscono per generare una pseudo-capsula sotto la superficie dell'organoide. Questa struttura potrebbe essere una reminiscenza del potenziale dell'organoide di generare un'interfaccia neurovascolare che potrebbe imitare la BBB. In alternativa, l'aumentata reattività degli astrociti, posizionati in una struttura simile a una barriera, potrebbe essere indicativa di una risposta immunogenica dell'organoide alla segnalazione secreta dalla CAM. Tuttavia, sono necessari ulteriori studi per dimostrare questa ipotesi. In sintesi, questo articolo descrive i passaggi per innestare organoidi di più stadi di sviluppo nella CAM del pollo, essendo una situazione più permissiva per gli organoidi a sviluppo precoce, e l'effetto cellulare di questi innesti nei neuroni e nella GFAP.

Dichiarazioni

Gli autori non segnalano alcun conflitto di interessi.

Ringraziamenti

Ringraziamo il Dott. Alcántara e il Dott. Ortega dell'UB e il resto dei membri del laboratorio del Dott. Acosta per le approfondite discussioni. S.A. è professore assistente presso la Generalitat de Catalunya dell'Universitat de Barcelona.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Anti-TUBB3 [Tuj1], mouse BioLegend8012011:1.000
Anti-GFAP, coniglioGeneTexGTX1087111:500
Anti-coniglio AlexaFluor 488, capra.InvitrogenA-212061:1.000
Anti-topo AlexaFluor 594, capraJackson ImmunoResearch715-585-1501:500
Uova fecondate di pollo bianco livornese (Gallus gallus)Granja Gibert (Cambrils, Spagna)
DAPIInvitrogenD13061:10.000
DPXSigma100579mezzo di montaggio a base di xilene 
Soluzione di dissociazione delicataCreativeBiolabsITS-0622-YT187soluzione di dissociazione cellulare
MatrigelBD Biosciences356234
Terreni di montaggio Mowiol 4-88Merk81381
Tovagliolo di carta,Sigma-AldrichZ188956
ROCK di laboratorio Y27632MilliporeSCM07510 nM
Forbici chirurgiche a punta affilataVWR470106-340
Vetrini per microscopio ad adesione Superfrost PlusEprediaJ1800AMNZ
inibitore

Riferimenti

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